全 文 ：山葵提取物对小鼠巨噬细胞的体外活化作用
蒲 　丹 　李为民　徐　丹　陈文彬
四川大学华西医院呼吸内科 (四川 成都 610041)
　　摘要:目的:探讨山葵使巨噬细胞活化的机制。方法:将山葵粉 (头)提取物按 1∶20、 1∶200 、 1∶2000 浓度稀释
后分别加入体外培养的小鼠巨噬细胞中 , 于 6hr、 12hr、 24hr、 36hr 后分别收集细胞培养上清 , 采用 ELISA 方法检测细
胞因子NO、 IL-6、 IL-12 及 TNF-α的含量 。结果:山葵提取物 (浓度≥5mg/ml)作用于小鼠巨噬细胞后 6hr、 12hr、
24hr、 36hr培养上清 NO 的含量显著高于对照组 (P <0.05), 而 IL-6、 IL-12 及 TNF-α的含量与对照组之间无显著差异
(P>0.05)。结论:山葵提取物可使小鼠巨噬细胞大量产生 NO , 而对 IL-6、 IL-12 及 TNF-α影响较小。
　　关键词:山葵提取物　巨噬细胞　细胞因子谱
　　中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1000-3649 (2007)01-0018-03
　　Study on activated mice macrophage with Wasabi Extraction in vitro./ Pu Dan 　Li Weimin　Tao Ran　Xu Dan　Chen
Wenbin.∥Department of pulmonary medicine , West China Hospital , Sichuan University (Chengdu Sichuan 610041 , China)
　　Abstract　Objective:To explore the mechanism of wasabi anticancer by study on activated mice macrophage with WSE.Methods:
Wasabi Extraction was diluted according to 1∶20 , 1∶200 , 1∶2000 and added to mice macrophage respectively in vitro , then after 6hr,
12hr , 24hr , 36hr supernatant fluids were collected to detect the cytokine levels of NO , IL-6 , IL-12 and TNF-αby ELISA.Results:
After 5mg/ml WSE acting on mice macrophage , levels of NO in supernatant fluid have significantly higher than those in control groups
at 6hr 12hr 24hr and 36hr(P <0.05);however there was no significant difference between levels of IL-6 , IL-12 and TNF-αand those
of control groups (P>0.05).Conclusions:These results suggest that WSE may play anticancer roles by NO pathway;yet these was
little effect on levels of IL-6 IL-12 and TNF-α.
　　Key words:Wasabi Extraction(WSE)　Macrophage　Cytokine Spectra
　　山葵 (Wasabi), 又名山嵛菜 , 是加工辛辣调味
酱———芥末的主要原料 , 含有多种生物活性成分 ,
具有抗细菌、 真菌及抑制肿瘤形成、 甚至抗癌作
用[ 1 ,3] , 因而成为人们关注的热点。巨噬细胞分泌的
细胞因子的抗肿瘤作用已日趋明了 , 山葵的抗肿瘤
作用是否通过巨噬细胞起作用 , 目前尚不清楚。本
文试图通过山葵提取物作用于小鼠巨噬细胞 , 观察
巨噬细胞表达的细胞因子谱的变化 , 进而探讨山葵
抗癌作用的分子机制。
1　材料与方法
1.1　材料与试剂　RPMI-1640培养基 、 10%小牛血
清、 双抗 (青、 链霉素)购自GIBCO公司 , DMSO购
自Sigma 公司 , 小鼠巨噬细胞株和山葵粉 (头)提取
