全 文 ：第 38卷 第 2期 海 洋 与 湖 沼 Vol.38, No.2
2 0 0 7 年 3 月 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA Mar., 2007

* 国家 863高新技术项目, 2004AA62808号; 江苏省高新技术产业化项目, 02KJA360002号。郑维发, 教授, 通讯作
者, E-mail: yyzw@xznu.edu.cn
收稿日期: 2005-10-25; 收修改稿日期: 2006-05-30
四种营养盐对舟形藻(Navicula)BT001
生长速率的影响*
郑维发 1 王雪梅 1 王义琴 2 储成才 2
(1. 徐州师范大学 江苏省药用植物生物技术重点实验室 徐州 221116;
2. 中国科学院遗传与发育研究所 北京 100101)
提要 以 I.A.M.收集的培养基Ⅱ为基本培养基, 采用单因子和 L16(45)正交设计法, 进行了
舟形藻 BT001 对 N、P、Fe、Si 四种营养盐最适需求的研究, 并在此基础上, 研究了尿素对
正交优化组合的影响以及以尿素作为氮源对正交优化组合的影响。结果表明, N、P、Fe、Si
四种营养盐最佳单因子水平为: KNO3, 300mg/L; Na2HPO4·12H2O, 40mg/L; FeCl3, 4mg/L;
Na2SiO3·9H2O, 200mg/L。四种营养盐正交组合水平为: KNO3, 150mg/L; Na2HPO4·12H2O,
40mg/L; FeCl3, 4mg/L; Na2SiO3·9H2O, 200mg/L。在正交组合水平基础上 , 添加 16mg/L
CO(NH2)2, 可更好的促进该藻的生长和繁殖。在 8 天的培养中, 最大细胞相对生长率可达
0.1577。在等摩尔氮源的条件下, 以 CO(NH2)2 代替正交优化水平组合中的 KNO3 对舟形藻
BT001进行 11天的培养。结果表明, 以 CO(NH2)2为氮源的藻细胞最大生长密度可达 2.69×
105cell/ml, 明显地高于硝酸钾作为氮源培养的藻细胞密度。
关键词 舟形藻 BT001, 营养盐, 正交实验, 优化组合水平
中图分类号 Q949.270.5
底栖硅藻常被用作鲍、刺参等经济海产动物
幼体的主要开口饵料, 其中舟形藻是贝类养殖中
作为开口饵料的常见单胞藻类(Daume et al, 1999,
2004; Najmudeen et al, 2004; Ricardo et al, 2003;
Brown et al, 1997)。该藻株在生长过程中向培养
基质分泌大量的硫酸化多糖。现代药理学认为,
硫酸化多糖具有多种生物活性, 不仅可以作为广
谱免疫促进剂, 具有免疫调节功能, 还可以抗感
染、抗放射、抗凝血、降血糖、预防和治疗肿瘤、
艾滋病等多种疾病(Schaeffer et al, 2000; Siddanta
et al, 1999; Noda et al, 1999; Leung et al, 1997)。
GC-MS 分析结果表明, 该舟形藻富含多不饱和
脂肪酸 ( P U F A ) , 其中含 g a m m a -亚麻酸
(GLA)7.55%、二十碳五烯酸(EPA)21.52%、二十
二碳六烯酸(DHA)3.64%。GLA、EPA、DHA 对
心血管疾病、高血脂症、肿瘤、炎症、抑郁症等
均有显著的预防作用(Gill et al, 1997)。EPA还是
鲍生长发育的必不可少的营养物质之一(Kangsen
et al, 1996)。因此, 该舟形藻不仅是贝类等水产动
物理想的开口饵料, 也是一种具有潜在药学价值
的海洋生物制药原料。研究表明, N、P、Fe、Si
四种营养成分是影响硅藻生长的重要因子, 不同
的硅藻对 N、P、Fe、Si 等营养元素的需求有很
大差异(李雅娟等, 1998; Wang et al, 1999; 梁英
等, 1999; 马志珍等, 1996)。为了探索适合舟形藻
BT001 生长的培养基, 作者在 I.A.M.收集的培养
基Ⅱ基础上, 开展了 N、P、Fe、Si四种营养元素
对舟形藻 BT001生长影响, 并对这四种营养元素
进行多因子组合实验, 探索适合舟形藻 BT001高
密度生长的培养基。
158 海 洋 与 湖 沼 38卷
1 材料与方法
1.1 藻株来源
作者于 2003 年在烟台海域分离得到一株舟
形藻, 命名为舟形藻 BT001(Navicula BT001)。
1.2 主要试剂及仪器
硝酸钾 (KNO 3 ) , 磷酸氢二钠 (Na 2 HPO 4·
12H2O), 三 氯 化 铁 (FeCl3·6H2O), 硅 酸 钠
(Na2SiO3·9H2O) (分析纯, 上海试剂一厂), 光照
培养箱 GC-300(上海一恒科技有限公司)。
1.3 舟形藻 BT001 培养环境条件
参考马志珍等(1996)和 Leandro等(2003), 以
I.A.M.收集的培养基Ⅱ将舟形藻 BT001 在光强
5800 lx、光暗周期 12h : 12h、温度(24±1)℃的环
境下静止培养, 每天振摇 3次。
1.4 生长速率的测定
舟形藻 BT001 的相对生长速率按公式 K =
(lgN－lgN0)/T计算, 式中 N为经过 T时间培养后
单位体积的藻细胞数, N0为 T 培养时间开始时单
位体积藻细胞数, T为培养时间(天)。以血球记数
板统计单位体积藻细胞的数量。
1.5 N、P、Fe、Si 四因素单因子实验
舟形藻 BT001在接种前一天换上不加 N、P、
Fe、Si营养盐的 I.A.M.收集的培养基Ⅱ。培养 24h
后分为 KNO3组、Na2HPO4·12H2O 组、FeCl3组
和 Na2SiO3·9H2O组。其中 KNO3组按 0、75、150、
300 和 600mg/L 的 浓 度 梯 度 加 入 KNO3;
Na2HPO4·12H2O组按 0、20、40和 80mg/L梯度
加入 Na2HPO4·12H2O; FeCl3组按 0、1、2、4和
8mg/L加入 FeCl3; Na2SiO3·9H2O组按 50、100、
200和 400mg/L加入 Na2SiO4·9H2O。每组重复 3
次。每天检测单位体积藻细胞的数量, 分别观察
N、P、Fe、Si水平对该藻生长的影响。
1.6 N、P、Fe、Si 四因素正交实验
舟形藻 BT001在接种前一天换上不加 N、P、
Fe、Si营养盐的 I.A.M.收集的培养基Ⅱ。培养 24h
后分别加入: (A) 75、150、300和 600mg/L四个
水平的 KNO3; (B) 20、40、80和 160mg/L四个水
平的 Na2HPO4·12H2O; (C) 1、2、4和 8mg/L四
个水平的 FeCl3; (D) 50、100、200 和 400mg/L四
个水平的 Na2SiO3·9H2O。参照 Wang 等(1999)
和梁英等(1999)选用 L16(45)设计, 进行上述四种
营养盐因子对该舟形藻生长影响的正交实验。
1.7 尿素对正交实验结果的优化
在四种营养盐正交优化组合的培养液中, 分
别添加浓度为 0、4 、8、12、16和 20mg/L的尿
素, 在方法 1.3 所述的条件下对该舟形藻作 8 天
培养。每天测定生长速率, 第 9天收集藻细胞, 冷
冻干燥后测定生物量。同时, 以尿素代替四种营
养盐正交优化组合培养基中的 KNO3, 在方法 1.3
所述的条件下对该舟形藻作 12 天的培养, 每天
测定细胞密度并于第 13 天收集藻细胞, 冷冻干
燥后测定生物量。
2 结果
2.1 N、P、Fe、Si 四因素单因子实验
氮在细胞代谢中是形成氨基酸、嘌呤、氨基
糖和胺类化合物的基本元素(Seppala et al, 1999)。
微藻可以利用的氮源范围较广, 可以有效利用的
氮源有硝酸盐、铵盐或尿素等, 其中无机氮源以
硝酸钾和硝酸钠最常用。作者以KNO3为氮源, 考
察了不同浓度的 KNO3 对舟形藻生长的影响。
KNO3浓度在 0—300mg/L范围内对舟形藻的生长
具有明显的促进作用 ; 当 KNO3 浓度大于
300mg/L 时, 舟形藻 BT001的生长呈现明显的下
降趋势(表 1)。
磷在生物体内是合成 ATP、GTP、核酸、磷
脂、辅酶等化合物的基本元素 (Seppala et al ,
1999)。海水单细胞藻类培养液最常用无机磷为磷
酸氢二钾和磷酸氢二钠。作者以 Na2HPO4·12H2O
为磷源, 考察了不同浓度的 Na2HPO4·12H2O 对

