全 文 ：坛紫菜中藻胆蛋白的提取及其抗氧化活性研究
钱晓婕 ,陈舜胜 , 付杰
(上海水产大学食品学院 , 上海 200090)
摘　要:目的 提取紫菜中的藻胆蛋白 ,找出从紫菜中提取藻胆蛋白的最佳提取条件 ,并对其抗氧化能力进行研
究。方法 紫菜用 40倍体积的水溶涨 6d后 ,经组织捣碎 2min , 45%的硫酸铵盐析沉淀透析后即得藻胆蛋白粗提
物(CPP)。采用邻二氮菲-Fe2+氧化法和邻苯三酚自氧化法分别测定CPP清除· OH 和 O-2 ·能力, 并小鼠连续
灌胃 25d 后, 分别测定小鼠全血过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽氧化物酶(GSH-Px)活性, 以及红细胞丙二醛
(MDA)含量和血清总 SOD活性。结果 CPP 具有体外清除 · OH 和 O-2 · 作用 , 并能显著地提高小鼠全血
CAT , GSG-Px ,血清总 SOD 活力 ,降低红细胞 MDA含量。结论 CPP能以多种途径发挥抗氧化作用。
关键词:坛紫菜;藻胆蛋白;提取;自由基;抗氧化
中图分类号:TQ460.6 , R965　文献标识码:A　文章编号:1002-3461(2008)02-0042-04
Studies on extraction and antioxidation activity of phycobilipro-
teins from Porphyra haitanensis
QIAN Xiao-jie , CHEN Shun-sheng , FU Jie
(College of Food ,S hanghai Fisheries Universi ty , S hanghai 200090 ,China)
Abstract:Objective To ex tract phycobiliproteins f rom Porphy ra hai tanensis , f ind out the opt i-
mum ex traction conditions and invest igate the antio xidat ion act ivity o f phycobiliproteins in
vi tro and anti-oxygen free radical in v ivo.Methods Porphyra haitanensis was ext racted wi th
deioned-water at 40 vo lumes fo r 6 day s and tissue- triturated for 2 minutes.The crude phyco-
bilipro tein(CPP)was purified by precipi tating wi th 45% ammonium sulphate and dialyzing .
The scavenging activit ie s of the crude phycobiliprotein on · OH o f the sy stem o f 1 , 10-
phenanthro line-Fe(Ⅱ)/H 2O 2 and O -2 · o f py rogallol autoxidation we re studied.And the
mice w ere t reated by gast ric incubat ion w ith crude phycobiliprotein , at doses of 100 , 200 ,
300mg ·kg-1 ·d-1 .The activi ties o f ery throcyte catalase (CA T)and glutathione peroxidase
(GSH-Px), serum supero xide dismutase(SOD)and the content of e ry thro cy te MDA in mice
were determined on the 25th day af ter t reatment.Results CPP could scavenge free radicals ,
and also can increase the act ivities o f erythrocy te CA T , GSH-Px , serum SOD and decrease
the content of MDA significant ly.Conclusion The crude phycobiliprotein f rom Porphyra hai-
tanensis has antioxidation activity in dif fe rent w ay s.