物 (批号:03、 07、 11)由本实验室提供 , NO、 IL-
6、 IL-12及TNF-α检测药盒购自上海生物研究所。
1.2　方法　 (1)小鼠巨噬细胞Ana-1的培养:室温
1000rpm离心 8min , 收集 Ana-1细胞 , 加入新鲜 RP-
MI-1640 培养液 , 制备 Ana-1 细胞 悬液 (浓度:
106ml), 采用含 10%小牛血清的 RPMI-1640 培养基
(含青 、 链霉素)、 37℃、 5%CO2 条件下培养小鼠巨
噬细胞 Ana-1。(2)将山葵提取液用生理盐水稀释 10
倍后用0.22μm滤器滤过除菌。进一步用生理盐水作
1∶20 (C1)、 1∶200 (C2)、 1∶2000 (C3)稀释。采用
24孔培养板 , 分别加入Ana-1细胞悬液500μl/孔。实
验组分C1、 C2、 C3三个浓度 , 每种浓度三复孔 , 每
孔加入对应上述三种浓度的山葵提取液 50μl , 对照
组加入 RPMI-1640 培养基 50μl/孔;37℃、 5%CO2继
续培养 , 6hr、 12hr、 24hr、 36hr 后分别室温 3000rpm
离心 10min , 收集细胞培养上清 , 冻存备用。(3)采
用 ELISA法检测细胞培养上清中 NO 、 IL-6 、 IL-12及
TNF-α的含量 , 操作程序按试剂盒说明书进行。
1.3　统计学处理　采用 PEMS3.1统计软件进行样本
均数的方差分析及 q检验。
2　结　果
2.1　山葵处理后不同时间培养基上清液中 NO 的OD
值变化　将Ana-1细胞中加入山葵提取物后 , 其培养
上清中 NO 的含量随药物浓度的增加而增加 , 其中
C1组培养上清液中 NO含量最高 (P<0.05), C2组
次之 , 而 C3组与正常对照无显著差异 (P>0.05)。
见表 1。
表 1　山葵处理后不同时间培养基上清液中 NO的 OD 值变化
组别 6hr 12hr 24hr 36hr
对照组 0.497±0.006 0.528±0.001 0.579±0.008 0.575±0.007
实验组 C1 0.618±0.036 0.656±0.005 0.655±0.015 0.604±0.015
C2 0.508±0.005 0.551±0.011 0.583±0.007 0.558±0.011
C3 0.505±0.006 0.525±0.015 0.573±0.158 0.525±0.015
2.2　山葵处理后不同时间培养基上清液中 IL-6的
OD值变化　见表 2。
　　山葵各组浓度培养基上清液中 IL-6 的含量与对
照组相比 , 无显著差异 (P>0.05)。
2.3　山葵处理后不同时间培养基上清液中 IL-12的
OD值变化　见表 3。
·18· 四　川　中　医Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine 2007 年第 25卷第 1 期Vol.25 , No.1 , 2007　
表 2　山葵处理后不同时间培养基上清液中
IL-6 的 OD 值变化
组别 6hr 12hr 24hr 36hr
对照组 0.103±0.027 0.527±0.032 0.037±0.006 0.034±0.057
实验组 C1 0.104±0.045 0.056±0.011 0.031±0.004 0.024±0.005
C2 0.097±0.019 0.045±0.018 0.040±0.015 0.032±0.004
C3 0.040±0.018 0.039±0.014 0.024±0.006 0.021±0.004
表 3　山葵处理后不同时间培养基上清液中
IL-12 的 OD 值变化
组别 6hr 12hr 24hr 36hr
对照组 0.009±0.006 0.004±0.004 0.013±0.003 0.006±0.007
实验组 C1 0.006±0.003 0.019±0.013 0.009±0.003 0.002±0.002
C2 0.012±0.003 0.008±0.005 0.023±0.016 0.007±0.004
C3 0.009±0.010 0.010±0.009 0.013±0.002 0.029±0.023
　　山葵各组浓度培养基上清液中 IL-12的含量与对
照组相比 , 无显著差异 (P>0.05)。
2.4　山葵处理后不同时间培养基上清液中 TNF-α的
OD值变化　见表 4。
表 4　山葵处理后不同时间培养基上清液中
TNF-α的 OD值变化
组别 6hr 12hr 24hr 36hr
