全 文 ：书收稿日期:2011 － 12 － 12;修回日期:2012 － 01 － 05
项目基金:国家重点基础研究发展计划(973) (2009CB724700)
通讯作者:谭小力(1968 －)男，汉族，副研究员，硕士生导师，研究方向为植物油脂代谢，E-mail:xltan@ ujs． edu． cn。
doi∶10. 3969 / j. issn. 2095 － 1736. 2012. 04. 001
舟形藻生长、品质特性及转化筛选标记研究
谭小力1，赵东华1，马忠岩1，李 环2，贾红华2，韦 萍2
(1． 江苏大学生命科学研究院，镇江 212013;
2． 南京工业大学生物与制药工程学院，南京 211816)
摘 要:研究了舟形藻(Navicula tenera)细胞表型和积累模式，利用索式抽提法和气质联用(GC-MS)方法对其进行
总油脂含量和脂肪酸组分的分析，并研究了舟形藻对氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、草胺膦(PPT)、庆大霉素
(Gen)、链霉素(Str)、遗传霉素(G418)、潮霉素(Hyg)以及氯霉素(Cm)这 8 种常用抗生素的敏感性。结果显示，舟
形藻细胞以沉积底部的生长模式积累;其总油脂含量占其干物质重量的 8. 31%，脂肪酸种类主要有 C16 ∶ 0，C16 ∶ 3
(n-4)和 C20 ∶ 5 (n-3) (EPA) ，分别占总脂肪酸的 64. 13%、15. 87%和 19. 62%;舟形藻对 Cm和 G418 非常敏感，对
Hyg较敏感，而对不同浓度的 Amp、Kan、Gen、Str以及 PPT极不敏感。为舟形藻基因工程筛选标记的确立，进而建立
其遗传转化系统奠定了基础。
关键词:舟形藻;油脂;脂肪酸;抗生素;筛选标记
中图分类号:Q949. 27;Q946 文献标识码:A 文章编号:2095 － 1736(2012)04 － 0001 － 04
Analysis of growth and quality of Navicula tenera and determination
of its selectable makers in genetic engineering
TAN Xiao-li1，ZHAO Dong-hua1，MA Zhong-yan1，LI Huan2，JIA Hong-hua2，WEI Ping2
(1． Institute of Life Sciences，Jiangsu University，Zhenjiang 212013;2． College of Biotechnology
and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 211816，China)
Abstract:The cell phenotype and accumulation pattern of Navicula tenera，a kind of marine unicellular eukaryotic microalgae，was in-
vestigated． The total lipid and fatty acids composition was analyzed by Soxhlet extraction and GC-MS． The sensitivities of Navicula ten-
era on eight kinds of antibiotics including Ampicilin (Amp) ，Kanamycin (Kan) ，Phosphinothricin (PPT) ，Gentamycin (Gen) ，Strep-
tomycin (Str) ，Hygromycin (Hyg) ，Geneticin (G418)and Chloramphenicol (Cm)were measured． The results showed that the cell
accumulation pattern of Navicula tenera was settling to the bottom of the medium． The dry mass of Navicula tenera contained 8. 31% of
