全 文 ：第 29卷第 1期
2011年 2月
上 海 交 通 大 学 学 报(农 业 科 学 版)
JOURNA L OF SHANGHAI JIAOTONG UNIVERS ITY (AG RICULT URAL SC IENCE)
Vol.29 No.1
　Feb.2011
文章编号:1671-9964(2011)01-0062-06 DOI:10.3969/ J.ISSN.1671-9964.2011.01.012
收稿日期:2010-05-07
基金项目:上海市科技兴农重点攻关项目[ 沪农科攻字(2006)第 4～ 9号]
作者简介:刘红梅(1983-),女 ,山东人 ,硕士生 ,主要研究方向:植物学(分子生物学);刘群录为本文通讯作者 , E-mail:liuql@sjtu.edu.cn
利用正交设计优化百子莲农杆菌转化条件的初探
刘红梅1 , 卓丽环2 , 刘群录3 , 徐有明1
(1.华中农业大学 园艺与林学学院 , 武汉 271017;2.上海农林职业技术学院 , 上海 201600;
3.上海交通大学 农业与生物学院 ,农业部都市农业(南方)重点试验室 , 上海 200240)
摘　要:利用正交试验设计 ,以百子莲胚性愈伤组织为受体材料 ,通过 GUS 染色确定遗传转化率 ,
对农杆菌介导的百子莲遗传转化体系进行了优化。结果表明 ,百子莲遗传转化优化体系为:愈伤组
织预培养7 d 、菌液浓度(OD600)为0.9 、侵染时间为5 min 、预培养培养基中乙酰丁香酮(AS)的浓度
为 50 μmo l·L-1 、侵染菌液中乙酰丁香酮(AS)的浓度为 100 μmo l·L-1 。在优化的转化条件下 ,
可提高农杆菌 EHA105菌株介导的百子莲愈伤组织遗传转化率。
关键词:百子莲;农杆菌;转化条件;正交设计
中图分类号:S 682.2+9　　　　文献标识码:A
Preliminary Study on Optimizat ion in Agrobacterium-Mediated
Transformat ion System for Agapanthus africanus by Orthogonal Design
LIU Hong-mei 1 , Z HUO Li-huan2 , L IU Qun-lu3 , XU You-ming 1
(1.Co llege of Ho rticultur e and Fo restry Sciences , H uaZhong Ag riculture Univ ersity , Wuhan 271017 , China;
2.Shanghai Vocational and Technical Colleg e of Ag riculture and Fo restry , Shanghai 201600 , China;
3.Key Labo rato ry o f U rban Ag riculture(South)of M inistry o f Ag riculture , Schoo l of Ag riculture and Biology ,
Shanghai Jiao tong Univer sity , Shanghai 200240 , China)
Abstract:In this article , the agrobacteriu-mediated genet ic t ransfo rmat ion system of Agapanthus a f ricanus
was optimized through o rthogonal design using the Agapanthus a f ricanus embryogenic calli as ma terials.
The genetic t ransfo rmation percentag e was determined by GUS staining.The results show ed that the
optimized system included:7 d pre-culturing , bacteria cell density (OD600)0.9 , 5 min infection incubation ,
50 μmo l·L-1 aceto sy ringone (AS)in the pre-cul ture media , 100 μmo l·L -1 acetosy ringone (AS)in the
infection culture media.Under the optimized condi tions , the genetic t ransfo rmation of Agapanthus
a f ricanus embryogenic calli mediated by EHA 105 strain increased.
