全 文 ：第 34 卷第 4 期
2015 年 8 月
海 洋 环 境 科 学
MAＲINE ENVIＲONMENTAL SCIENCE
Vol． 34 No． 4
August 2015
原油分散液对小新月菱形藻 C、N稳定
同位素组成的影响
刘 瑀1， 李 颖2， 王晓琦1， 王海霞2， 韩俊松3
(1．大连海事大学 环境科学与工程学院，辽宁 大连 116026;2． 大连海事大学 航海学院，辽宁 大连
116026;3．辽宁海事局，辽宁 大连 116026)
摘 要:以微藻类小新月菱形藻(Nitzschia closterium)为研究对象，通过设置不同的原油分散液(WAF)浓
度，分别进行了急性(4 d)和亚急性(29 d)毒理实验;通过细胞计数、丙二醛(MDA)测定、稳定同位素组成
分析等方法测定了原油分散液(WAF)对小新月菱形藻生长曲线、C 和 N 稳定同位素组成(δ13 C、δ15 N 值)
的影响。结果表明，WAF在低浓度(≤1． 0 mg /L)长期作用下对小新月菱形藻的生长有促进作用，而较高
浓度(≥5． 0 mg /L)则使藻细胞生长受到抑制;小新月菱形藻的丙二醛含量随时间及 WAF 浓度增大而逐
渐增加，最高可达 1． 65 倍。WAF在低浓度(≤1． 0 mg /L)作用下，藻细胞的 δ13C、δ15N值都趋于增大，而较
高浓度(≥5． 0 mg /L)则使藻细胞的 δ13C、δ15N值趋于变小，这表明，微藻类的 C、N稳定同位素组成能够从
一定程度上反映污染程度，因此可作为海洋溢油污染监测的一种新指标。
关键词:原油;小新月菱形藻;丙二醛;稳定同位素
中图分类号:X171 文献标识码:A 文章编号:1007-6336(2015)04-0503-05
Effect of crude oil dispersion on carbon and nitrogen stable
isotopic composition of Nitzschia closterium
LIU Yu1， LI Ying 2， WANG Xiao-qi1， WANG Hai-xia2， HAN Jun-song3
(1． Dalian Maritime University，College of Environmental Science and Engineering，Dalian 116026，China;2． Dalian Maritime Univer-
sity，Navigation College，Dalian 116026，China;3． Liaoning Maritime Safety Administration，Dalian 116026，China)
Abstract:This study made acute (4 d)and chronic (29 d)experiments by setting different oil concentrations
(WAF)and using Nitzschia closterium as the research object． We measured the effects of WAF on N． closterium by
cell counting，malondialdehyde (MDA)measuring and the carbon /nitrogen stable isotopic analyses． The results show
that WAF stimulated the growth of N． closterium in low concentration (≤1． 0 mg /L)，while the growth of N． closterium
was restrained in relatively high concentrations (≥5． 0 mg /L)． The MDA content increased with the growth time and
the increase of WAF concentration，up to the maximum of 1． 65 times． The δ13C and δ15N value was higher in low con-