表 1 四种单因子的不同水平对舟形藻 BT001相对生长率的影响
Tab. 1 Individual effect of 4 factors on growth of Navicula BT001
营养盐 水平 1 水平 2 水平 3 水平 4 水平 5
KNO3 0.039 0.056 0.063 0.074 0.056
Na2HPO4·12H2O 0.031 0.039 0.043 0.039 —
FeCl3 0.036 0.097 0.116 0.153 0.111
Na2SiO3·9H2O 0.039 0.078 0.080 0.057 —
注: KNO3的 5水平分别为 0、75、150、300和 600mg/L; Na2HPO4·12H2O的 4个水平分别为 0、20、40和 80mg/L;
FeCl3的 5个水平分别为 0、1、2、4和 8mg/L; Na2SiO3·9H2O的 4个水平分别为 50、100、200和 400mg/L
2期 郑维发等: 四种营养盐对舟形藻(Navicula)BT001生长速率的影响 159
该舟形藻的生长情况。结果表明 , 浓度在 0—
40mg/L 范围内可以较好的促进舟形藻 BT001 的
生长; 当其浓度大于 40mg/L 时, 舟形藻 BT001
的生长受到明显的抑制(表 1)。
铁是藻类生长和氮固定的最重要的痕量元
素。近年来在东太平洋和南大西洋先后进行了“铁
肥试验”, 从船上将二价铁倾入海中 , 果然诱发
出藻类勃发, 生产力增加高达数十倍, 证明了铁
的确是大洋生产力的限制因素 (Coale et al,
1996)。在 Fe单因子实验中, 当 FeCl3浓度在 0—
4mg/L范围时对舟形藻 BT001的生长具有明显的
促进作用 ; 当其浓度大于 4mg/L 时 , 舟形藻
BT001的生长速率呈现明显的下降趋势(表 1)。
硅是硅藻合成细胞壁的必需元素(Wu et al,
2003)。在本实验中, Na2SiO3·9H2O浓度在 50—
200mg/L范围内对舟形藻 BT001的生长具有明显
的促进作用; 当其浓度大于 200mg/L 时, 舟形藻
BT001的生长速率呈现明显的下降趋势(表 1)。
2.2 N、P、Fe、Si 四因子对舟形藻 BT001 生长
速率的影响顺序和优化水平组合
根据表 2 中的极差 R 值, 可以看出四因素的
影响主次顺序为: B＞D＞A＞C。图 2也显示出 B
因素对相对生长率的影响最大。因此该因素为影
响藻细胞生长的主要因素。取主要因素 B的最好
水平, 即第二水平。由于因素 D的第三、第四水
平对相对生长率的影响相差不大, 从节约试剂考
虑, 取其第三水平, 其余因素取最好水平(表 3)。
因此 , 四因素最优水平组合为 : KNO3 浓度为