Key words:Agapanthus a fricanus;Agrobacterium tumef actions;t ransformation conditions;orthogonal design
　　百子莲(Agapanthus a f ricanus),又名蓝百合 ,
是蓝百合属(Agapanthus)的多年生草本植物。其
花被白色至深蓝色 ,球形的伞形花序着生于长达
60 ～ 100 cm 的花葶上 ,是优良的切花花材。百子莲
株型优雅 ,具有大量肉质根 ,适应性较强 ,可用于庭
院和道路绿化。在西方发达国家百子莲早已是主流
第 1期 刘红梅 , 等:利用正交设计优化百子莲农杆菌转化条件的初探
高档花卉之一[ 1] 。
百子莲原产于南非 ,于 2003 年引入到我国[ 1] 。
为了丰富我国百子莲的种植资源 ,植物基因工程无
疑是创制百子莲新品种的重要手段。农杆菌介导的
植物转基因通常只有一个或少数几个外源基因插入
到植物染色体中 ,发生转基因沉默的几率较小;并且
农杆菌介导法操作简单 、转化机理明确 ,因此农杆菌
介导法在植物转基因研究中的得到了广泛应用[ 2] 。
百子莲分子育种在 2000 和 2001 年已有报道[ 3 , 4] 。
但是农杆菌转化率受多种因素影响 ,百子莲遗传转
化体系尚需进一步优化 。
农杆菌转化条件的优化有利于提高转化效率。
影响转化率的因素包括:外植体类型和基因型 、抗生
素浓度 、预培养时间 、预培养培养基中的 AS 的浓
度 、菌液的浓度 、侵染时间 、共培养时间 、共培养温
度 、共培养培养基中 AS 的浓度等;其中多数研究集
中在菌液浓度 、侵染时间 、预培养时间 、共培养时间 、
AS 浓度等条件[ 5] 。
为了提高百子莲愈伤组织的转化率 ,本试验通
过 5因素 4水平的正交设计优化了影响农杆菌转化
百子莲的 5个重要因素 ,包括预培养时间 、预培养培
养基中乙酰丁香酮浓度 、侵染菌液的浓度 、侵染时
间 、侵染菌液中的乙酰丁香酮的浓度。通过建立百
子莲农杆菌介导转化优化体系 ,为百子莲的分子育
种奠定基础。
1　材料和方法
1.1　材料
植物材料:百子莲(Agapanthus africanus)胚性愈
伤。上海交通大学农业与生物学院申晓辉教授提供。
菌 株 和 质 粒:农 杆 菌 (Agrobacterium
tume f aciens)菌 株 EHA105 , 内 含 双 元 载 体
pCAMBIA1304+CBF 1 ,由本实验室构建[ 6] 。该质
粒带有潮霉素磷酸转移酶基因和 CaMV35S 启动的
CBF1基因和 β-葡萄糖酸苷酶基因(GUS)(图 1)。
图 1　双元载体 pCAMBIA1304+CBF1 的示意图
Fig.1　Sketch map o f binar y vecto r pCAMBIA1304+CB F1
1.2　农杆菌培养
从-80 ℃冰箱中取出农杆菌 EHA105 菌株 ,
在冰上融化 。手指弹动混匀 ,用无菌枪头吸取 10
μL 菌液加入到含有卡那霉素(Kan)100 mg · L-1 、
利福平(Rif)50 mg · L-1和链霉素(SM)40 mg ·
L
-1的 2 mL 液体 LB培养基中 ,在 27 ℃下 200 r ·
min-1振荡过夜。用接种环蘸取菌液 ,在含有 Kan
100 mg ·L-1 、Rif 50 mg ·L-1和 SM 40 mg ·L-1
的 LB平板上划线 , 27 ℃培养 2 ～ 3 d。然后挑取
EHA105单菌落 ,接种到附加有 Kan 100 mg ·L-1 、
Rif 50 mg · L-1和 SM 40 mg · L-1的 6 mL 液体
LB培养基中 ,27 ℃、200 r ·min-1振荡过夜 。接下
来在 4瓶含有 60 mL LB液体培养基的中分别加入
1 mL 菌液 ,27 ℃、200 r ·min-1振荡培养 ,期间通过
检测 OD 600值监测菌株的浓度。到了试验所需浓度
后 ,将菌液进行分装到 4个无菌锥形瓶中 ,加入不同
量的 AS到所需浓度 ,加入相同体积的液体共培养
培养基 MS0待用 。
1.3　培养基
本实验所用培养基见表 1。
表 1　百子莲愈伤组织培养和农杆菌转化培养基
Tab.1　Media for Aga panthus af ricanus calli culture and
transformation via Agrobacterium
培养基
Medium
培养基成分
Component of media
愈伤诱导培养基
Calli inducing media
MS+0.5 mg· L-1 PIC(毒莠定