对照组 0.014±0.005 0.013±0.009 0.013±0.002 0.011±0.008
实验组 C1 0.012±0.004 0.012±0.006 0.011±0.001 0.004±0.005
C2 0.015±0.002 0.023±0.018 0.014±0.004 0.006±0.004
C3 0.013±0.003 0.011±0.002 0.008±0.004 0.013±0.016
　　山葵各组浓度培养基上清液中 TNF-α的含量与
对照组相比 , 无显著差异 (P>0.05)。
3　讨　论
　　山葵原产日本 , 是一种经济价值很高的蔬菜兼
药用植物。近年研究发现[ 4 , 5] 山葵中主要的辛辣成分
———葡萄糖异硫氰酸酯 (Glucosinolate)的分解产物
异硫氰 (Isothiocyanate)具有抗癌、 抗菌、 抗氧化等
多种药理作用 , 流行病学调查显示 , 十字花科蔬菜
能降低人群中肺癌、 乳腺癌 、 消化道癌及膀胱癌等
癌症的发病率。Wantanable 等[ 6]报道山葵提取液在体
外可抑制单核细胞性白血病 U937细胞和骨髓MKN45
细胞的生长 , 诱导其凋亡 , 抑制肿瘤细胞增殖。
　　哺乳动物细胞内 , NO作为一种细胞内生物信使
或细胞毒性效应分子介导细胞凋亡 , 依其浓度和细
胞内氧化还原状态启动细胞凋亡或细胞生存信号。
来源于具有组织活性的内皮和神经元型一氧化氮合
成酶的 NO , 通常对组织细胞产生一种生理性的保护
作用 , 而来源于诱导型一氧化氮合成酶的高剂量的
NO , 更能促进细胞的凋亡 , 参与机体的病理生理过
程[ 7] 。目前已发现 NO 的三种合成酶 , 即 eNOS、
nNOS和 iNOS , 它们可以促进 NO 的合成。一般认为
它们催化合成短暂的小量NO , 在许多生理性自稳态
过程中发挥作用 , 如传递神经递质信息 、 调节血压、
聚集血小板、 血红蛋白的亚硝基化等作用;在酯多
糖或细胞因子、 氧化应激作用下 , 多种细胞内的 iN-
OS催化合成持续大量的 NO , 高水平的 NO 与感染 、
炎性和自身免疫过程有关 , 对机体有利或者有害。
　　本研究发现 , 小鼠巨噬细胞在山葵提取液的作
用下 , NO合成显著增加 , 且与山葵提取物的浓度呈
正相关 , 即山葵浓度越高 , NO 合成越多。NO 能与
细胞内可溶性鸟苷环化酶亚铁原卟啉上的铁离子结
合后抑制三羧酸还原酶中的含铁酶以及 DNA 合成的
核糖核酸还原酶 , 从而抑制线粒体呼吸链电子传递
和DNA合成 , 导致肿瘤细胞的抑制和凋亡[ 7 , 8] , 初步
提示NO 可能是山葵抑癌作用的分子机制之一;而
Uto等研究表明 , 山葵提取物的活性成分 6-甲硫己基
异硫氰酸盐 (6-MITC)作用于小鼠巨噬细胞 RAW264
细胞时 , 6-MITC 呈剂量依赖性抑制脂多糖诱导的
NO 、 iNOSmRNA及 iNOS 蛋白的表达[ 9] , 与本研究结
果不符 , 笔者认为可能的原因有:(1)山葵作用于
不同的细胞所产生的效应不同 , 本研究使用的是小
鼠巨噬细胞 Ana-1 , 而 Uto 使用的是 murine RAW264 ,
Nomura等的研究也表明 6-MITC 具有细胞特异性[ 10] ;
(2)山葵提取物系多种成分 , 各成分对细胞的产生
的作用不尽相同 , 甚或相互拮抗所致[ 11] 。
　　本研究还发现 , 山葵提取物作用于小鼠巨噬细
胞Ana-1 时 , 并不能促使其释放更多的 IL-6、 IL-12
及TNF-α, 也就是说 , 这些细胞因子的表达变化无显
著改变 , 其原因尚不清楚 , 可能山葵中不同成分所
产生的作用相互中和所致 , 亦可能山葵抗癌作用并
不是通过促进 IL-6、 IL-12及TNF-α的释放而实现。
　　山葵提取物是由多种物质组成的混合物 , 其作
用各不相同 , 6MHITC具有抗癌作用[ 2 , 7] , 而 Desulfos-
inigrin却有促进癌细胞生长的作用[ 11] 。看来 , 山葵的
抗癌作用可能涉及一个复杂的通路 , 而不是仅仅通
过体外单纯因素的作用就可阐明的。因此 , 山葵提
取物与癌细胞的相互作用正在进一步研究。
参考文献
　　 [ 1] Kiba A , Saitoh H , Nishihara M , et al.C-t erminal domain of a
hevein-like protein from Wasabia japonica has potent antimicrobial activity[ J] .