centration (≤1． 0 mg /L) ，while lower in relatively high concentration (≥5． 0 mg /L)． Therefor the stable isotopic
composition of microalgae may be used as an alternative method for oil pollution monitoring．
Key words:crude oil;Nitzschia closterium;malondialdehyde;stable isotopic composition
收稿日期:2014-09-28，修订日期:2014-11-11
基金项目:国家海洋公益项目(2012418012-02)
作者简介:刘 瑀(1965-) ，男，教授，陕西西安人，主要从事海洋环境化学领域的研究，E-mail:ylsibo@ foxmail． com
目前有关海洋油污染的研究，多数是对有经
济价值的鱼、虾及贝类的培育研究和一些理化毒
性的分析，而对浮游藻类受油污染影响的研究则
不是很多。王君丽、刘春光［1］等研究表明石油的
长期作用，会影响食物链的传递过程及生物的多
样性。黄逸君、江志兵［2］等研究表明，不同浓度
DOI:10.13634/j.cnki.mes.2015.04.005
504 海 洋 环 境 科 学 第 34 卷
原油的胁迫下，微藻细胞数量及其优势种组成都
表现出显著变化。本研究以微藻类小新月菱形藻
为实验对象，通过设置不同的油浓度，分别进行了
急性实验和亚急性实验，通过细胞计数、硫代巴比
妥酸法、稳定同位素技术测定了阿拉伯轻质原油
对小新月菱形藻生长及 δ13 C、δ15 N 值的影响，探
讨了原油对微藻的毒性效应作用，以期为原油对
海洋浮游生物的影响及后期在食物网的传递过程
中所带来的潜在危害提供基础的数据资料。
1 材料与方法
1． 1 材料
小新月菱形藻(Nitzschia closterium)取自国家
海洋环境监测中心，设置其明暗周期比 12 h∶ 12
h、光照 2000 lx、温度(20 ± 1)℃。反复扩培后进
行实验。
试验用海水取自大连黑石礁近岸表层海水
(盐度为 30，pH为 7． 7)。实验前需经过过滤、煮
沸消毒，晾凉后加入 Conway培养液待用。实验过
程中应保证无菌操作。
1． 2 实验方法
实验选用阿拉伯轻质原油，按照灭菌海水与
油品体积比 9 ∶ 1 混合，放置磁力搅拌器上，搅拌
24 h，静置 4 h，分离出下层的水相，即为原油分散
液(WAF)，根据 GB17378． 4-2007，海洋监测规范
中紫外分光光度法［3］测定油浓度。
实验分急性实验和亚急性实验，急性实验周
期为 4 d，设置 6 组浓度，依次为 0、1． 0、5． 0、25. 0、
50． 0、100． 0 mg /L;亚急性实验周期为 29 d，设置
4 组浓度，依次为 0、1． 0、5 ． 0、10． 0 mg /L，以上每
组均设置 3 个平行。
两部分实验的主要研究内容及方法如下:
采用浮游生物计数框法［4］，对小新月菱形藻
进行细胞计数，绘制生长曲线，并计算其比生长速
率判断是否进入指数期和稳定期。
采用硫代巴比妥酸分光光度计法［5］测定小
新月菱形藻的丙二醛(MDA)含量，绘制 MDA 含
量随浓度及时间变化的柱形图。
1． 3 稳定同位素组成分析
实验藻液用灼烧后的 GF /F 滤膜抽滤，放置
60℃的烘箱中，烘干 24 h，用干净的刀片使藻体与
滤膜分离，每个样品称取 2． 00 mg，包进锡杯中，
通过元素分析仪(Flash EA 1112，Thermo Fisher
Scientific，美国)和稳定同位素比质谱仪(Delta V
Advantage，Thermo FisherScientific，美国)进行 C、N
稳定同位素组成的测定，获取 δ13 C、δ15 N 值，分析
其在一定范围内的涨落情况。
稳定 C、N 同位素的自然丰度表示为:δX =
Ｒ样品
Ｒ[ ]标准( )－ 1 × 103
其公式中:X为13C或15N;
Ｒ为13C / 12 C 或15 N / 14 N;δ13 C 值是相对 PDB
标准的自然风度，δ15 N 值是相对空气中 N2的丰
度。δ13C的分析精度为 ± 0． 20‰，δ15 N 的分析精
度为 ± 0． 30‰。
1． 4 数据处理
实验数据用 Microsoft Excel 2007 分析平均值