Picloram)
愈伤继代培养基
Calli subculture media
MS+1 mg· L -1 PIC
愈伤筛选培养基
Calli screening media
MS+0.5 mg · L-1 PIC +25
mg· L-1 Hygromycin + 200
mg· L-1 Carbbenici llin
愈伤预培养培养基
Calli pre-culture media
MS+0.5 mg · L-1 PIC+100
μmol· L-1 AS
体胚分化培养基
Somat ic emb ryo differential mida
MS 0
生根培养基
Rooting media
1/ 2 MS
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上 海 交 通 大 学 学 报(农 业 科 学 版) 第 29卷
1.4　百子莲愈伤的遗传转化
将百子莲愈伤切成 0.5 cm 大小 ,置于含有不同
浓度的 AS 培养基上进行黑暗下的预培养。预培养
后浸入到含有不同浓度 AS 和不同浓度的菌液中 ,
27 ℃、100 r ·min-1振荡培养 。侵染时间根据各个
试验确定。将愈伤组织滤出后 ,用无菌滤纸吸干表
面的菌液;然后放到共培养培养基上 ,于 25 ℃培养
箱中暗培养 2 d。共培养结束后 ,用 MS0液体培养
基冲洗愈伤组织 ,再用无菌滤纸吸干表面的培养基 ,
置于筛选培养基上进行筛选 。
1.5　正交试验设计
正交设计可以用较少的试验次数 ,获得更多的
信息[ 7] 。本研究优化的因素包括:愈伤组织的预培
养时间 、预培养培养基中 AS 浓度 、侵染菌液的
OD600值 、侵染时间以及侵染菌液中 AS 浓度 ,共 5
个因素;每个因素设 4 个水平 。因素和水平表见
表 2。
　　因为共有 5个因素 ,每个因素均有 4个水平 ,所
以可以选择 L16(45)正交设计表 ,共 16个试验 ,每个
试验重复 3次。试验方案和数据分析见表 3。
表 2　正交试验的因素与水平
Tab.2　Factors and levels of orthogonal experiment
因素
Factors
水平 Levels
1 2 3 4
预培养时间
Pre-culture time / d 1 3 5 7
预培养培养基中 AS浓度
AS concentration in pre-culture
media/(μmol· L-1)
0 50 100 150
菌液 OD600值
OD600 value of bacteria culture
0.3 0.6 0.9 1.2
侵染时间
Infection incubation time/min 5 15 25 35
菌液中 AS浓度
AS concent ration in bacteria
cul ture/(μmol· L -1)
0 50 100 150
表 3　L16(45)正交表设计及试验数据的极差分析
Tab.3　L16(45)orthogonal tests and range analysis of the data
试验号
Exp.No.
菌液浓度
Bacteria cell
density
(OD600)
预培养时间
Pre-cu lture
tim e/ d
侵染时间
Infect ion
in cubation
t ime/min
预培养基中 AS浓度
AS conc.in
p re-culture m edia/
(μmol· L -1)
侵染液中 AS浓度
AS conc.in in fect ion
b acteria cu lture/
(μmol· L -1)
抗性愈伤百分率
Percentage of
hyg-resi stan t
calli/ %
1 0.3 1 5 0 0 46.15
2 0.3 3 15 50 50 29.17
3 0.3 5 25 100 100 72.73
4 0.3 7 35 150 150 22.73
5 0.6 1 15 100 150 21.05
6 0.6 3 5 150 100 36.84
7 0.6 5 35 0 50 15.38
8 0.6 7 25 50 0 47.37
9 0.9 1 25 150 50 18.75
10 0.9 3 35 100 0 54.55
11 0.9 5 5 50 150 64.29
12 0.9 7 15 0 100 44.44
13 1.2 1 35 50 100 66.67
14 1.2 3 25 0 150 47.37
15 1.2 5 15 150 0 52.63