Key words:Porphyra hai tanensis;phycobi lipro tein;ex traction;f ree radical;antio xidation
　　藻胆蛋白(phycobiliproteins)是藻类特
有的捕光色素蛋白 ,参与光合作用的能量吸
收和传递 ,主要存在于红藻 、蓝绿藻和隐藻的
藻胆体中。藻胆蛋白主要包括藻红蛋白
(phycoery thrin)、藻蓝蛋白(phycocyanin)和
别藻蓝蛋白(allphycocyanin)3类[ 1] 。藻胆蛋
白在藻类中的含量可达细胞干重的 25%～
28%[ 2] ,除了作为荧光探针用于医学诊断 、免
疫学和细胞学研究之外 ,藻胆蛋白具有抗氧
化 、提高机体免疫力和抗肿瘤等重要药理功
能 ,在功能食品 、化妆品和药品中有广泛的应
用前景[ 3-6] 。目前我国有以红毛菜 、紫球藻和
螺旋藻作为原料提取藻胆蛋白的报道 ,但因
其成本偏高以及得率偏低等原因仍处于研究
阶段 ,至今还未产业化 。我国藻类资源十分
丰富 ,是世界上最大的紫菜生产大国。是获
取藻胆蛋白的理想资源。选用紫菜提取藻胆
蛋白 ,具有成本低 ,得率高的优点[ 7 , 8] ,具有
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较好的利用价值 。本文旨在探索从紫菜中提
取藻胆蛋白的最佳条件 ,并对其体外体内抗
氧化能力方面的药用价值进行研究 ,为其在
功能食品 、化妆品和药品等方面的应用提供
依据 。
1　材料与方法
1.1　材料及试剂
1.1.1　材料 坛紫菜为产自浙江舟山的
野生紫菜 ,2006年 5月采集 。
1.1.2　主要试剂 邻二氮菲(AR)、邻苯
三酚(AR)(国药集团上海试剂公司);CA T
试剂盒 、GSH-Px 试剂盒 、MDA 试剂盒 、SOD
试剂盒(南京建成生物技术有限公司产品)。
1.1.3　实验动物 昆明种小鼠(体重 20
～ 25g ,清洁级),由上海复旦大学实验动物中
心提供。
1.2　方法
1.2.1　紫菜藻胆蛋白粗提物的制备
称取 10g 经粉碎后的紫菜 ,用去离子水
浸泡使之溶涨 。在冰浴中采用组织捣碎机进
行细胞破碎 ,冰箱中过夜 。在 4℃下 , 7500r
·min-1离心 15min ,取紫红色上清液 ,量取
上清液体积 ,计算并称取相应浓度质量的固
体硫酸铵粉末 ,缓慢地加入初提液中 ,缓慢搅
拌 1h 左右以促进蛋白沉淀。置 4℃避光沉
淀 4h 后冷冻离心(4℃, 10000r · min-1 ,
10min),将沉淀溶于一定量的 1mmol ·L-1
磷酸缓冲液(PBS pH6.8)中 ,用紫外分光光
度计测定其吸收光谱。
设计 L9(34)的正交试验来寻求藻胆蛋
白提取过程中的最佳提取参数(表 1)。
将得到的紫红色藻胆蛋白液装入透析
袋 ,于 4℃冰箱中 ,置于 1mmo l·L -1磷酸缓
冲液(pH6.8)中透析 48h ,脱盐[ 9] ,其间每隔
6h更换一次透析液 。离心得到紫红色的上
清液即为藻胆蛋白粗提物(crude phycobilip-
roteins , CPP),冷冻干燥处理以利于保藏。
表 1　影响藻胆蛋白提取的因素及水平设计
Tab 1　The design of factor s and the level in the phycobilipro tein ex traction
水平
设定
提取影响因素
提取液体积
(倍数)
溶涨时间
(d)
组织捣碎时间
(min)
(NH4)2SO4浓度
(%)
1 20 2 1 45
2 30 4 2 55
3 40 6 3 65
1.2.2　体外自由基清除率的测定
1.2.2.1　清除 ·OH 能力的测定[ 10]
取 0.75mol·L-1邻二氮菲溶液 1mL 于
试管中 ,依次加入磷酸缓冲液(pH7.40)2mL
和蒸馏水 1mL ,充分混匀后 ,加入 0.75mmo l
·L-1硫酸亚铁 1mL ,混匀 ,加 0.01% H2O2
1 mL ,于 37℃下温育 60min , 536nm 处测其
吸光度 A p 。用 1mL 蒸馏水 代替 1mL
H 2O2 ,测得的吸光度 AB ;用式样液 1mL 代
替蒸馏水 ,测得的吸光度位 A S ,清除率(D)
计算公式:
D(%)=A S -A P
