全 文 ：刘 超，支崇远，李培林，等． 舟形藻生长运动过程对重金属 Cu2 +急性毒性胁迫响应研究［J］． 江苏农业科学，2016，44(3) :373 － 375．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2016． 03． 104
舟形藻生长运动过程对重金属 Cu2 +
急性毒性胁迫响应研究
刘 超，支崇远，李培林，易婷婷，张立微
(贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳 550001)
摘要:以浮游硅藻舟形藻(Planktonic diatoms Navicula)为受试藻，研究其在不同浓度 Cu2 +胁迫下生长和运动变化
特征。试验以 96 h半致死浓度(EC50)、叶绿素 a 含量及综合运动等指标研究 Cu
2 +对舟形藻的毒性响应。Cu2 +对舟形
藻 96 h EC50值为 4． 510 mg /L;Cu
2 +对舟形藻叶绿素 a 累积最大抑制率为 50%;运动速率在 1． 127 5 mg /L附近达到最
高，表现出“中毒兴奋”，随后速率线性下降。舟形藻叶绿素 a 含量对 Cu2 +反应不敏感，其运动状态可综合指示 Cu2 +
含量。利用舟形藻作为指示种来反映水体受 Cu2 +污染程度具有一定的可行性，同时可为农业、工业及生活污水中的
Cu2 +监测及评价提供依据。
关键词:舟形藻;Cu2 +胁迫;急性毒性;生长;运动
中图分类号:X52 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2016)03 － 0373 － 03
基金项目:国家自然科学基金(编号:41062005、30560011) ;贵州省科
技基金(编号:黔科合外 G 字［2012］7023) ;贵州省科技支撑计划
(编号:黔科合 SY字［2012］3178)。
作者简介:刘 超(1983—) ，男，江西九江人，硕士研究生，主要从事
湿地生态学研究。E － mail:276469607@ qq． com。
通信作者:支崇远，博士，教授，主要从事硅藻生理生态方面的研究。
E － mail:zhicy@ 126． com。
Cu2 +是舟形藻生长必需的微量营养元素之一，但当其超
过正常需求量时，Cu2 +会对硅藻产生毒性作用［1 － 2］。随着人
类对环境的各类干预，环境中 Cu2 +浓度大大提高［3］。由于重
金属有着毒性大、不易被代谢及易被生物富集等特点，严重威
胁着水生生物和人类的生存［4］。硅藻为水生生态系统的初
级生产者，在整个生态系统的物质循环与能量流动中有着重
要的作用［5］。进入硅藻中的 Cu2 +可通过水生食物链食物网
富集到高等动物体内，最终进入人体危害人类健康，同时
Cu2 +将影响硅藻细胞的种群增长，导致水生生态系统中初级
生产力下降，进而破坏整个生态系统的平衡［6 － 7］。
贵州省贵阳市的小车河湿地作为居民饮用水源地之一，
水质长期以来受到 Cu2 +等重金属的影响，其治理与监测备受
关注。本研究通过 Cu2 +的急性毒性胁迫对舟形藻的生长和
运动过程的观察［8］，对舟形藻在相同胁迫条件下表现出不同
的生长及运动特点进行了线性相关分析，为探索舟形藻对
Cu2 +毒性胁迫的响应、舟形藻生长和运动速率与 Cu2 +浓度间
的变化关系奠定研究基础［9］，同时为舟形藻作为指示种，监
测水环境重金属污染提供新角度［10］。
1 材料与方法
1． 1 试验藻种及培育方法
舟形藻采自贵州省贵阳市小车河湿地，应用微藻微吸管
分离方法分离。原液经沉淀、过滤(0． 45 μm 微孔滤膜)，
121． 3 ℃灭菌 30 min。采用自制培养液加富的灭菌原液中培
养。置于无菌培养室中培养，温度(20 ± 1)℃，光照度
66 μmol /(m2·s) ，光 －暗周期 12 h － 12 h，pH 值 7． 5 左右。
经预培养和扩大培养得到舟形藻纯种，在获得足够藻液后进
行试验。微藻培养瓶定时摇动 3 次 /d，预防附壁生长。
1． 2 试验仪器及设备
光学显微镜(深圳市新明光学仪器有限公司，XSP － 2CA
生物显微镜)、光学显微镜物镜测微尺(深圳市新明光学仪器
有限公司，C6 物镜测微尺)、电子秒表(PC2810)、照相机
(Nikon － COOLPIX5400)、载物片、血球计数板。
1． 3 试验方法
1． 3． 1 藻种扩大培养 试验藻种在自制培养液加富的灭菌
原液中进行扩大培养，自制培养基各成分质量浓度为:NH4Cl
15 mg /L，MgCl2 ·6H2O 12 mg /L，MgSO4·7H2O 15 mg /L，
KH2PO4 2． 3 mg /L，NaHPO4 50 mg /L，FeC6H5O7 · 5H2O
50 mg /L，Na2EDTA · 2H2O 45 mg /L，MnCl2 · 4H2O