16 1.2 7 5 100 50 46.15
各因素水平和 Sum of the levels
K 1 170.78 152.62 193.44 153.35 200.7
K 2 120.65 167.92 147.3 207.49 109.46
K 3 182.03 205.03 186.21 194.48 220.68
K 4 212.82 160.69 159.32 130.95 155.43
R 92.17 52.41 46.14 76.54 111.23
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第 1期 刘红梅 , 等:利用正交设计优化百子莲农杆菌转化条件的初探
1.6　GUS组织化学染色检测
用无菌双蒸水将百子莲愈伤组织表面的培养基
冲洗干净 ,用滤纸吸干表面的水分 ,然后放入到 1.5
mL 离心管中进行染色 。GUS 组织化学染色参照
Rueb[ 8] 的方法 ,加入 GUS 染色液 ,在黑暗中 37 ℃
温育过夜。然后加入 75%酒精洗去愈伤组织表面
的浮色 。在体视显微镜下观察并拍照 。以未转化的
愈伤作为对照 。
1.7　数据统计分析
统计各个试验 GUS染色呈阳性的愈伤组织块
数 ,计算阳性百分率。统计数据见表 3。通过
Excel2003对数据进行极差分析和方差分析。
2　结果与分析
2.1　各因素对转化效率的影响
经过抗生素筛选的百子莲抗性愈伤组织经
GUS 染色后 ,愈伤呈现很深的蓝色(图 2),而对照
呈白色 。说明以 35S启动的 GUS 基因在百子莲愈
伤细胞中得到了表达。统计了各个试验中 GUS 染
色呈阳性的抗性愈伤块数 ,计算阳性率 ,并对实验结
果进行极差分析 ,结果见表 3。
在极差分析中 ,先求出每个因素同一水平下的
试验值之和(K i , i=1 ,2 ,3和 4)。并求出同一因素
不同水平间的极差 R 值 。极差 R 值的大小反映了
每个因素对试验的影响程度 ,R 值越大 ,说明该因素
对试验结果影响越明显 。从表 3中的极差计算结果
可以看出 ,各因素对试验结果的影响从大到小依次
为:侵染菌液中AS浓度 、菌液浓度 、预培养培养基
中 AS浓度 、预培养时间和侵染时间。
图 2　GUS 染色结果(左:百子莲潮霉素抗性愈伤 ,
右:对照)
Fig.2　Gus staining results(Left:H yg romycin-resistant
calli of A.a f ricanus;right:contro l)
　　因极差分析不能估计试验误差 ,无法分析试验
的精度。为了准确判断各因素的试验的影响是否显
著 ,我们进一步对试验结果进行方差分析 ,结果见表
4。由表 4中的结果可知 ,各因素对试验结果的影响
从大到小顺序为:侵染菌液中 AS 浓度 、预培养时
间 、预培养培养基中 AS 浓度 、菌液浓度和侵染时
间。这一结果与极差分析稍有不同 ,预培养基时间
与菌液浓度的顺序发生了变化 。这 2个因素对实验
结果的影响都没有达到显著水平 ,两者的影响大小
差别不明显。从方差分析的结果中可知 ,侵染菌液
中的 AS 浓度对 GUS 染色阳性率的影响达到了显
著水平(P<0.05),其他因素对试验结果的影响都
没有达到显著水平(P >0.05)。说明在农杆菌
EHA105菌株介导的百子莲遗传体系中侵染菌液
中 AS浓度是影响转化率的重要的因素 。
表 4　正交试验各因素间的方差分析
Tab.4　Variance analysis for factors of orthogonal tests
变异来源 Variance resou rce 平方和 SS 自由度 DF 平均方差M S F F(3 , 15)
预培养时间 Pre-cul tu re time 1101.16 3 367.05 3.08 3.29
菌液浓度 Bacteria cell density 402.52 3 134.17 1.12
侵染时间 Infection time 357.94 3 119.31 1.00
预培养培养基 AS浓度 AS conc.in p re-cultu re m edia 949.18 3 316.39 2.65
侵染菌液 AS浓度 AS conc.in in fect ion bacteria culture 1844.75 3 614.92 5.15＊
误差 Er ro r 357.95 4
总和 T otal 4655.55 19 245.03 2.05 显著
　　注:＊在 0.05水平差异显著。
　　Note:＊signi fciant di ff erence at 0.05 level.
