全 文 ：第35卷第8期
2014年8月
太 阳 能 学 报
ACTA ENERGIAE SOLARIS SINICA
Vol. 35, No. 8
Aug., 2014
收稿日期：2012-05-12
基金项目：浙江省重大科技专项（2006C11015）；浙江省重点科技创新团队（2009R50012-11）；浙江省新苗人才计划（Y201224695）；
浙江工业大学大学生课外科技基金
通信作者：陆向红（1971—）女，博士、副教授，主要从事生物质能源工程方面的研究。luxh@zjut.edu.cn
文章编号：0254-0096（2014）08-1536-05
N/P比及氮盐浓度对眼点拟微绿球藻培养密度和
油脂含量的影响
窦 晓，陆向红，卢美贞，薛 蓉，晏荣军，计建炳
（浙江工业大学化学工程与材料学院，浙江省生物质燃料利用技术研究重点实验室，杭州 310014）
摘要：研究N/P比及NaNO3浓度对眼点拟微绿球藻生长密度和油脂含量的影响。设计 4个不同N/P比（=1∶1，4∶1，
16∶1，32∶1）和 6个不同NaNO3浓度（0.025、0.075、0.225、0.450、0.900、1.350 g/L）。实验结果表明：N/P比及NaNO3浓
度均对眼点拟微绿球藻的生长密度和油脂含量有很大影响。当NaNO3浓度为 0.225 g/L，N/P比为 4∶1时，其油脂含
量和生物量最高，分别为 41.20%和 2.53 g/L。实验找到眼点拟微绿球藻高油脂含量和高生长密度的N/P比和NaNO3
浓度的最佳结合点，为眼点拟微绿球藻能够用来生产生物柴油提供实验依据。
关键词：生物柴油；眼点拟微绿球藻；N/P比；氮盐浓度
中图分类号：TE669 文献标识码：A
0 引 言
微藻具有光合效率高、增长速度快、培养条件
简单、含油量高等特点，是一种潜在的可替代石化
燃料的生物质燃料［1］。目前，微藻制油的产业化进
程受微藻产油的生产成本制约。为了降低成本应
对各生产环节进行技术改进和突破，优良藻种的筛
选和产油条件的探索仍是研究的重点之一［2］。
眼点拟微绿球藻（Nannochloropsis oculata）生长
速度快、总脂肪含量占细胞干重的 31%~68%［1］，是
一种富有前景的生物柴油原料。N、P 是藻类生长
的主要限制性营养盐因子，也是水体富营养化的重
要来源［3］。充分的 N、P等营养盐基础（尤其是 N/P
比）是促使藻细胞快速分裂、增殖的前提条件［4］。培
养基中的氮源种类和浓度能影响微藻的生长［5~8］、微
藻的总脂含量［5，9］、饱和与不饱和脂肪酸的比例［6］。有
关 N、P对微绿球藻生长影响的研究较多［5~9］，黄旭雄
等［6］报导了氮源种类及浓度对微绿球藻营养价值的
影响；黄翔鹄等［7］报导了微绿球藻对氮和磷营养盐
需求的研究；王丽卿等［8］报导了不同营养盐浓度下
微绿球藻的生长及水体中氮磷的变化。这些研
究找到了适于微绿小球藻生长的氮源及其最佳浓
度。Attilio Converti 等［9］不仅研究了氮源种类及其
浓度对微绿小球藻生长速率的影响，而且研究了氮
源及其浓度对微绿小球藻油脂积累的影响。魏
东等［5］报导了氮源和 N/P 比对眼点拟微球藻的生
长、总脂含量和脂肪酸组成的影响。
虽然上述研究找到了微绿球藻脂类积累的最佳
氮源以及氮盐浓度和 N/P比对微绿球藻油脂积累的
影响，但尚未见在改变氮盐浓度和 N/P比以实现眼
点拟微绿球藻高密度培养的前提下仍能保持高含油
量的相关报道。本文研究氮盐浓度和 N/P比对眼点
拟微绿球藻生长密度和油脂含量的影响，获得平衡
微藻生物量和油脂含量的适宜培养条件，探索用眼
点拟微绿球藻作为生物柴油原料的可能性。
1 材料和实验方法
1.1 材 料
试 验 用 眼 点 拟 微 绿 球 藻（Nannochloropsis
oculata）来自海洋生物种质库，经过涂布平板的方法
纯化之后，保存待用。
8期 窦 晓等：N/P比及氮盐浓度对眼点拟微绿球藻培养密度和油脂含量的影响 1537
1.2 实验过程
1.2.1 眼点拟微绿球藻的扩种
选取纯化后镜检无原生动物污染、生长状况良
好的眼点拟微绿球藻，在恒温光照培养箱，250 mL
锥形瓶中进行扩种培养，培养箱温度为 20 ℃，连续
光照，光照强度 3000 lx，培养期间每天定时摇动 3
次。将培养至对数期的眼点拟微绿球藻放入 5 L的
培养瓶中进一步扩种培养，培养过程连续充入无菌