total lipid that was mainly constituted by 64. 13% of C16:0，15. 87% of C16:3(n-4)and 19. 62% of C20:5(n-3) (EPA)． Navicula
tenera was extremely sensitive to Cm and G418 and was relatively sensitive to Hyg． However，it was not sensitive to Amp，Kan，PPT，
Gen，and Str whether their test concentrations high or not． The results provided important data in developing selectable makers in ge-
netic engineering of Navicula tenera．
Keywords:Navicula tenera;lipid;fatty acids;antibiotics;selectable marker
生物质能源作为一种来源广泛的可再生性能源，其
开发利用不仅有助于缓解化石燃料日益枯竭给全球经
济发展带来的危机，还可以减少主要温室气体的排放，
有利于维护生态平衡，改善人类生存环境［1］，在整个能
源系统中占有越来越重要的地位，发展生物能源已成为
目前世界能源结构战略性转变的一个方向，成为许多国
家和地区能源发展战略的重要组成部分［2 － 5］。微藻作
为第三代生物能源，在缓解不可再生性化石能源危机的
同时，也解决了由于大量使用大豆、玉米等传统生物燃
料所造成的“与人争粮”和“与粮争地”的严重现象。近
年来人们发现微藻不仅蛋白质含量高，还能为我们提供
多不饱和脂肪酸、多糖、色素等多种生物活性物质。此
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外，微藻是光合自养型植物，能够固定 CO2，减少温室效
应，还能够吸收废水中的有机物质、氮、磷及重金属等，
净化污水。
近年来，对于微藻的研究，无论是从海洋生物学还
是分子生物学角度，都取得了重大突破。目前，随着真
核微藻基因工程研究的广泛深入，衣藻已成为叶绿体、
线粒体与染色体三套基因组均能遗传转化的模式藻
类［6 － 7］。
除衣藻之外，小球藻也正在成为另一种单细胞真核
微藻转化系统藻种［8］。利用基因工程手段将外源基因
转化进入衣藻和小球藻，可以大大提高微藻的油脂和蛋
白质等含量，从而提高微藻的利用率。尽管衣藻和小球
藻作为真核藻类的模式生物研究已经十分深入，但是海
洋中还有大量的真核微藻具有作为生物能源的潜能，它
们中的大多数特性及其生长规律仍然不清楚，因此，其
它真核藻类的研究对于生物能源的开发具有重大的意
义。
舟形藻 (Navicula tenera) ，隶属于硅藻门，羽文硅藻
纲，舟形藻目，舟形藻科，舟形藻属，是一种典型的真核
单细胞藻类，是许多珍贵水生生物重要的饲料。舟形藻
在水污染处理方面有着非常重要的作用，它可以吸收污
水中的 N、P、Fe等物质，进行自养生长［9］。舟形藻含有
含量丰富的蛋白质，以及种类丰富的饱和与不饱和脂肪
酸。舟形藻藻株易于生长，容易获得很高的生物量。然
而，对于舟形藻油脂含量和脂肪酸含量和组分分析以及
基因工程手段分析的研究目前还很少。本研究利用索
式抽提和 GC-MS分析的方法对舟形藻的油脂含量和脂
肪酸含量及组分进行了分析，发现其含有多种有价值的
脂肪酸，例如用作生物燃油原料的短链脂肪酸以及用作
食品保健的多不饱和脂肪酸 EPA。然而本研究发现其
总含油量只占干物质总量的 8. 31%，因而我们希望可以
通过基因工程手段提高其含油量和有价值脂肪酸的含
量。我们利用 8 种基因工程常用的抗生素对其进行抗
生素敏感性分析，从而确定舟形藻基因工程改良筛选抗
生素，为基因工程改造生物质能源材料奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 藻种及培养基
舟形藻由徐州师范大学惠赠，试验所用原始培养基
是由参考文献［10］优化而成。
