全 文 ：　
第４６卷　第９期　
２０１６年９月
中 国 海 洋 大 学 学 报
ＰＥＲＩＯＤＩＣＡＬ　ＯＦ　ＯＣＥＡＮ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＯＦ　ＣＨＩＮＡ
４６（９）：０５０～０５８
Ｓｅｐｔ．，２０１６
龙须菜果孢子的Ｘ射线诱变及优势突变体的筛选
魏惠惠，隋正红，王津果，杜青伟，商二磊，米　萍，阙　州
（中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室，山东 青岛２６６００３）
摘　要：　采用Ｘ射线作为诱变源，对龙须菜进行辐照诱变，验证了果孢子作为诱变材料相对于龙须菜藻尖的优越性，并确
定了最佳诱变剂量－９０Ｇｙ。约１０７～１０８ 个野生型龙须菜果孢子经过９０Ｇｙ的Ｘ射线辐照，获得了约１０６～１０７ 株成活的
龙须菜幼苗。将诱变存活幼苗平均分成２组，分别对其进行耐高温和低磷速生品系的筛选。经过幼苗期和成熟期的双重
筛选，初步获得了１株耐高温突变株和３株低磷速生突变株。分别命名为 ＷＴ－３和 ＷＬＰ－１、ＷＬＰ－９、ＷＬＰ－２２。其中，ＷＴ－３
为经历了４１和３５℃高温胁迫后仍存活并保持良好生长的藻株；ＷＬＰ－１、ＷＬＰ－９、ＷＬＰ－２２在１０－２　ｍｇ／Ｌ的磷浓度水平下相
对野生藻株具有显著的生长优势。本研究提供了一套可行有效的龙须菜诱变筛选技术，同时，筛选出的优良藻株为下一步
遗传研究和生产应用提供了材料。
关键词：　Ｘ射线诱变；耐高温；低磷；速生；龙须菜
中图法分类号：　Ｑ９４９．２　　　文献标志码：　Ａ　　　文章编号：　１６７２－５１７４（２０１６）０９－０５０－０９
ＤＯＩ：　
引用格式：　魏惠惠，隋正红，王津果，等．龙须菜果孢子的Ｘ射线诱变及优势突变体的筛选［Ｊ］．中国海洋大学学报（自
然科学版），２０１６，４６（９）：５０－５８．
ＷＥＩ　Ｈｕｉ－Ｈｕｉ，ＳＵＩ　Ｚｈｅｎｇ－Ｈｏｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｊｉｎ－Ｇｕｏ，ｅｔ　ａｌ．Ｘ－ｒａｙ－ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｃａｒｐｏｓｐｏｒｅｓ　ｏｆ　Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ　ｌｅｍａ－
ｎｅｉｆｏｒｍｉｓ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｓｕｐｅｒｉｏｒ　ｔｒａｉｔｓ［Ｊ］．Ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌ　ｏｆ　Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ，２０１６，４６（９）：５０－５８．
　 　基金项目：山东省自主创新计划课题项目（２０１３ＣＸＣ８０２０２）；国家自然科学基金项目（３１３７２５２９）资助
Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ　ｂｙ　Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ（２０１３ＣＸＣ８０２０２）；Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉ－
ｎａ（３１３７２５２９）
收稿日期：２０１５－１２－２５；修订日期：２０１６－０１－１５
作者简介：魏惠惠（１９９１－），女，硕士。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｙｄｗｅｉｈｕｉ＠１６３．ｃｏｍ
　　通讯作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｕｉｚｈｅｎｇｈ＠ｏｕｃ．ｅｄｕ．ｃｎ
　　龙须菜（Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ　ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ）是一种具
有重要经济价值的大型海洋红藻，其琼胶含量高，所产