空气，自然光照，培养温度 20~25 ℃。采用 F/2培养
基［10］，采用用海水晶配制成的人工海水，pH=8.0。
1.2.2 实验设计
第一步：取 2 L 培养至对数期的眼点拟微绿球
藻藻液，3000 r/min离心去除营养盐，接入不含 N、P
的 F/2培养基中饥饿培养 3 d。
第二步：配置不同氮盐浓度、N/P比的培养液。
1）调节 NaNO3浓度，使其分别为基准 F/2培养
基中的 NaNO3浓度 1/3、1、3 倍，即分别为 0.025、
0.075、0.225 g/L。
2）调节 NaH2PO4·2H2O 浓度，使培养液中 N/P
比分别为 1∶1、4∶1、16∶1、32∶1。
3）其余营养盐种类及浓度与基准 F/2 培养基
相同。表 1为不同培养液中 NaNO3和 NaH2PO4·2 H2O
的含量（质量分数）。
表 1 不同培养液中NaNO3和NaH2 PO4· 2H2O的含量
Table 1 The concentration of NaNO3and NaH2PO4·2H2O in
different medium
NaNO3/
mg·L-1
25
75
225
N/P比
1∶1
20
60
180
4∶1
5
15
45
16∶1
1.25
3.75
11.25
32∶1
0.625
1.870
5.630
第三步：将饥饿培养 3 d 后的眼点拟微绿球藻
以 1∶4的比例接种至 1 L的锥形瓶中，在连续通入
无菌空气，自然光照，室内温度 20~25 ℃，pH=8.0的
条件下培养。每隔 24 小时取 200 μL 的藻液分析
藻细胞密度。培养至达到稳定期后 3 d，收集微藻，
测定微藻中油脂含量。
第四步：在最佳 N/P 比下，进一步细化氮盐浓
度，找出最适合眼点拟微绿球藻生长和油脂积累的
氮盐浓度。
1.3 分析方法
1.3.1 眼点拟微绿球藻细胞密度的测定
用鲁戈式试剂（Lugol’s iodine solution）染色固
定后，用血球计数板在显微镜（40×10）下测量藻细
胞数量，每组测量 3次，取平均值。
1.3.2 眼点拟微绿球藻油脂含量的测定
在培养至稳定期后 3 d 的藻液中加入少量
Al2（SO4）3絮凝剂，静置 1 d后，取藻泥用清水多次离
心洗涤除去营养盐后，在 70 ℃的烘箱中烘干至恒
重，采用改良酸法［9］，测定藻粉中油脂的含量。
2 结果与讨论
2.1 N/P比对眼点拟微绿球藻生长密度的影响
在 NaNO3浓度分别为 0.025、0.075、0.225 g/L
时，N/P比对眼点拟微绿球藻生长速率及密度的影
响见表 2 和图 1。表 2 和图 1 显示：N/P 比对眼点
拟微绿球藻的生长速率及密度具有较大影响，在 3
种不同的氮盐浓度下，N/P比对眼点拟微绿球藻的
生长速率及密度的影响一致，随着 N/P 比的增大，
眼点拟微绿球藻的生长密度和生长速率先增大后
减小，在 N/P比=4∶1时，眼点拟微绿球藻的生长速
率、生长密度及生物量均达到最大。由此可见，
N/P 比=4∶1 为眼点拟微绿球藻生长最适 N/P 比。
黄翔鹄等［7］通过考察 NaNO3浓度和 N/P比对眼点拟
微绿球藻的比增长率和相对生长常数的影响，得到
NaNO3浓度为 0.137 g/L（NO3-N 浓度为 22.64 mg/L）
时，最适于眼点拟微绿球藻生长的 N/P 比=7.31
（PO4-P浓度为 3.096 mg/L）；而魏 东等［5］的研究表
明当 NaNO3 浓度为 0.44 g/L（即 NO3-N 浓度为
72.5 mg/L）时，最适于眼点拟微绿球藻生长的
N/P比=20。作者分析，这可能由三者所用的基础培
养基、接种密度、微藻的培养时间不同所致。
表 2 NaNO3浓度和N/P比对眼点拟微绿球藻生物量的影响
Table 2 The effects of NaNO3 concentration and
N/P ratios on the growth density of N. oculata
N/P比
1∶1
4∶1
16∶1
32∶1
NaNO3浓度/g·L-1
0.250
0.53
0.63
0.43
0.48
0.750
1.15
1.29
0.96
0.61
0.225
1.76
2.53
1.82
1.33
1538 太 阳 能 学 报 35卷
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
0 5 10 15
 /d