及标准偏差。图表用 Excel软件绘制。
2 结果与讨论
2． 1 WAF对小新月菱形藻生长的影响
小新月菱形藻急性实验、亚急性实验的生长
曲线如图 1a、1b所示。
图 1 WAF对小新月菱形藻的细胞数量的影响
Fig． 1 Effects of WAF on cell density of N． closterium
第 4 期 刘 瑀，等:原油分散液对小新月菱形藻 C、N稳定同位素组成的影响 505
从图 1a可以看出，随 WAF 浓度的升高抑制
作用增强，随着培养时间的延长抑制作用也越明
显。十九世纪，GALTSOFF 等就研究结果表明石
油覆盖水体表面抑制了新月菱形藻的生长［6］。
本实验中，4 d 时，WAF 浓度为 1． 0、5． 0、25． 0、
50. 0 mg /L 组的细胞数目依次为对照组的
82. 8%、67． 9%、53． 1%、34． 4%。100 mg /L 的浓
度组其生长曲线近乎于一条直线，说明受到原油
分散液的完全抑制。
从图 1b可以看出，各组藻在接种后的 1 d 到
3 d内，生长缓慢，属于生长的适应阶段。从第 5 d
开始，各组细胞数明显增加，比生长速率最高达到
1． 02 /d，进入了生长指数期，将近持续了 12 d 左
右。第 17 d 后，比生长速率降至 0． 01 ～ 0． 02 /d，
说明各组进入稳定期，稳定期持续 10 d 左右。
WAF浓度为 1． 0 mg /L 时，指数期生长曲线与对
照组相近，稳定期细胞个数高于对照组，表现出了
生长促进作用。WAF浓度为 5． 0 mg /L、10． 0 mg /
L时，细胞个数低于对照组，生长受到抑制，培养
到 17 d，依次为对照组的 79． 4%、70． 8%。
研究表明，石油烃在高浓度的时候可抑制海
洋浮游植物的生长，在低浓度的时候可产生促进
作用［7］。这与本实验的研究结果一致。KAILEN
等［8］用液像色谱法做因子分析特征色素对总叶
绿素 a的贡献比率也得到了同样的结论。亚急性
实验中，低浓度组表现出的生长促进作用为某种
兴奋效应，关于这种效应，陶功华在文章中提出了
以下可能机制:DNA损伤修复、免疫功能增强、自
由基清除、过度补偿以及基因表达调控作用［9］。
本实验中，原油分散液对微藻的促进作用可能与
自由基清除机制有关。
2． 2 WAF对小新月菱形藻 MDA含量的影响
小新月菱形藻的 4 d-MDA 含量与细胞数量
的关系曲线如图 2 所示。
从图 2 可以看出，随 WAF 浓度的增大，小新
月菱形藻的MDA含量不断增加，这表明原油分散
液能引起藻细胞内脂质过氧化物水平的升高，抑
制了小新月菱形藻的生长，浓度越高，抑制作用
越强。
小新月菱形藻亚急性实验的 MDA 含量变化
如图 3 所示。
从图 3 可以看出，随胁迫时间的延长，各浓度
图 2 4 d-MDA含量与细胞数量的关系
Fig． 2 Ｒelationship between 4 d-MDA value with cell density
图 3 WAF对小新月菱形藻 MDA含量的影响
Fig． 3 Effect of WAF on MDA contents of N． closterium
组的 MDA含量均呈增加趋势。这一结果与镉胁
迫使海洋微藻 MDA含量升高［10］是相似的。低浓
度组(1． 0 mg /L)的 MDA 值相比对照组略低，脂
质过氧化作用不明显。而高浓度组(5． 0 mg /L、
10． 0 mg /L)的 MDA 含量相比对照组都有增加，
最大增加 45%、65%。这是因为当受到胁迫时，
会产生如超氧根(O －2 )这样的活性氧物质，它们与
H2O2可以反应生成羟自由基(·OH) ，进一步将
脂肪酸转化为过氧化物，破坏生物体膜，导致
MDA积累［11］，进而使其生长受到抑制。
2． 3 WAF 对小新月菱形藻 C、N 稳定同位素组成
小新月菱形藻亚急性实验的 C、N 稳定同位
素组成变化如图 4、图 5 所示。
本实验中，微藻的 δ13C 变化范围为(－ 34． 46
± 0． 49)‰ ～(－ 20． 95 ± 2． 31)‰。浮游植物δ13C
值的变化取决于无机碳的来源［12］。从图 4 可以
506 海 洋 环 境 科 学 第 34 卷
图 4 δ13C的变化情况
Fig． 4 The change of δ13C
图 5 δ15N的变化情况
Fig． 5 The change of δ15N