160 mg /L，ZnSO4 25 mg /L，CoCl2·6H2O 10 mg /L，Na2MoO4·
2H2O 0． 007 mg /L，维生素 B12 0． 5 mg /L，维生素 B1 50 mg /L，
维生素 H 0． 5 mg /L。
1． 3． 2 急性毒性试验 试验设置 1 个空白组和 4 个试验组，
根据预试验结果各组中 Cu2 +的质量浓度分别为 0、1． 5、2． 5、
3． 5、4． 5 mg /L。硅藻初始含量为 70 000 cells /mL。每个质量
浓度设置 3 个平行组，试验所有容器和培养基均经过 121 ℃、
20 min高压蒸气灭菌。试验共进行 96 h，0、24、48、72、96 h取
样后，使用血球计数板观察及统计运动数据。观察时，摇匀培
养瓶至藻液颜色统一，每日定时取样，取 1 mL 充分混匀的藻
液，加适量鲁格氏固定液(Lugol)，混匀后取 200 μL 藻液用血
球计数板计数，每个样品计数 3 次，取平均值。之后按照下式
计算出抑制率 X =(I0 － I)/ I0 × 100%，以抑制率作图，利用加
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收稿日期:2015 －12 － 18
权直线回归法建立线性回归方程，并计算各时间段的半致死
浓度(EC50)值。
1． 3． 3 亚急性毒性试验 设置 1 个对照组和 4 个试验组，根
据急性毒性试验结果，设置质量浓度分别为 96 h EC50，96 h
EC50 /2，96 h EC50 /4，96 h EC50 /8。硅 藻 初 始 含 量 为
7 000 cells /mL。容器为 500 mL 三角培养瓶，培养体积为
200 mL。共进行 15 d，其他条件与“1． 1”节相同。在试验的
前 5 d每天对各组进行取样，之后每 2 d 取样 1 次，共取样 9
次，每次取样 10 mL，其中 5 mL 进行叶绿素 a 含量测定并对
硅藻细胞的运动状态进行观察。
1． 3． 3． 1 叶绿素 a含量测定 取 5 mL藻液，应用文献［11］
中叶绿素 a含量的测定方法，对硅藻叶绿素 a含量进行测定。
1． 3． 3． 2 舟形藻运动状态观察与分析 对舟形藻的运动过
程录像，利用血球计数板上线的交点记录硅藻的行动距离，并
用秒表计时，对计数框内硅藻的最大运动速率和平均运动速
率进行计算。舟形藻运动状态参数包括平均运动速率、最大
运动速率和运动硅藻占总数的比率。通过录像观察，对计数
框内硅藻进行计数，得出硅藻总数和 30 s内所有运动硅藻数
量，并记舟形藻运动 2 μm 所耗时间。以上过程按照计数框
内硅藻的数量重复 3 ～ 5 次，其中，最大运动速率取最大值，平
均运动速率取平均值，运动硅藻占总数的比率取各计数框中
运动硅藻总数占所有计数框中硅藻总数的比率。
2 结果与讨论
2． 1 Cu2 +急性暴露对舟形藻的影响
在不同质量浓度 Cu2 +胁迫下，舟形藻的生长曲线见图 1。
与空白组相比，添加 1． 5、2． 5 mg /L Cu2 +的试验组舟形藻的生
长受到一定的促进，且促进程度与 Cu2 +质量浓度呈正相关，
表现出明显的毒性兴奋效应。在 2． 5 mg /L试验组中，在 24 h
时抑制率为 － 2． 44%，之后呈线性增加;而在 3． 5 mg /L、
4． 5 mg /L 试验组中，在 96 h 时抑制率为 0． 23%、0． 56%，表
明其生长明显受到抑制。
使用加权直线回归法分析计算，Cu2 +对舟形藻各时间的
EC50和 95% 置信区间见表 1。各时间段 EC50值较为稳定，都
在 4． 510 mg /L左右，说明随时间的延长 Cu2 +对舟形藻的毒
性无降低，未产生长期毒性，不会对舟形藻产生持续性影响。
2． 2． 1 Cu2 +对舟形藻叶绿素 a 含量的影响 在不同质量浓
度 Cu2 +胁迫下的藻液，经过 15 d 培养，以叶绿素 a 的质量浓
度为指标的曲线见图 2。在开始胁迫的前 3 d 叶绿素质量浓
度有明显的增加趋势，与对照组差距很小，但随时间的推移Cu2 +
表 1 Cu2 +对舟形藻的半数致死浓度
时间(h) EC50(mg /L) EC50的 95%置信区间(mg /L)
24 1． 980 － 33． 19 ～ 37． 15
48 2． 593 － 50． 25 ～ 55． 44
72 3． 583 － 16． 96 ～ 24． 12
96 4． 510 － 14． 38 ～ 23． 40
对舟形藻叶绿素 a 含量的抑制作用渐渐增大，5 d 时
4． 510 mg /L 的质量浓度下对叶绿素的抑制率达到 50%，最终
抑制率持续下降稳定在 30%左右。表现出一定的质量浓度
计量效应。7 ～ 13 d叶绿素 a含量保持稳定，而在 15 d时，各