×1
04
/



a. CNaNO3 = 25 mg/L
9.0
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.00 5 10 15
 /d




×1
05
/



b. CNaNO3 = 75 mg/L
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0 5 10 15
 /d




×1
05
/



c. CNaNO3 = 225 mg/L
N:P=1:1 N:P=4:1 N:P=16:1 N:P= 32 :1
图 1 N/P比对眼点拟微绿球藻生长密度的影响
Fig. 1 The effects of N/P ratios on the growth density of
N. oculata
2.2 NaNO3浓度对眼点拟微绿球藻生长的影响
N/P 比=4∶1时，NaNO3浓度对眼点拟微绿球藻
生长速率及密度的影响见图 2。从图 2可看出，在
N/P比=4∶1的条件下，NaNO3浓度从 0.025 g/L增大
到 0.225 g/L时，眼点拟微绿球藻的生长速率和生长
密度随 NaNO3浓度的增大而增大；NaNO3浓度从
0.225 g/L增大到 0.450 g/L，氮盐浓度的增大对眼点
拟微绿球藻生长密度和生长速率的影响不大；当
NaNO3浓度达到 0.45 g/L后，继续增大 NaNO3浓度，
眼点拟微绿球藻的生长密度和生长速率急剧减
小。N/P 比=4∶1，NaNO3浓度 0.225 g/L 为眼点拟微
绿球藻最适的生长条件，此时眼点拟微绿球藻的生
物量可达 2.53 g/L藻液。
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0 5 10 15
 /d




×1
04




CNaNO3=25mgL CNaNO3 =75mgL
CNaNO3 =225mgL CNaNO3 =450mgL
v NaNO3 =900mgL CNaNO3=1350mgL
图2 氮盐浓度对眼点拟微绿球藻生长密度的影响
Fig. 2 The effects of NaNO3concentration on the growth
density of N. oculata
在微藻的培育过程中，影响微藻繁殖和生长的
因素很多，其中营养成分、光照、盐度为最。在微藻
生长所需的营养成分中，N和 P是两种非常重要的
元素。在保持 N/P比不变的条件下，随着 NaNO3浓
度的增大，培养液中 N、P含量均增大，细胞的分裂、
增值速率和生长速率加快，因此微藻的细胞密度和
生物量加大。随着微藻细胞密度的增大，细胞之间
的遮光作用将影响微藻的光合作用，当这种影响起
主导地位时，NaNO3浓度的增大对微藻繁殖、生长的
促进作用就会减弱，再继续增大 NaNO3浓度，溶液
中的盐度增大，过大的盐度不利于微藻的生长，此
时藻液中的细胞密度和微藻的生物量减小。
2.3 N/P比对眼点拟微绿球藻油脂含量的影响
本文分别测量了 NaNO3浓度分别为 0.075 和
0.225 g/L时，不同 N/P比对眼点拟微绿球藻油脂积
累量的影响，结果见表 3。表 3显示 N/P 比对眼点
拟微绿球藻油脂含量有较显著的影响，随着 N/P比
的增大，眼点拟微绿球藻的脂质含量先增大后减
小。在 NaNO3浓度为 0.075 g/L，N/P 比为 4∶1 和
16∶1时，眼点拟微绿球藻的脂质含量极相近，高于
其他 N/P 比条件下的含脂量。在 NaNO3浓度为
0.225 g/L 时，N/P 比=4∶1 对应的藻的含脂量最高。
由此可见，N/P比=4∶1为最适于眼点拟微绿球藻积
累油脂的 N/P 比。魏 东等［5］研究了 N/P 比对眼点
拟微绿球藻脂含量的影响：N/P比从 10增大到 90，
微藻的脂含量从 32.46%减小到 20%，该结果与本文
较相近。
8期 窦 晓等：N/P比及氮盐浓度对眼点拟微绿球藻培养密度和油脂含量的影响 1539
表3 N/P对眼点拟微绿球藻油脂含量的影响（%）
Table 3 The effects of N/P ration on the lipid content of
N. oculata（%）
N/P比
1∶1
4∶1
16∶1
32∶1
NaNO3浓度/g·L-1
0.075
21.56
26.69
27.06
20.86
0.225
20.86
41.20
31.88
28.63
2.4 NaNO3浓度对眼点拟微绿球藻油脂含量的影响
N/P 比=4∶1 时，NaNO3浓度对眼点拟微绿球藻
油脂含量的影响结果见图 3。图 3显示 NaNO3浓度
对眼点拟微绿球藻脂含量的影响很显著。在相同
的 N/P 比下，随着 NaNO3浓度的增大，眼点拟微绿
球藻的脂含量先增大后减小，在 NaNO3浓度为
0.225 g/L 时，眼点拟微绿球藻的脂含量高达
41.20%，明显高于其他 NaNO3浓度水平时的脂含
量。这可能是因为 NaNO3浓度为 0.225 g/L 是眼点
拟微绿球藻的吸收饱和浓度，到了稳定期，培养液
已处于缺氮环境，缺氮环境有利于眼点拟微绿球藻
油脂的积累［9］，继续增大氮盐浓度不能造成稳定期
的缺氮环境，所以不利于眼点拟微绿球藻油脂的积
累。Attilio Converti等［9］发现 NaNO3浓度从 0.075 g/L
增大到 0.300 g/L时，眼点拟微绿球藻的油脂含量从
15.86%减小到 7.88%。该结论与本文结论均符合
“氮缺陷有利于微藻油脂积累”的理论。然而，相对
于本文中微藻的脂含量，文献［11］所获得的眼点拟
微绿球藻的脂含量低得多，这可能是因其未考察磷
浓度对微藻油脂含量的影响，眼点拟微绿球藻未在
合适的磷浓度下培养。
50
40
30
20
10
0
75 225 450 900 1350
NaNO3/mg·L
1