表 2 四种营养盐对舟形藻 BT001生长的影响正交试验结果
Tab. 2 Results of orthogonal test on 4 mineral nutrients for the growth of Navicula BT001
因素 实验号
A(KNO3) B(Na2HPO4) C(FeCl3) D(Na2SiO3)
相对生长率
K
1 1 1 1 1 0.051224
2 1 2 2 2 0.079713
3 1 3 3 3 0.056235
4 1 4 4 4 0.041217
5 2 1 2 3 0.065276
6 2 2 1 4 0.076831
7 2 3 4 1 0.050507
8 2 4 3 2 0.042913
9 3 1 3 4 0.082628
10 3 2 4 3 0.065509
11 3 3 1 2 0.041356
12 3 4 2 1 0.038337
13 4 1 4 2 0.063621
14 4 2 3 1 0.045295
15 4 3 2 4 0.037848
16 4 4 1 3 0.051073
K1 0.228389 0.262749 0.220485 0.185364
K2 0.235527 0.267348 0.221174 0.227603
K3 0.227830 0.185946 0.227071 0.238092
K4 0.197837 0.17354 0.220854 0.238524
k1 0.057097 0.065687 0.055121 0.046341
k2 0.058882 0.066837 0.055294 0.056901
k3 0.056958 0.046487 0.056768 0.059523
k4 0.049459 0.043385 0.055214 0.059631
R 0.009423 0.023452 0.001647 0.01329