Plant Cell Physiol , 2003 Mar;44(3):296～ 303.
　　 [ 2] Yano T , Yajima S , Virgona N , et al.The effect of 6-methylthio-
hexyl isothiocyanate i solated from Wasabia japonica (wasabi)on 4- (methylni-
trosamino)-1- (3-pyridyl)-1-buatnone-induced lung tumorigenesis in mice
[ J] .Cancer Lett , 2000 Jul 31;155(2):115～ 120.
　　 [ 3] Tanida N , Kawaura A , Takahashi A , et al.Suppressive effect of
wasabi(pungent Japanese spice)on gastric carcinogenesis induced by MNNG in
rats [ J] .Nutr Cancer , 1991;16 (1):53～ 58.
　　 [ 4] 黄建 , 孙静.葡糖异硫氰酸酯的生物利用率及对人体健康
的意义[ J] .国外医学.卫生学分册 , 2003, 2:94～ 97.
　　 [ 5] 林丽钦.十字花科植物的风味物质及其降解化学[ J] .福
建轻伤 , 1999 , 4:1～ 4.
　　 [ 6] Watanabe M , ohata M , Haya Kawa S , et al.Identification of 6-
methylsulfinyl hexyl isothiocyanate as an apoptosis-inducing component in wasabi
[ J] .phytochemist ry , 2003;62:733～ 739.
　　 [ 7] Nicotera P , Brune , Bagetta G.Nitric oxide:inducer or suppres-
sor of apoptosis [ J] ? Trends pharmacol S ci , 1997 , 18(6):189～ 190.
·19·2007年第 25卷第 1期Vol.25 ,No.1 ,2007 四　川　中　医Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine
侯氏黑散对 ICVD兔血流变及
脂质过氧化物影响的实验研究
李敬孝　张　岩
黑龙江中医药大学 (黑龙江 哈尔滨 150040)
　　摘要:目的:探讨侯氏黑散对兔脑缺血-再灌注模型的血液流变 、 血小板聚集功能 、 脂质过氧化物的影响。方法:
体重 2～ 3kg的纯种大耳白兔 90 只 , 随机分为假手术 (Ⅰ)组 、 缺血-再灌注即模型 (Ⅱ)组 、 造模后给药 (Ⅲ)组 ,
每组 30只 , 第Ⅲ组灌服侯氏黑散悬浊液 , 其余两组灌服生理盐水 , 连续给药 1 周后处死 , 进行指标测定。结果:第
Ⅲ组的指标均好于前两组。结论:侯氏黑散可使血液粘滞状态明显改善 , 能降低血小板聚集率 , 并减少血栓形成 , 抑
制组织匀浆液中的脂质过氧化物反应 , 降低脂质过氧化物含量。
　　关键词:缺血性脑血管病　侯氏黑散　血液流变学　血小板聚集功能　脂质过氧化物
　　中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1000-3649 (2007)01-0020-02
　　Experimental Study of HOUSHIHEISAN on the Hemorheology and Lipid Peroxidation of ICVD Habbit./ Li Jingxiao 　
Zhang Yan.∥Helongjiang University of Chinese Medicine(Haerbin Helongjiang 150040 , China)
　　Abstract　Objective:To expore the effect of HOUSHIHEISAN(HSHS)on hemorheology of ultrastructure change of rabbits cere-
bral ischemia re-perfusion , platelet aggregtion and lipid peroxidation.Methods:90 pure flap-eared rabbits(2 ～ 3kg)were selected and
randomized into sham operation group (Ⅰ)ultrastructure change of rabbits cerebral ischemia re-perfusion model group (Ⅱ), Co-
medeled and treatment group(Ⅲ), 30 rabbits in each group.The Ⅲ group were intragastriced administration with HOUSHIHEISAN ,
another 2 groups with NS everyday.The rabbits were sacrificad one week later and the chose targets were tested.Results and Conclu-
sions:HOUSHIHEISAN was better than other two groups in reduce blood viscosity , decreased platelet aggregation , antithrombotic , in-
hibitory reaction of lipid peroxidation in tissue homogenate and depress content of lipid peroxidation.