AB-A P ×100%
1.2.2.2　清除 O -2 ·能力的测定[ 11]
取 0.05mol ·L -1 Tris-HCl缓冲液(pH
=8.2)4.5mL ,置于 25℃水浴中预热 20min ,
分别加入 1mL 试样和 0.4mL 25mmol·L-1
邻苯三酚溶液 ,混匀后于 25℃水浴中反应
5min ,加入 8mol · L-1HCl 1mL 终止反应 ,
299nm 处测定吸光度(A i),空白对照组以相
同体积的蒸馏水代替样品 , 测定吸光度
(A 0),清除率(D)计算公式:
D(%)=A 0 -A i
A 0
×100%
1.2.3　藻胆蛋白对小鼠抗氧化能力的影响
1.2.3.1　实验分组 、给药方法及剂量
小鼠适应性喂养后随机分成 4组:每组
8只 ,雌雄各半 。对照组;藻胆蛋白低 、中和
高剂量(100 , 200 , 300mg ·kg-1 ·d-1)实验
组[ 12] 。各剂量组灌胃 CPP ,对照组给予等量
生理盐水 , 连续 25d后 ,各组小鼠断头取血 ,
测定小鼠血液中的相关指标。
1.2.3.2　测定方法
全血过氧化氢酶(CA T)活性测定 ,谷胱
甘肽氧化物酶(GSH-Px), 红细胞丙二醛
(MDA),以及血清总 SOD 活性均按照测定
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试剂盒的说明操作。
1.2.3.3　实验数据处理[ 13]
实验数据用 x ±s表示 ,各组数据间的比
较用 t检验 ,计算方法见文献[ 13] 。
2　结果与讨论
2.1　藻胆蛋白抽提条件的优化
从表 2中可见 ,提取液体积和 (NH 4)2
SO 4浓度对提取效果的影响较大 ,其 R值分
别为 1.320和 1.269 ,两者的影响程度比较
接近 ,其他两个因素对提取效果的影响则不
大 ,影响程度为溶涨时间>组织捣碎时间 。
在各水平的比较下 ,可以看出(NH 4)2 SO 4浓
度增大 ,A 560值是减小的 ,因为 A 560值只是反
映了藻红蛋白的含量 ,和其他蛋白质的含量
无关 ,可见随着硫酸铵浓度的增加 ,所沉淀下
的并不是目的蛋白 ,而是其他杂蛋白。随着
提取液体积的增大和溶涨时间的延长 ,提取
液中藻红蛋白的含量也增大。由正交实验得
出的较佳提取条件是用 40倍体积的去离子
水浸泡6d充分溶涨 ,组织捣碎 2min ,用 45%
浓度的硫酸铵盐析沉淀。
表 2　藻胆蛋白提取条件对其提取效果的影响
Tab 2　Effec t o f the extr action conditions on purity of phycobilipro teins
处理编号 提取液体积(倍数)
溶涨时间
(d)
组织捣碎时间
(min)
(NH 4)2 SO 4浓度
(%) A 560nm
(1) 1 1 1 1 1.220
(2) 1 2 2 2 1.016
(3) 1 3 3 3 0.895
(4) 2 1 2 3 1.229
(5) 2 2 3 1 1.343
(6) 2 3 1 2 1.505
(7) 3 1 3 2 1.475
(8) 3 2 1 3 1.073
(9) 3 3 2 1 1.903
K 1 3.131 3.924 3.798 4.466
K 2 4.077 3.432 4.148 3.996
K 3 4.451 4.303 3.713 3.197
R 1.320 0.871 0.435 1.269
2.2　CPP 清除自由基的作用
2.2.1　CPP对 ·OH 的清除作用
图 1　CPP 清除· OH 活性的量效关系
Fig 1　Reala tionship between concent ration and
scaveng ing effect of CPP on · OH
CPP 对·OH 的清除活性与蛋白浓度呈
现较好的量效关系 ,尤其在 CPP 浓度 20 ～
120μg · mL -1范围内 , 但其浓度在 120 ～
200μg/ml范围内时 ,随浓度的增加 ,对 ·OH
的清除作用变化不明显(图 1)。此结果与陈
美珍等所报道的龙须菜藻胆蛋白清除羟自由
基的结论较为接近[ 14] 。
2.2.2　CPP 对 O-2 ·的清除作用
图 2　CPP清除 O -2 ·活性的量效关系