看出，对照组的 δ13 C 值稳定期低于指数期，呈下
降趋势。这是因为在本实验中，是一个相对开放
体系，可以维持 CO2水气平衡，微藻利用的主要碳
源为 CO2，随着微藻的生长，可以吸收到源源不断
的12C，进而 δ13 C 的值不断降低。低浓度组(1. 0
mg /L)的 δ13 C 高于对照组，这是因为生长稳定
期，微藻的细胞数目高出对照组，伴随着水溶的
CO2被不断消耗，微藻开始吸收
13C，最终导致 δ13C
值略高于对照组［13］。而较高浓度组(5． 0 mg /L、
10． 0 mg /L)的 δ13 C 低于对照组，浓度越高，其
δ13C值越小，这是因为此时微藻利用的无机碳源
主要为水体中的 CO2，是相对充足的，一方面从动
力学角度，WAF 造成微藻细胞合成速率下降，会
优先吸收较轻的12C，从而造成 δ13 C 值更小，另一
方面 WAF中的芳香烃作用可诱导出大量的能与
核酸、蛋白质分子结合的自由基，进而造成酶失
活［14］，δ13 C 值更小。碳酸酐酶是一种含 Zn 的同
工酶，它能快速催化 CO2 + H2O→H
+ + HCO －3 的
转化，有研究表明，在 HCO －3 浓度小于 2 mmol /L
时，添加乙酰唑胺(碳酸酐酶胞外酶的抑制剂)的
莱茵衣藻和小球藻的 δ13 C 值分别比未添加组偏
负 9． 1‰、11． 4‰［15］。
本实验中，δ15 N 的变化范围为(10． 38 ±
0. 38)‰ ～(17． 14 ± 0． 51)‰。从图 5 可以看出，
对照组的 δ15N值稳定期高于指数期，这是由于实
验海水中存在硝酸盐体系和铵盐体系，这些氮源
一经消耗是无法补充的，伴随着细胞数量的增
大，14N 的不断被吸收，微藻开始富集较重的15 N，
从而造成 δ15 N 值逐渐增大。指数期分馏作用更
强，这是因为在细胞微藻不断富集15 N 的同时，海
水中 NH +4 向 NH3转化，由于 NH3分子较 NH
+
4 更易
穿过细胞类脂膜，从而导致微藻指数期的 N 同位
素分馏作用显著［16］。低浓度组(1． 0 mg /L)的
δ15N高于对照组，这是因为在稳定期，其细胞数目
高出对照组，生存空间受到胁迫，食物来源受到限
制，微藻被迫吸收更多的15N，从而造成 δ15 N 值更
大。NEEDOBA的研究表明藻类硝酸盐同化在低
光作用下，硝酸盐还原酶表现出更大的活性［17］，
硝酸盐进出细胞有更大的通量，同位素分馏效应
增强［18］。本实验中的较高浓度组(5． 0 mg /L、
10. 0 mg /L)的 δ15 N 低于对照组，推测可能是
WAF影响微藻细胞对硝酸盐的吸收导致的。
3 结 论
本文的实验结果表明原油分散液(WAF)在
低浓度(≤1． 0 mg /L)长期作用下对小新月菱形
藻的生长有促进作用，而较高浓度(≥5． 0 mg /L)
则使藻细胞生长受到抑制。在急性实验和亚急性
实验中，本实验还发现，小新月菱形藻的丙二醛含
量随时间及WAF浓度增大而逐渐增加，因为生物
膜主要组成为磷脂和蛋白质，所以脂溶性物质会
更容易通过，进而引发膜脂过氧化伤害。有研究
表明一些农药可以改变细胞生物膜的结构，影响
生物膜的功能，结果造成藻类细胞的毒害效
应［19］。据此推断，WAF 这种脂溶性的物质也正
是通过破坏细胞质膜从而使藻细胞受到毒害。
另外，本实验研究了 WAF 对小新月菱形藻
C、N 稳定同位素组成的影响，实验结果表明，
第 4 期 刘 瑀，等:原油分散液对小新月菱形藻 C、N稳定同位素组成的影响 507
WAF在低浓度(≤1． 0 mg /L)作用下，藻细胞的
δ13C、δ15 N 值趋于增大，而较高浓度(≥5． 0 mg /
L)则使藻细胞的 δ13 C、δ15 N 值趋于变小。这表
明，微藻类的 C、N稳定同位素组成能够从一定程
度上反映污染程度，因此可作为海洋溢油污染监
测的一种新指标。
参考文献:
［1］王君丽，刘春光，冯剑丰，等．石油烃对海洋浮游植物生长的
影响研究进展［J］．环境污染与防治，2011，33(4) :81-86．
［2］黄逸君，江志兵，曾江宁，等．石油烃污染对海洋浮游植物群
落的短期毒性效应［J］． 植物生态学报，2010，34(9) :
1095-1106．
［3］GB 17378． 4-2007，海洋监测规范 第 4 部分:海水分析［S］．
［4］赵 文． 水生生物学［M］． 北京:中国农业出版社，2005:
515-518．
［5］李合生．植物生理生化实验原理和技术［M］．北京:高等教育
出版社，2000:214-217．
［6］ GALTSOFF P S，PＲYTHEＲCH H F，SMITH Ｒ O，et al． The
effects of crude oil pollution on oysters in Louisiana waters［J］．
The Scientific Monthly，1935，43(1) :121-129．
［7］张 蕾，王修林，韩秀荣，等．石油烃污染物对海洋浮游植物生
长的影响———实验与模型［J］．青岛海洋大学学报:自然科学
版，2002，32(5) :804-810．
［8］GILDE K，PINCKNEY J L． Sublethal effects of crude oil on the
community structure of estuarine phytoplankton［J］． Estuaries and
Coasts，2012，35(3) :853-861．
［9］陶功华．低剂量兴奋效应作用机制的研究进展［J］．中山大学
研究生学刊:自然科学、医学版，2007，28(1) :16-21．
［10］田 丹，赵 文，王 媛，等．镉胁迫对两种海洋微藻生长和抗氧
化系统的影响［J］． 大连海洋大学学报，2010，25(5) :
417-427．
［11］林 冬，朱 诚，孙宗修．镉敏感水稻突变体在镉胁迫下活性氧
代谢的变化［J］．环境科学，2006，27(3) :561-566．
［12］王海霞，刘 瑀，关春江，等．营养条件对微藻碳、氮稳定同位
素组成的影响［J］．中国环境科学，2014，34(3) :727-733．
［13］VUOＲIO K，MEILI M，SAＲVALA J． Taxon-specific variation in
the stable isotopic signatures (δ13 C and δ15 N)of lake phyto-
plankton［J］． Freshwater Biology，2006，51(5) :807-822．
［14］ APＲAIZ I，CAJAＲAVILLE M P，CＲISTOBAL S． Peroxisomal
proteomics:Biomonitoring in mussels after thePrestige＇s oil spill
［J］． Marine Pollution Bulletin，2009，58(12) :1815-1826．
［15］WU Y Y，XU Y，LI H T，et al． Effect of acetazolamide on stable
carbon isotope fractionation in Chlamydomonas reinhardtii and
Chlorella vulgaris［J］． Chinese Science Bulletin，2012，57(7) :
786-789．
［16］洪义国．硝酸盐氮氧稳定同位素分馏过程记录的海洋氮循
环研究进展［J］．地球科学进展，2013，28(7) :751-764．
［17］NEEDOBA J A，HAＲＲISON P J． Influence of low light and a
light:Dark cycle on NO3 － uptake，intracellular NO3 －，and ni-
trogen isotope fractionation by marine phytoplankton［J］． Journal
of Phycology，2004，40(3) :505-516．
［18］ NEEDOBA J A，SIGMAN D M，HAＲＲISON P J． The mecha-
nism of isotope fractionation during algal nitrate assimilation as
illuminated by the 15N /14 N of intracellular nitrate［J］． Journal
of Phycology，2004，40(3) :517-522．
［19］沈国兴，严国安，彭金良，等．农药对藻类的生态毒理学研究
II:毒性机理及其富集和降解［J］． 环境科学进展，1999，7
(6) :131-138．