1. 1. 2 试剂及仪器
卡那霉素(Kan)、氨苄青霉素(Amp)、氯霉素
(Cm)、链霉素(Str)、遗传霉素(G418)、潮霉素(Hyg)均
购自北京拜尔迪生物有限公司。PPT(草胺膦)购自 Sig-
ma公司。庆大霉素(Gen)购自徐州莱恩药业有限公司。
气质联用仪为 Thermo 公司 Trace GC ULTRA /ITQ1100。
722 型分光光度计，酶标仪，96 孔板、12 孔板，带螺旋帽
的玻璃管，恒温水浴锅均为国产。
1. 2 方法
1. 2. 1 藻类的培养
在 500 mL培养基中进行，光照时间 16 h /d，光照强
度为 1500 lx。培养温度为 25℃。在抗生素敏感性实验
中，取 12 孔平板进行培养，每个孔取 5 mL 培养基进行
培养。培养条件:温度约为 25℃培养箱中培养，光照时
间 16 h /d，光照强度为 2500 lx。
1. 2. 2 共聚焦显微镜观察舟形藻细胞
利用型号为 Leica TCS SP5 II 的 Leica 共聚焦显微
镜观察舟形藻细胞。520 nm ～ 560 nm 激发波长观察叶
绿体，白光观察整个细胞轮廓。
1. 2. 3 总油脂含量的测定
称取大约 5 g处于对数生长期的舟形藻干粉样品，
滤纸包裹样品，将其放置于索式抽提杯当中，添加 150
mL石油醚连续抽提油脂 8 h。蒸发溶剂后烘干并称量
剩余材料重量，计算舟形藻干物质油脂含量。
1. 2. 4 脂肪酸的甲酯化和 GC-MS分析
利用50 mL三角瓶培养一定数量的舟形藻，待培养到
对数生长期，离心收集湿藻，过夜烘干。待湿藻彻底烘干
后，液氮研磨至粉末状。取 0. 1 g烘干的微藻材料装入带
有螺旋帽的玻璃管中，加入 1. 5 mL 的提取 buffer(甲醇含
2. 5%浓硫酸 V/V) ，80℃，2 h(由于提取 buffer 挥发严
重，可选用 60℃ ～65℃，4 h) ，同时加入 C15 ∶ 0 内标(这种
脂肪酸在一般生物样品中通常是不含有的) ，冷却至室温，
然后加入 0. 9%(V/V)NaCl 和 1 mL 正己烷，振荡混匀，
4000 r /min，室温离心10 min，取上清，真空抽干(室温下过
夜晾干) ，沉淀用 50 μL乙酸乙酯溶解。
取 2 μL已经用乙酸乙酯处理好的样品加入气质联
用仪进行测定。色谱条件:初始温度 120℃，保留 1 min，
首先以 10℃ /min 的速度升温至 150℃，然后以每分钟
4℃的速度升温至 250℃，保留 10 min。进样温度 260℃，
分馏比为 20 ∶ 1，载气流速为 1 mL /min，截口温度 250℃。
质谱条件:溶剂延迟 3 min，离子源温度 230℃，扫描范围
29 ～ 450 amu。定量采用内标法，即在样品中加入已知
量的样品中不会含有的 C15 ∶ 0 作为内标，各组分定量时
以其峰面积与内标(C15 ∶ 0)峰面积的比值为参数。
表 1 舟形藻对不同抗生素敏感性实验的测试浓度
Table 1 Different concentrations of antibiotics to Navicula tenera
Antibiotics Concentrations(μg /mL)
Amp 0 100 300 500
Kan 0 100 300 500
PPT 0 60 80 100
Gen 0 100 300 500
Str 0 100 300 500
Hyg 0 100 300 500
G418 0 100 300 500
Cm 0 100 300 500
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1. 2. 5 不同浓度的 8 种抗生素对舟形藻生长影响的测
定
取处于对数生长期的舟形藻进行接种，接种初始
OD680为 0. 2(接种前离心排除原培养基的影响) ，分别在
含有不同浓度的 Amp、Kan、PPT、Gen、Str、Hyg、G418 和
Cm的培养基当中培养，各种试验抗生素浓度见表 1。每
组设 3 个平行对照，每 2 d吸 200 μL于 96 孔板上，在酶
标仪中测定 OD680，绘制藻细胞生长曲线。
2 结果与分析
2. 1 舟形藻表型的观察和生长模式