Fig 2　Reala tionship betw een concent ration and
scavenging effect of CPP on O-2 ·
CPP 对 O -2 ·的清除活性与蛋白浓度呈
现较好的量效关系 ,在 CPP 浓度 20 ～ 100μg
·mL-1范围内 ,随浓度增加 ,对 O -2 ·的清
除率明显增强 ,但其浓度在 100 ～ 200μg ·
mL
-1范围内时 ,随浓度的增加 ,对 O -2 ·的
清除作用变化不明显(图 2)。此结果与汪兴
平等[ 15] 所报道的葛仙米藻胆蛋白体外抗活
性氧自由基作用的结论较为接近。
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2.3　CPP 对小鼠抗氧化能力的影响
CA T 和GSH-Px 都是机体内广泛存在
的重要催化过氧化氢分解的酶 ,测定 CA T
和GSH-Px 活性可间接反映机体清除自由
基的能力 ,衡量组织细胞抗氧化水平。给予
不同剂量的 CPP ,小鼠血红蛋白 CA T 活性
和全血 GSH-Px 活性的变化如表 3 所示。
与正常对照组相比 ,CPP 能使小鼠血红蛋白
中CA T 活性和全血 GSH-Px 活性均有极显
著的提高 。
表 3　CPP对小鼠血红蛋白 CAT 和
全血 GSH-Px的影响(n=8 , x±s)
Tab 3　The effects of phycobilipro teins on the
activities of CAT and GSH-Px in the blood o f mice
组　别 剂量(mg· kg -1·d-1)
CAT
(U/mgHb)
GSH-Px
(U)
对照组 0 8.53±0.40 231.57±14.90
低剂量组 100 9.63±0.57＊ 339.66±24.10＊
中剂量组 200 10.20±0.47＊ 407.60±62.03＊
高剂量组 300 9.92±0.51＊ 360.23±32.21＊
注:＊与对照组比较 P<0.01
SOD是机体清除超氧阴离子自由基的
重要酶。MDA 是过氧化脂质(LPO)进一步
分解产物 ,它的量常常可反映机体内脂质过
氧化的程度 ,间接地反映出细胞损伤 、机体衰
老的程度。给予不用剂量的 CPP ,小鼠血清
总SOD活性和红细胞 MDA值的变化如表4
所示 。与正常对照组相比 ,低 、中剂量组小鼠
血清总 SOD活性均极显著提高 ,而 3个剂量
组的小鼠红细胞 MDA 值均显著地下降。
表 4　CPP对小鼠血清总 SOD和
红细胞 MDA 的影响(n=8 , x±s)
Tab 4　The effects of phycobilipro teins on the
ac tivities o f SOD in the serum and the
level of MDA in the RBC o f mice
组　别 剂量(m g· kg -1· d-1)
SOD
(U ·mL-1)
M DA
(nmol·mL-1)
对照组 0 167.17±11.40 2.35±0.11
低剂量组 100 244.75±12.13＊ 2.11±0.11＊
中剂量组 200 249.55±14.14＊ 1.98±0.09＊
高剂量组 300 184.92±19.20 2.10±0.10＊
注:与对照组比较＊P<0.01
　　实验表明 , CPP 在适当浓度下具有明显
的抗氧化能力 ,但浓度过高时其作用有所下
降 ,推测这种现象可能与藻胆蛋白分子中的
藻胆素具有光敏作用有关 ,由此带来对体内
生物大分子的细胞结构的破坏[ 16] ,其真正原
因尚待进一步验证 。
紫菜藻胆蛋白能在一定浓度范围内提高
血液中 CAT 、GSH-Px 和 SOD 活性 ,并降低
MDA的含量 ,并且具有较好的清除体外自
由基 ·OH 和 O -2 ·的活性 ,可见 CPP 能以
多种途径发挥抗氧化作用 ,以减少组织细胞
损伤 ,延缓机体的衰老。
紫菜含有丰富的活性多糖 、藻胆蛋白及
膳食纤维和多种营养元素等 ,有很好的保健
功效 ,是开发海洋药物和保健食品的一种很
好的原料 ,应考虑对其进行综合利用 ,以提高
经济价值 。
参考文献:
[ 1] 　王广策 , 邓田 ,曾呈奎.藻胆蛋白的研究概况(Ⅰ)
[ J] .海洋科学 , 2000 , 24(2):22.