/%
图 3 NaNO3浓度对眼点拟微绿球藻脂含量的影响
Fig. 3 The effects of NaNO3 concentration on the growth
density of N. oculata
综合考虑 N/P 比和氮盐浓度对眼点拟微绿球
藻生长密度和油脂含量的影响，在 N/P 比为 4∶1，
NaNO3浓度为 0.225 g/L时，眼点拟微绿球藻不仅油
脂含量较高，而且能达到较高的生长密度，是眼点
拟微绿球藻最适合的培养条件。
3 结 论
N 和 P 对微藻的生长和油脂的积累有显著影
响，NaNO3浓度为 0.225 g/L时，随着 N/P比的增大，
眼点拟微绿球藻的生长密度、生物量以及油脂含量
均先增大后减小，在 N/P比=4∶1时，生物量和油脂
含量均达到最大；N/P 比=4∶1 时，随着 NaNO3浓度
的增大，眼点拟微绿球藻的生物量逐渐增大，油脂
含量先增大后减小，在 NaNO3浓度为 0.225 g/L 时，
油脂含量达到最大。调节培养基中 NaNO3 和
NaH2PO4的加入量可使微藻较大量积累生物质和油
脂。对眼点拟微绿球藻而言，培养基中 NaNO3浓度
为 0.225 g/L，N/P比为 4∶1时，生物量和油脂含量均
最大，分别为 2.53 g/L和 41.20%。
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EFFECT OF N/P RATIOS AND NITROGEN CONCENTRATION ON LIPID
CONTENT AND GROWTH DENSITY OF Nannochloropsis oculata
Dou Xiao，Lu Xianghong，Lu Meizhen，Xue Rong，Yan Rongjun，Ji Jianbing
（College of Chemical Engineering and Materials Science，Zhejiang University of Technology，
Zhejiang Province Key Laboratory of Biofuel，Hangzhou 310014，China）
Abstract：The effects of N/P ratios and nitrogen concentration on the lipid content and growth density of N. oculata were
studied. The N. oculata was cultivated under four different N/P ratios (N/P ratios=1∶1，4∶1，16∶1，64∶1) and six
different nitrogen concentrations level (0.025，0.075，0.225，0.450，0.900，1.350 g/L). It was found that both of the
lipid content and growth density was strongly influenced by the variation of test parameters. The lipid content grew to
41.20% and the growth density increased to 2.53 g/L when nitrogen concentration in the medium was 0.225 g/L，N/P
ratio was 4∶1. The optimized balance between high lipid content and growing density of N. oculata was found by adjusting
N/P ratio and nitrogen concentration，which would provide the experimental basis that N. oculata could be used to
produce bio-diesel.
Keywords：bio-diesel；Nannochloropsis oculata；N/P ratio；nitrogen concentration