琼胶被广泛应用于各个生产领域；龙须菜还是鲍鱼养
殖的重要饵料，富含牛磺酸和谷氨酸［１］，能够有效诱食
并且有提高鲍鱼肉质的作用；对龙须菜的多糖及藻胆
蛋白的诸多研究表明，龙须菜还具有抗氧化、抗病毒等
多种生物学作用；龙须菜养殖可以有效降低海水中Ｎ、
Ｐ含量［２］，防止赤潮的发生，具有重要的生态价值。龙
须菜自１９８０年代以来，被人工栽培的规模逐渐扩大，
其经济价值和生态效益得到了有效的发挥，促进了我
国海水养殖事业的发展［３］。
野生龙须菜的最适生长温度是１２～２３℃，主要分
布在我国山东半岛潮间带。１９９８年，张学成等［３］通过
化学诱变的方法，选育出耐高温品系９８１，使得龙须菜
的耐受温度提高到２６℃，在南方海域得到广泛推广。
但是，品系９８１的耐受温度虽然相对野生型有显著提
高，但在南方海域仍然不能成功渡夏。因此，更加耐高
温的龙须菜品系亟待被选育出来。
磷是植物生长过程中不可或缺的元素之一，磷缺
乏会导致龙须菜产量降低、质量下降。Ａｔｋｉｎｓｏｎ和
Ｓｍｉｔｈ［４］报道，海洋大型红藻生长环境中磷元素含量相
对较低，碳、氮、磷的比例一般保持在５５０∶３０∶１这样
１个平均比值左右。并且，我们通过栽培实践以及不同
海区海水氮磷含量的累计测量，发现很多海区磷含量
明显偏低，甚至会低至０．０１ｍｇ／Ｌ以下。研究表明，龙
须菜生长所需的饱和磷浓度约为０．６２ｍｇ／Ｌ［５］，而为了
防止赤潮等海水富营养化现象的发生，根据我国海水
水质标准，海水的磷含量范围应为≤０．０４５ｍｇ／Ｌ［６］，这
个磷浓度远远低于龙须菜生长所需。并且，通过添加
磷肥的方式来提高其产量，必然会对海域的生态环境
产生负面的影响。因此，提高藻体本身的低磷耐受能
力，是解决龙须菜因低磷而产量下降问题的重要途径。
本实验首次使用Ｘ射线辐照的方法，对龙须菜果
孢子进行诱变，进一步筛选获得具有耐高温和低磷速
生特性的龙须菜抗逆突变体。本文目的在于为龙须菜
的优良品系选育提供一条新的途径，探索出合适的诱
变条件和筛选方法，同时也为了选育出高抗逆性的龙
须菜品系，将其应用于生产，解决龙须菜栽培领域遇到
的问题。
10.16441/j.cnki.hdxb.20150428
９期 魏惠惠，等：龙须菜果孢子的Ｘ射线诱变及优势突变体的筛选
１　材料与方法
１．１实验材料
实验中所用的龙须菜为采自青岛湛山湾的野生四
分孢子体和成熟的雌配子体。
１．２材料的培养和诱变材料的获得
将采集的新鲜材料先用灭菌水冲洗并用毛刷刷去
藻体表面的杂藻。然后置于５００ｍＬ锥形瓶中培养，采
用 Ｐｒｏ 培 养基［７］，培养条件为 （２０±１）℃，光 强
３０μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），光暗周期１２Ｌ∶１２Ｄ，每周更换一
次培养基。该培养条件为龙须菜的正常培养条件，用
于之后果孢子幼苗的培养。
一方面，选取一株长势良好且分支较多的四分孢
子体藻株，切取１ｃｍ长的藻尖，用于之后Ｘ射线诱变。
另一方面，将成熟的雌配子体切成２ｃｍ的藻段，置于六
孔板中培养，每个孔中加入１０ｍＬ含有Ｐｒｏ培养基的
灭菌海水，且保证每个六孔板中藻体的囊果数相同。
采用果孢子放散最佳培养条件［８］：温度（２０±１）℃，光
强１５μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），光暗周期１２Ｌ∶１２Ｄ，每周更换１
次培养基。定期在显微镜下观察，待果孢子大量放散。
１．３藻尖和果孢子的Ｘ射线诱变
分别用１ｃｍ的藻尖和放散刚附着的果孢子进行Ｘ
射线诱变，使用的仪器为青岛四零一医院的 ＶＡＲＩＡＮ
２１ＥＸ医用直线加速器（Ｖａｒｉａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ，美国），采用能
量为６ＭＶ的Ｘ射线，剂量率设定为６Ｇｙ／ｍｉｎ。Ｇｒａｙ
（Ｇｙ）为辐射剂量的绝对单位，１Ｇｙ＝１Ｊ／ｋｇ，即每１千
克受照物质吸收１焦耳核辐射能时的辐射剂量。辐射
总剂量设置７个梯度，分别为０、１５、３０、４５、６０、７５、９０
Ｇｙ。每个剂量设置３个平行。材料经过Ｘ射线辐照后
暗培养２４ｈ，之后恢复至正常条件培养。对于藻尖，每
周更换１次培养基，２周后统计致死率；对于果孢子，诱
变１周后在倒置显微镜下统计果孢子的存活数目，进
而计算出各个Ｘ射线剂量梯度对龙须菜果孢子的致死