利用共聚焦显微镜(Leica TCS SP5 II)观察舟形藻
细胞，舟形藻细胞通常以单个细胞形式存在，细胞呈现
长梭形，呈舟状，藻细胞长度约为 18. 9 μm，细胞中心处
为细胞核，核周围红色部分为叶绿体(如图 1A)。舟形
藻细胞大量积累时，细胞沉积底部生长，而莱茵衣藻的
藻细胞积累模式则是悬浮于培养基中(如图 1B)。
图 1 舟形藻细胞表型和藻细胞积累模式
Fig 1 The cell phenotype and accumulation pattern of Navicula tenera
A—共聚焦显微镜观察下处于稳定期的舟形藻细胞，其中红色区域
为叶绿体部分，中央为细胞核，Bar = 7. 5 μm;B—处于对数期的舟形
藻细胞(左)和莱茵衣藻细胞(右)的积累模式。
舟形藻细胞积累模式为沉积底部(图 1B) ，与莱茵
衣藻等不同。这种积累方式有利于舟形藻的收获，从而
使其收获过程耗能大大减少，这对于减少生物质能源的
生产成本具有重要意义。
图 2 舟形藻几种脂肪酸的气相色谱(GC)图像
Fig 2 The chromatogram of fatty acid methyl esters in Navicula tenera
2. 2 舟形藻总油脂含量及其脂肪酸组分分析
利用索式抽提的方法测定舟形藻总油脂含量，结果
表明，舟形藻的总油脂含量占其干物质重量的 8. 31%。
而利用 GC-MS分析结果显示，在舟形藻中检测到 C14 ∶
0、C16 ∶ 0、C16 ∶ 3(n-4)和 C20 ∶ 5(n-3) (EPA)四种脂肪
酸(如图 2)。在所测得的脂肪酸当中，饱和脂肪酸C14∶
0、C16 ∶ 0 占总脂肪酸的百分含量分别为 0. 38%、
64. 13%;多不饱和脂肪酸 C16 ∶ 3(n-4)以及 C20 ∶ 5(n-
3) (EPA)占总脂肪酸百分含量分别为 15. 87%、
19. 62%(表 2)。结果显示，舟形藻的脂肪酸特点是 C16
∶ 0 脂肪酸含量最高，C16 ∶ 3 和 C20 ∶ 5(EPA)两种多不
饱和脂肪酸含量也较高。
表 2 舟形藻的脂肪酸组成及含量
Table 2 Composition and content of fatty acid in Navicula tenera
脂肪酸 出峰时间(min) 占总脂肪酸 (%)
C14 ∶ 0 11. 15 0. 38
C16 ∶ 3(n-4) 14. 98 15. 87
C16 ∶ 0 15. 62 64. 13
C20 ∶ 5(n-3) 18. 88 19. 62
硅藻门主要含 C14 ∶ 0、C16 ∶ 0、C16 ∶ 1(n-7)、C16 ∶ 3
(n-4)及 C20 ∶ 5(n-3)脂肪酸［11］，与其他种类的微藻相
比，硅藻门藻类总油脂含量略高于大多数其他种类的微
藻，并且其中的 C16 ∶ 0 和 C20 ∶ 5 (n-3) (EPA)也相对
较高［12］。图 2 显示，舟形藻的短链脂肪酸和长链不饱和
脂肪酸含量相对丰富，其中 C16 ∶ 0 饱和脂肪酸适合制备
生物柴油，C20 ∶ 5(n-3) (EPA)具有良好的保健与药用
价值。因此，舟形藻对于生物质能源的开发和医药方面
的利用具有广阔的前景。
2. 3 舟形藻对 8 种不同浓度抗生素的敏感性分析
为了研究舟形藻对几种常用基因工程筛选抗生素
的敏感性，将对数期的舟形藻细胞分别接种到含有不同
浓度的 Amp、Kan、PPT、Gen、Str、G418、Hyg和 Cm这 8 种
抗生素的培养基当中培养(表 1) ，接种初始浓度 OD680
均为 0. 2。舟形藻在含不同浓度抗生素的培养基中培养
两周时间生长情况如图 3 所示。图 3A和图 3B显示，舟
形藻在添加有终浓度为 100、300、500 μg /mL 的 Amp 和
Kan的培养基中生长情况与对照基本没有差异。且均
能正常生长，表明舟形藻对于 Amp 和 Kan 极不敏感。
图 3C显示，舟形藻在添加有终浓度为 60、80、100 μg /
mL的 PPT的培养基中同样能够正常生长，生长状况与
对照无明显差异，表明舟形藻对 PPT 也极不敏感。图
3D和图 3E 显示，舟形藻在添加有终浓度为 100、300
μg /mL的 Gen和 Str的培养基中均能够正常生长，但是，