表 3 正交实验中四因素的四个不同水平对舟形藻 BT001 生长速率影响
Tab. 3 Combinational effects of 4 factors on the growth rate of Navicula BT001 in orthogonal test
营养盐 水平 1 水平 2 水平 3 水平 4
KNO3 0.057 0.059 0.056 0.049
Na2HPO4·12H2O 0.065 0.067 0.046 0.043
FeCl3 0.055 0.055 0.057 0.055
Na2SiO3·9H2O 0.046 0.056 0.059 0.059
注: KNO3的 4水平分别为 75、150、300和 600mg/L; Na2HPO4·12H2O的 4个水平分别为 20、40、80和 160mg/L;
FeCl3的 4个水平分别为 1、2、4和 8mg/L; Na2SiO3·9H2O的 4个水平分别为 50、100、200和 400mg/L
160 海 洋 与 湖 沼 38卷
150mg/L、Na2HPO4·12H2O浓度为 40mg/L、FeCl3
浓度为 4mg/L、Na2SiO3·9H2O浓度为 200mg/L。
2.3 舟形藻 BT001 在优化水平组合培养基中生
长情况
在正交实验优化水平组合的培养基中, 舟形
藻 BT001 在接种的第 2 天藻细胞开始分裂, 第 4
天进入对数期。生长速率一直递增到接种后的第
10 天, 最大藻细胞密度达到 2.31×105/ml。与此
相比, I.A.M.收集的培养基 II, 第 6天才进入对数
期 , 第 9 天达最大细胞密度时仅有 1.38×
105/ml(图 1)。由此可见, 舟形藻 BT001在优化水
平组合培养基中生长情况良好。

图 1 舟形藻 BT001在四种营养盐优化水平组合培养基
中的生长情况
Fig. 1 Navicula BT001 growth in the medium containing 4
minerals in the optimal combination
—…—: 四种营养盐优化水平组合培养基;
—●—: I.A.M.收集的培养基 II

2.4 尿素对正交实验培养基中舟形藻 BT001 生
长的影响
在正交优化组合培养基中添加尿素对舟形
藻 BT001 的生长速率和生物量的积累有显著促
进作用。结果表明, 尿素浓度在 4—16mg/L 范围
内可以明显的促进舟形藻 BT001 在正交组合培
养基中的生长速率, 其中添加 16mg/L 的尿素可
使该藻的相对生长速率提高到 0.15774(图 2)。尿
素浓度在 4—16mg/L 范围内还明显增加舟形藻
BT001 生物量的积累, 其中, 尿素浓度在 8mg/L
时, 对生物量积累的促进作用最为显著, 尿素浓
度进一步提高时生物量积累呈下降的趋势(图 3)。
显微镜检显示, 藻细胞在尿素浓度为 8mg/L 以下
时体积较大, 而在 8mg/L 以上时, 藻细胞体积随
尿素浓度的增加而减小。在正交实验培养基中,
以 44.554mg/L 尿素代替正交培养基中 150mg/L

图 2 不同浓度的尿素对正交组合培养基中舟形藻
BT001生长的影响
Fig. 2 Effects on growth rate of Navicula BT001 under
different concentrations of urea


图 3 添加尿素对正交组合培养基中的舟形藻 BT001生
长的影响(n =5, ±SD)
Fig. 3 Effect on biomass accumulation of Navicula BT001
in urea-added medium in orthogonal test (n =5, ±SD)

的硝酸钾(等摩尔 N)对舟形藻 BT001 进行培养,
结果表明, 舟形藻 BT001在以尿素为氮源的正交
组合培养基中的细胞密度第 9天就超过了该藻在
以硝酸钾为氮源的正交组合培养基中的细胞密度
并持续增加到第 11天, 最高藻细胞密度达 2.69×
105/ml, 生物量积累达 722.21mg/L 干物质。而以
硝酸钾为氮源的正交组合培养基细胞密度增长趋
势只持续到第 10 天(图 4), 最高藻细胞密度为
2.31×105/ml, 生物量仅有 450.73mg/L干物质。
3 讨论
底栖硅藻在贝类等水产动物养殖中占有非
常重要的地位, 而舟形藻又是贝类养殖常用的饵
料生物。该舟形藻含有丰富的 gamma-亚麻酸
(GLA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸
(DHA), 不仅对水产动物的生长发育有促进作用,
2期 郑维发等: 四种营养盐对舟形藻(Navicula)BT001生长速率的影响 161

图 4 尿素作为氮源对正交组合培养基中的舟形藻
BT001细胞密度的影响(n = 5, ±SD)
Fig. 4 Effect on cell density of Navicula BT001 in urea-
added medium with different forms of nitrogen in
orthogonal test (n = 5, ±SD)
—…—: 硝酸钾为氮源的优化培养基;
—●—: 尿素为氮源的优化组合培养基