组叶绿素 a含量均略有增加，这可能与 Cu2 +被从离子态代谢
固化为相对稳定的化合物有关。
2． 2． 2 Cu2 +对舟形藻运动状态的影响
2． 2． 2． 1 Cu2 +对运动硅藻数量占总硅藻数量比率的影响
添加不同质量浓度 Cu2 +胁迫下的舟形藻，各组中运动硅藻数
量占总硅藻数量比率见图 3。由图 3 可知:在同等条件下随
时间增长运动硅藻数量占总硅藻数量的比率减小，暴露 1 d
后运动硅藻数量占总硅藻数量的比率未出现明显变化。在
2 ～ 5 d期间，随 Cu2 +质量浓度增高硅藻占总硅藻的比率出现
显著下降。随后，虽有一定降低趋势，但是变化相对较小。由
此可见 Cu2 +对运动硅藻的数量有一定影响。
2． 2． 2． 2 Cu2 +对硅藻平均运动速率的影响 经过 15 d的培
养，以最快运动速率为指标的曲线见图 4。前 1 ～ 3 d 速率变
化较稳定，两端相近，中间波动较大;之外其他的总体运动速
率都随质量浓度的增高而降低，但是在 4 d、2． 255 mg /L 以及
7 d、1． 127 5 mg /L 时出现 2 个异常值，平均运动速率分别达
到 1． 0、1． 3 μm/s，明显偏高。但是与该组其他慢速运动硅藻
相比，运动距离和时间均较短，快速运动 2 ～ 5 s 后就停止运
动或转为慢速运动。
2． 2． 2． 3 Cu2 +对硅藻最快运动速率的影响 经过 15 d的培
养，以最快运动速率为指标的曲线见图5。除1 d和15 d速
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率变化明显之外其他的总体运动速率都随质量浓度在
0． 563 75 mg /L 和 1． 127 5 mg /L 附近增高而增高，在
2． 255 mg /L 附近转而降低。但是在 4 d、1． 127 5 mg /L 以及
11 d、0． 563 75 mg /L 时出现 2 个异常值运动速率分别达到
0． 8、1． 03 μm/s，速度明显降低。但是与该组与其他慢速运动
硅藻相比，运动距离和时间均较短，快速运动 5 ～ 7 s 后就停
止运动或转为慢速运动。
3 结论
硅藻作为自然界中重要的初级生产者，对生态系统的稳
定起着重要作用。通过其在 Cu2 +胁迫下运动变化的研究，能
为在水环境评价监测、水污染治理等方面提供一定的理论依
据。利用硅藻种类、数量及变化作为评价水生态环境质量指
示物种的做法由来已久，而利用硅藻运动速率变化对水质中
不同污染离子浓度测定的研究相对很少。相关研究表明，在
众多除藻剂中铜的杀藻作用有效、稳定、价格低廉、且对人体
健康的毒性作用低，目前在国外已有大量使用［12 － 14］。
本试验就 96 h EC50值(4． 51 mg /L)来看，参照《水和废水
监测分析方法》的规定［11］为中毒，与小球藻(55． 62 mg /L)［15］
低毒差距较大。原因是不同的藻类由于生存方式、运动类型
及生存环境不同。另外部分 Cu2 +可能会被舟形藻富集代谢
为相对离子态更为稳定的化合物，对水生生物进而对水生生
态系统产生直接或间接的影响。
叶绿素 a含量对 Cu2 +的反应呈现一定的梯度变化，1 ～
5 d 和对照组相比，叶绿素 a 的累积较快，表现出“促进”作
用;6 ～ 11 d 后含 Cu2 + 各组与对照组出现一定差异(P ＜
0． 05)，而在同一天含 Cu2 +各组差异较小(P ＞ 0． 05)。可见
藻细胞中叶绿素 a含量对 Cu2 +反应敏感，少量 Cu2 +对叶绿素
a 含量的累积有明显促进作用，但是之后随质量浓度增大叶
绿素 a含量变化则逐渐降低，表现出一定的抑制作用;11 ～
15 d，叶绿素 a含量的累积出现一定的提高，可能与 Cu2 +被富
集代谢而浓度降低有关［16］。
Cu2 +急性毒性胁迫能显著影响舟形藻的运动速率。低
浓度 0． 563 75 ～ 1． 127 5 mg /L 区间内 Cu2 +胁迫能刺激舟形
藻运动，使其表现出毒物的“兴奋效应”，随着胁迫浓度的增
大和胁迫时间的延长，Cu2 +对舟形藻的运动表现出明显的抑
制效应，在 1． 127 5 mg /L附近达到最高之后，速率线性下降，
在 2． 255 mg /L趋近无胁迫速率。表明随着胁迫浓度的提高，
舟形藻细胞提高了对胁迫的适应能力，抗性得到一定的增强。
硅藻在受 Cu2 +污染水质处理的治理运用方面有一定的可
行性，同时对农业、工业及生活污水中的 Cu2 +监测方面有广阔
的应用前景［1，17］。本研究发现运动硅藻数量占总硅藻数量的
比率和平均运动速率在 2 ～3 d时变化较大，所以可以应用这 2
个指标在 2 ～3 d时的值来对 Cu2 +的毒性进行综合指示。
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