从第 4 d 起，舟形藻在添加有终浓度为 500 μg /mL 的
Gen的培养基中生长情况较对照开始变慢，从第 8 d 起，
舟形藻在添加有终浓度为 500 μg /mL的 Str的培养基中
生长情况较对照同样开始变慢，但变化幅度均不明显。
说明舟形藻对 Gen和 Str仍然不敏感。图 3F显示，舟形
藻在添加有终浓度为 100、300 μg /mL 的 Hyg 的培养基
中生长与对照组略有差异，并且随着抗生素浓度的增加
抑制作用逐渐增加，但变化幅度仍不明显。值得注意的
是，从第 8 d起，舟形藻在添加有终浓度为 500 μg /mL的
Hyg的培养基中生长基本停止，并呈现逐渐衰亡的趋
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势。表明舟形藻对较高浓度的 Hyg较为敏感。图 3G 显
示，舟形藻在添加有终浓度为 100 μg /mL 的 G418 的培
养基中生长情况与对照组无明显差异，但是，从生长第 2
d起，舟形藻在添加有终浓度为 300、500 μg /mL的 G418
的培养基中生长基本停止，并随着时间推移，藻细胞呈
现负增长趋势，并几乎全部死亡。表明舟形藻对于中高
浓度的 G418 敏感。图 3H 显示，从第 2 d 起，舟形藻在
添加有 100 μg /mL的 Cm的培养基中就几乎不生长，在
终浓度为 300、500 μg /mL的 Cm培养基中也出现了类似
的情况。为了排除配制 Cm 的溶剂乙醇的抑制作用，接
种舟形藻到添加体积与培养液终浓度为 100 μg /mL 的
氯霉素体积一致的乙醇的培养基中。如图 3I显示，乙醇
对舟形藻的毒害作用并不大，说明舟形藻对氯霉素极其
敏感。
图 3 8 种抗生素对舟形藻生长的影响
Fig 3 Effect of 8 kinds of antibiotics of different concentrations
on Navicula tenera
A—Amp;B—Kan;C—PPT;D—Gen;E—Str;F—Hyg;G—G418;
H—Cm;I—Ethanol。
图 3 显示，舟形藻对于几种常见的基因工程抗生素
敏感性各不相同。舟形藻对于不同浓度的 Amp、Kan 和
PPT均极不敏感，对于不同浓度的 Gen 和 Str 同样不敏
感，但对于高浓度的 Hyg较为敏感，中高浓度的 G418 以
及不同浓度的 Cm 均极其敏感。说明 Hyg、G418 和 Cm
都有成为舟形藻转基因筛选抗生素的潜力，而 Amp、Kan
可以用来控制舟形藻培养中细菌的污染。
然而，为了大规模筛选和鉴定阳性转基因个体，必
须有供转化的选择标记基因，特别是筛选标记基因。氯
霉素是通过干扰细胞内核糖体的蛋白质合成来抑制细
胞生长，并最终导致细胞死亡，其相应的抗性基因为
CAT基因，该基因编码的氯霉素乙酰转移酶(chloram-
phenicol acetyltransferase，CAT)可使氯霉素乙酰化而失
活［13］。我们的研究结果显示，舟形藻对氯霉素极为敏
感，可见氯霉素有望成为其基因工程选择标记。
G418 和卡那霉素同属氨基糖苷类抗生素，其作用
机制也是通过干扰核糖体中蛋白质的合成导致细胞死
亡，其所对应的选择标记基因为新霉素磷酸转移酶基因
(nptⅡ) ，nptⅡ编码的产物通过酶促磷酸化使氨基糖苷
类抗生素失活［14］。而 nptⅡ在植物基因转化中应用很
广，含有 nptⅡ基因的植物表达载体较为常见，容易获
得。我们的研究表明，舟形藻对中高浓度的 G418 均极
其敏感，所以 nptⅡ基因有望成为舟形藻的理想基因工
程选择标记。
3 结论
舟形藻这一单细胞真核藻类的生长方式是沉积底
部生长，大大方便了藻细胞的收集。利用 GC-MS 分析
得知舟形藻含有含量相对丰富的短链脂肪酸和多不饱
和脂肪酸，对于制备生物柴油和有价值的保健品提供了
必要条件。然而，索式抽提结果显示，舟形藻的总油脂
含量过低，因此，对其进行基因工程改造使其含油量和
有价值脂肪酸含量提高是一种必要途径。抗生素敏感
性实验表明，Hyg、G418 和 Cm具有成为舟形藻转基因藻
株理想的筛选抗生素。这些研究为进一步开发和利用
舟形藻这一生物质能源奠定了基础。
参考文献:
［1］Turner J A． A realizable renewable energy future［J］． Science，1999，285
(5428) :687．
［2］Mathews J A． Carbon － negative biofuels［J］． Energy Policy，2008，36
(3) :940 － 945．
［3］Steenberghen T，Lopez E． Overcoming barriers to the implementation of al-
ternative fuels for road transport in Europe［J］． Journal of Cleaner Produc-
tion，2008，16(5) :577 － 590．
［4］Hammond G，Kallu S，McManus M． Development of biofuels for the UK au-
tomotive market［J］． Applied Energy，2008，85(6) :506 － 515．
［5］Amigun B，Sigamoney R，Von Blottnitz H． Commercialisation of biofuel in-
dustry in Africa:a review［J］． Renewable and Sustainable Energy Reviews，
2008，12(3) :690 － 711．
［6］Skjnes K，Knutsen G，Kllqvist T，et al． H2 production from marine and
freshwater species of green algae during sulfurdeprivation and considerations
for bioreactor design［J］． International Journal of Hydrogen Energy，2008，
33(2) :511 － 521．
［7］Dismukes G C，Carrieri D，Bennette N，et al． Aquatic phototrophs:effi-
cient alternatives to land － based crops for biofuels［J］． Current Opinion in
Biotechnology，2008，19(3) :235 － 240．
［8］Hu Q，Sommerfeld M，Jarvis E，et al． Microalgal triacylglycerols as feed-
stocks for biofuel production:perspectives and advances ［J］． The Plant
Journal，2008． 54(4) :621 － 639．
［9］吴夏芫，李 环，韦 萍． 舟形藻的污水培养及条件优化［J］． 农业科学
与技术，2009，10(7) :68 － 73．
［10］Wu S Z，Zhang X P，Zheng W F，et al． Optimization of culture media for
spaceflight and nonspaceflight Navicula tenera［J］． Journal of Plant Re-
sources and Environment，2006． 15(2) :33．
［11］王海英，曾晓波． 三种硅藻产多不饱和脂肪酸分析［J］． 中国油脂，
2007，32(7) :76 － 78．
［12］王明清，迟晓元，秦 松，等． 海洋微藻总脂含量和脂肪酸组成的测
定［J］． 中国油脂，2008，33(11) :67 － 70．
［13］李 杰，刘 颖，黄洁虹，等． G418 和氯霉素作为转基因盐藻的抗生
素筛选标记［J］． 生物技术，2003，13(2) :22．
［14］王逸云，王长海． 小球藻基因工程选择标记研究［J］． 大连理工大学学
报，2007． 47(4) :509 － 514．
4
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