2.2　各因素的不同水平对百子莲遗传转化率的
影响
2.2.1　预培养时间对转化效率的影响
结果表明 ,预培养 7 d 后获得的百子莲抗性愈
伤率最高(见图 3a),但是各个水平之间的差异未达
到显著水平(P>0.05)。说明本试验条件下 ,预培
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上 海 交 通 大 学 学 报(农 业 科 学 版) 第 29卷
养时间对百子莲愈伤组织的遗传转化率没有明显的
影响 。叶华等[ 9] 报道非洲菊小细胞团预培养后有利
于转化效率的提高 。而王丽等人以试管薯为材料进
行的试验表明 ,预培养对农杆菌介导的遗传转化影
响不明显[ 10] 。这可能与受体材料及其生理状态
有关。
2.2.2　菌液浓度对转化效率的影响
试验中当菌液的 OD600值为 0.3 、0.6 、0.9 时 ,
随着菌液浓度的升高抗性愈伤率升高 ,到 1.2时又
有所降低。原因可能是菌液浓度较小时 ,单位培养
基中的细菌数目少 ,不利于转化材料的获得 。菌液
浓度太高 ,使过多的细菌残留在愈伤组织表面 ,过度
生长的细菌对愈伤产生伤害从而降低转化效率[ 11]
(见图 3b)。
2.2.3　侵染时间对转化效率的影响
随着侵染时间的时间的延长 ,抗性愈伤百分率
呈下降的趋势(见图 3c)。可能是由于过长时间浸
泡在菌液中对愈伤组织产生了一定的不利影响 。但
是方差分析表明 ,侵染时间在 5 ～ 35 min 之间对百
子莲愈伤组织的转化率没有显著的影响(P >
0.05),说明 5 min的侵染时间对百子莲愈伤组织的
转化已经足够了 ,延长侵染时间对提高转化率并无
益处 。因此 ,为了提高工作效率 ,应选择较短的侵染
时间。短于 5 min的侵染时间对百子莲愈伤组织的
转化的影响有待进一步研究。
2.2.4　预培养培养基中 AS 的浓度对转化效率的
影响
AS作为一种酚类物质对农杆菌 Vir 区的基因
具有激活作用 ,促进农杆菌 T-DNA 的加工 、转移及
整合进植物基因组 , 可提高植物基因的转化效
率[ 12] 。Belarmino 等[ 13] 发现在预培养培养基中加
入 AS可提高蝴蝶兰的遗传转化率。我们的试验结
果表明:与对照相比 ,当预培养培养基中 AS 的浓度
为 50 μmo l· L-1时 ,百子莲愈伤组织的转化效率
得到了提高。然而 ,随着 AS 浓度的增加 ,转化效率
又有所降低(见图3d)。说明适量的AS 浓度能提高
转化效率;浓度过高时 ,这种酚类物质可能对愈伤的
正常生长产生抑制作用。这与 Belarm ino 等[ 13] 蝴
蝶兰上报道随着 AS 浓度(100 ～ 700 μmol · L-1)
的升高 ,转化效率逐渐升高的结论不一致 ,可能是不
同物种间对 AS的反应有差异的原因。
图 3　各因素不同水平对百子莲愈伤组织遗传转化的影响
Fig.3　Influences of differ ent levels o f the facto rs on genetic t ransfo rmation o f A.a f ricanus calli
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第 1期 刘红梅 , 等:利用正交设计优化百子莲农杆菌转化条件的初探
2.2.5　侵染液中 AS 的浓度对转化效率的影响
研究结果表明 ,在侵染菌液中加入 100 μmol·
L-1的 AS 可显著提高百子莲愈伤组织的抗性愈伤
百分率(P<0.05)(见图 3e)。AS 对农杆菌介导的
植物遗传转化效率的影响比较复杂 ,与外植体类型 、
外植体生理状态 、质粒种类 、施用浓度等都有一定的
关系 。Lian等[ 14] 发现 ,施加 AS 可提高文心兰的转
化效率 。而王永勤等人发现 AS 可提高质粒
pTBAaB(菌株 LBA4404)和 p3301(菌株 EHA105)
对小麦 TypeⅡ型(淡黄色粒状 ,质地致密)愈伤组织
的转化率 ,但是却降低了对 Type Ⅰ型(白色块状 ,
质地较疏松)愈伤组织的转化率。而用质粒 p3301
(菌株 AG L-1)的试验结果表明 ,无论 Type Ⅰ型和
TvpeⅡ型愈伤 AS对其转化率几乎没有影响[ 15] 。
3　结　语
农杆菌的转化效率受多种因素的综合影响 ,本
试验主要对预培养时间 、预培养培养基中 AS浓度 、
菌液浓度 、侵染时间以及侵染液中 AS 浓度对转化
效率的影响进行了研究。得出的最佳转化体系为:
预培养 5d 、菌液浓度(OD 600)为 0.9 、侵染时间为 5
min 、预培养培养基中 AS 的浓度为 50 μmol ·L-1 、
侵染菌液中 AS的浓度为 100 μmol·L -1 。在此条
件下 , 利 用农杆菌 EHA105 菌株 (表 达载体
pCAMBIA1304)介导的百子莲愈伤组织遗传体系
获得的遗传转化率最高 。
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