　　Key words:ischemic cerebral disease　HOUSHIHEISAN (HSHS)　hemorheology　platelet aggregtion　lipid peroxidation
　　脑血管病 (CVD)以其高发病率 、 高死亡率 、 高致残率
严重影响着人类的健康 , 已成为我国老年人三大死亡原因之
首。其中 , 以缺血性脑血管病 (ICVD)较为常见 (约占
56.6%～ 80%)。ICVD属于祖国医学 “中风” 范畴 , 历代医家
记载颇多 , 医圣张仲景有方侯氏黑散专治中风病 , 近年来有
报道用其治疗 ICVD , 取得较好的临床疗效。为探讨其作用机
理 , 本研究观察了侯氏黑散对兔脑缺血-再灌注模型的血液流
变 、 血小板聚集功能 、 脂质过氧化物的影响。结果表明 , 侯
氏黑散可明显改善血液粘滞状态 , 降低血小板聚集率 , 抑制
组织匀浆液中的脂质过氧化反应 , 降低脂质过氧化物含量。
报告如下。
1　材料与方法
1.1　实验材料　侯氏黑散 (菊花 、 白术 、 细辛 、 茯苓等)研
成碎末 , 用蒸馏水配成 10mg/ml悬浊液。
1.2　实验方法　90 只家兔 , 雌雄兼半 , 随机分为假手术
(Ⅰ)组 、 缺血-再灌注即模型 (Ⅱ)组 、 造模后给药 (Ⅲ)
组 , 每组 30只。本模型是在陈氏结扎家兔三动脉造成脑缺血
的基础上复制缺血及再灌注模型 , 全部动物按不同组交叉顺
序进行手术。将家兔以 20%乌拉坦 (5ml/ kg)经耳缘静脉注
射麻醉 , 仰卧位固定 , 沿颈正中切开颈前皮肤约 3cm 长 , 于
气管双侧分离颈总动脉 , 用皮瓣包裹 , 缝合伤口 , 撒以少许
消炎粉。假手术组除不结扎三动脉外 , 手术过程同其他组。
其它两组在动物苏醒后第二天 , 成为脑缺血-再灌注模型。第
Ⅲ组灌服侯氏黑散悬浊液 0.3ml/100g·d- , 其余两组灌服生理
盐水 0.3ml/ 100g·d- , 连续给药 1 周 , 余各项饲养条件相同。
1.3　指标测定
1.3.1　血液流变学测定　三组动物均于处死前颈外静脉取
血 , 肝素抗凝。将 5ml血液放入毛管式自动显示流变仪中操
作 , 观察三组动物全血粘度 、 血浆粘度与红细胞压积的变化。
1.3.2　血小板聚集功能测定　三组动物均于处死前颈外静脉
取血 , 注入试管内 (内有 109mmol/ L的枸橼酸钠 0.5ml), 以
800转/分的转速离心 5min , 吸取上清液制备富血小板血浆
(PRP)。再将余下的血液以 3000转/分的转速离心 100min , 吸
取上清液制备贫血小板血浆 (PPP)。最后按血小板聚集仪的
　　 [ 8] Higuchi M , Higashi N , Taki H , et al.Cytolytic mechanism of
activated macrophages [ J] .J immunolo , 1990 , 144 (4):1425.
　　 [ 9] Uto T , Fujii M , Hou DX.6- (Methylsulfinyl) hexyl i sothio-
cyanate suppresses inducible nitric oxide synthase expression through the inhibi-
tion of Janus kinase 2-mediated JNK pathway in lipopolysaccharide-activated
murine macrophages [ J] .Biochem Pharmacol , 2005 Oct 15;70 (8):1211
～ 1221.
　　 [ 10] Nomura T , Shinoda S , yamori T , et al.Selective sensitivity to
wasabi-derived 6- (methylsulfinyl)hexyl isothiocyanate of human brease cancer
and melanoma cell lines studied in vitro [ J] .Cancer Detect Prev , 2005;29
(2):155～ 160.
　　 [ 11] Weil MJ , Zhang Y , Nair MG.Colon cancer proliferating desul-
fosinigrin in wasabi (Wasabia japonica)[ J] .Nutr Cancer , 2004;48 (2):
207～ 213. (收稿日期　2006-09-11)
·20· 四　川　中　医Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine 2007 年第 25卷第 1 期Vol.25 , No.1 , 2007