[ 2] 　彭为民 ,商树田 ,刘国琴 ,等.螺旋藻藻胆蛋白研究进
展[ J] .农业生物技术学报 , 1998 , 6(2):173.
[ 3] 　Kronick MN , G rossman PD.Immun oassay tech-
niqu es wi th f luorescentphy cobilip rotein con jugates [ J] .
Clin Chem , 1983 , 29(9):1582.
[ 4] 　陈新美 , 梅兴国.螺旋藻多糖和藻胆蛋白的肿瘤防
治作用及机制[ J] .中草药 , 2004 , 35(1):100.
[ 5] 　陈美珍 ,张永雨 ,余杰 ,等.龙须菜藻胆蛋白的分离及
其清除自由基作用的初步研究[ J] .食品科学 , 2004 , 25(3):
159.
[ 6] 　Plank T .Subuni t interact ions and protein s tabilit y in
th ecyanobacterial ligh t-harvesting protein s[ J] .J B acteri-
al , 1995 , 177(23):6789.
[ 7] 　王仲孚 , 赵谋明.藻胆蛋白研究[ J] .生命的化学 ,
2000, 20(2):72.
[ 8] 　杨方美 ,李华佳 , 胡秋辉.紫菜中藻胆蛋白的提取及
纯化[ J] .食品科学 , 2005 , 26(11):100.
[ 9] 　温少红 ,赵呈龙.紫球藻 B-藻红蛋白的分离纯化[ J] .
中国海洋药物 , 2001 ,(3):33.
[ 10] 　凌关庭.抗氧化食品与健康[ M] .北京:化学工业出
版社, 2004:585.
[ 11] 　范晓 ,严晓军 ,房国明 ,等.高分子量褐藻多酚抗氧化
性质研究[ J] .水产生物学报 , 1999.23(5):494.
[ 12] 　陈美珍 ,余杰 ,钟秋铃 ,等.龙须菜藻胆蛋白免疫功能
和抗氧化作用的研究[ J] .食品科学 , 2005.26(9):456.
[ 13] 　吴谋成.功能食品研究与应用[ M] .北京:化学工业
出版社 , 2004:41.
[ 14] 　陈美珍 ,张永雨 ,余杰 ,等.龙须菜藻胆蛋白的分离及
其清除自由基作用的初步研究[ J] .食品科学 , 2004 , 25(3):
159.
[ 15] 　汪兴平 ,谢笔均 ,潘思轶 ,等.葛仙米藻红蛋白体外抗
活性氧自由基作用的研究[ J] .食品科学 , 2005 , 26(8):404.
[ 16] 　张建平 ,谢洁 ,张素萍 , 等.两种藻蓝蛋白的光动力
光敏性质研究[ J] .科学通报 , 1999 , 44(5):495.
(收稿日期:2007-09-30)
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