而且为人体必需的不饱和脂肪酸, 在生命活动中
起着重要作用。因此该藻无论是作为水产养殖的
生物饵料还是作为海洋药物资源, 都有很大的开
发潜力。
硅藻的规模培养中, 各营养盐常用的配比为
N　P　Fe　Si = 10　1　0.1　1 (×10−6)。然而天
然水体中的不同营养盐对硅藻的种类及其丰度有
显著影响(Kelly et al, 2004)。为了综合的探讨各营
养因子对舟形藻 BT001 生长的影响以便找到适
合该藻生长的优化培养基, 作者首先从单因子实
验入手, 探讨了 N、P、Fe、Si 单因子对舟形藻
BT001生长的影响, 继而采用正交设计对 N、P、
Fe、Si 四种营养因子进行了综合探讨。在单因子
实验中 N、P、Fe、Si 营养盐的最适浓度分别为
300mg/L、40mg/L、4mg/L、200mg/L。在正交实
验中, 铁、磷和硅营养盐的优化浓度与单因子实
验的结果较吻合 , 分别为 4mg/L、 40mg/L、
200mg/L, 而氮营养盐的最适浓度较单因子实验
低为 150mg/L。正交实验考虑了各因子的交互作
用, 所以正交实验的结果具有更大的可靠性。因
此正交实验优化的培养基十分有利于舟形藻
BT001 的生长。另有研究表明 (Simental et al,
2003), 在培养基中用适当的农业肥料代替无机
盐对某些藻类进行培养, 不仅其效果与无机盐作
用相似, 而且大大节约了生产成本。据此, 作者
在正交实验优化培养基中辅以尿素对该舟形藻进
行培养。结果表明, 添加尿素的藻细胞生长速率
明显高于对照组 , 其中当尿素浓度达到 16mg/L
时最为显著。在 8 天的培养中, 藻细胞密度可达
到 5.483×105cell/ml。在此基础上, 以尿素完全代
替硝酸钾对该舟形藻进行培养。结果显示以尿素
为氮源的最高藻细胞密度明显高于以硝酸钾为氮
源的培养液。提示用尿素作为氮源对该藻进行培
养不仅完全可能, 而且降低了培养成本。由于影
响藻类生长的因素还有很多, 本文中仅以四种营
养盐对舟形藻的生长影响做了探讨。有关其他因
素对该舟形藻生长的影响, 将作进一步的研究。
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Taiwan Estuarine, Coastal Shelf Sci, 58: 155—162
EFFECTS OF DIFFERENT NUTRITIONAL MINERALS ON
THE GROWTH OF NAVICULA BT001
ZHENG Wei-Fa1, WANG Xue-Mei1, WANG Yi-Qin2, CHU Cheng-Cai2
(1. Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plants of Jiangsu Province, Xuzhou Normal University, Xuzhou, 221116;
2. Institute of Genetics & Development, Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100101)
Abstract Marine diatom is one of the primary production contributors in marine ecosystem, and essential
feeding stuff in aquiculture. The benthic species Navicula that usually contain rich polyunsaturated fatty acids are
often used in the first choice to feed young seashells such as abalone. One of Navicula species, named Navicula
BT001 was sampled in Yantai seashore (Shandong, China) and later isolated. This species can excrete large
amount of exopolysaccharides and produce rich gamma-linoleic acid (GLA, 7.55%), ecosapentanoic acid (EPA,
21.52%) and docosahexanoic acid (DHA, 3.64%).
This study aimed to determine the optimal formula of four essential inorganic minerals KNO3, Na2HPO4·
12H2O, FeCl3 and Na2SiO3·9H2O for growth of Navicula BT001 in our culture. The optimal composition and
concentration of the minerals were determined by single-factor test and combinational orthogonal test L16(45).
Navicula BT001 was cultured at the optimal concentration set by orthogonal test. To reduce nitrogen cost, urea
was used as the substitute of KNO3. The effect on diatom growth by urea was evaluated at the optimal
combinations. The results of four single-factor tests showed that the optimal concentration for KNO3 was
300mg/L, for Na2HPO4·12H2O at 40mg/L, FeCl3 at 4mg/L and Na2SiO3·9H2O at 200mg/L. In orthogonal test, the
optimal concentration of the four mineral nutrients was determined at 150mg/L for KNO3, 40mg/L for
Na2HPO4·12H2O, 4mg/L for FeCl3, and 200mg/L for Na2SiO3·9H2O. It can be seen that these results were nearly
the same to those of by single-factor test, except for KNO3, whose optimal concentration was 150mg/L in
orthogonal test. According to the orthogonal test result, the order of impact by the four mineral nutrients on
diatom growth was Na2HPO4·12H2O > Na2SiO3·9H2O > KNO3 > FeCl3. Complete substitution of KNO3 by
CO(NH2)2 in same mole concentration showed clear increase in growth rate and biomass accumulation, suggesting
that urea is an ideal nitrogen source for mass mariculture production of Navicula BT001.
Key words Navicula BT001, Nutrients, Orthogonal test, Optimal combination