率。致死率的计算方法如下：致死率／％＝（１－存活孢
子数目／总孢子数目）×１００％［９］。统计方法：采用１０
倍物镜（×２００），总致死率为随机２０个视野的平均值。
１．４耐高温藻株的筛选
１．４．１耐高温筛选温度的确定　　参照付峰等［９］，略加
修改。将未经诱变的野生果孢子培养在（２０±１）℃的
培养箱中，光强１５μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），光暗周期１２Ｌ∶１２
Ｄ，每周更换１次培养基。待其长成２～３ｍｍ长的小苗
后，置于３８、３９、４０、４１、４２℃５个温度梯度的水浴锅中
热胁迫３０ｍｉｎ。之后在正常培养温度下暗培养１２ｈ，
再恢复光照培养。１周后统计存活率，得到致使野生型
小苗全部死亡的最低温度，用于之后诱变小苗的耐高
温筛选。
１．４．２突变体高温胁迫筛选　　将诱变后的果孢子培
养至２～３ｍｍ长的幼苗期，培养条件同１．４．１，置于上
述实验确定的筛选温度，高温水浴胁迫３０ｍｉｎ。存活
下来的小苗在海上挂养成熟后，进行第二次筛选，每株
藻称取０．１ｇ藻段，每株设置３个平行，置于３５℃的光
照培养箱中胁迫培养７２ｈ［９］。幼苗期和成熟期两次热
胁迫后均得以存活的藻株被挑选出来。
１．５低磷速生藻株的筛选
１．５．１低磷筛选浓度的确定　　选取１２０株未经诱变
并长至１ｃｍ长的野生型幼苗，均分为４组，培养于添加
了去磷Ｐｒｏ培养基的海水中，不同组添加磷的终浓度
分别为０、０．０１、０．１和１ｍｇ／Ｌ。每周测量１次幼苗长
度，连续测量６周。观察小苗生长状态和生长速率，从
而获得最佳的低磷筛选浓度。
１．５．２突变体低磷胁迫筛选　　待诱变后的果孢子的
存活率稳定后，将其与同时期的野生果孢子共同在上
述实验得到的低磷培养基中培养。正常Ｐｒｏ培养基培
养的小苗为对照组，海水中磷的终浓度约为１ｍｇ／Ｌ。
待小苗的平均长度长至２ｃｍ左右，统计测量幼苗长度，
得到野生型最大苗长，挑选出大于该苗长的诱变组小
苗，同野生小苗一同挂至海上培养成熟后，进行第二次
筛选。每株称取０．５ｇ藻体，设置３个平行，野生小苗为
对照组。在低磷培养基中培养，培养条件为（２０±１）℃，
光强３０μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），光暗周期１２Ｌ∶１２Ｄ，每周更
换一次培养基。３０ｄ后称量藻体的质量，进而计算出
日平均生长速率（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｒａｔｅ，ＳＧＲ），先获得
野生型最大日平均生长速率，诱变组中大于该速率的
藻株被认定为低磷速生藻株。日平均生长速率的计算
公式［９］如下：
ＳＧＲ＝１００×（ｌｎＷｔ－ｌｎＷ０）／ｔ，
式中：ＳＧＲ为日平均生长速率／％·ｄ－１，Ｗｔ为第ｔ天的
藻体湿重／ｇ；Ｗ０ 为藻体初始湿重／ｇ。
１．６数据分析
以上实验均设置３个平行，结果为３个平行的平均
值。采用统计软件ＳＰＳＳ　２２．０对实验数据进行单因素
方差分析（ＡＮＯＶＡ），差异显著性水平：Ｐ＝０．０５。
２　实验结果
２．１Ｘ射线诱变材料和诱变剂量的确定
Ｘ射线诱变预实验分别用２种诱变材料———藻尖
和果孢子，在０、１５、３０、４５、６０、７５、９０Ｇｙ　７个剂量梯度
下进行。７个剂量梯度的Ｘ射线对龙须菜藻尖均没有
表现出明显的致死效应，仅个别藻尖端部变白，但９０
Ｇｙ组藻尖存活率仍为１００％（见图１）。而果孢子则对
Ｘ射线辐照比较敏感，４５Ｇｙ时致死率为４２％，９０Ｇｙ
时致死率为９１％。根据２种材料的Ｘ射线诱变预实验
１５
中　国　海　洋　大　学　学　报 ２　０　１　６年
结果，选用果孢子作为诱变材料。
（Ａ．辐照后第１天；Ｂ．辐照后第７天；Ｃ．辐照后第２１天（标尺：２ｃｍ）。
Ａ．１ｓｔ　ｄａｙ　ａｆｔｅｒ　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ；Ｂ．７ｔｈ　ｄａｙ　ａｆｔｅｒ　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ；Ｃ．２１ｓｔ　ｄａｙ　ａｆｔｅｒ
ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ（ｓｃａｌｅ　ｂａｒｓ＝２ｃｍ）．）
图１　Ｘ射线（９０Ｇｙ）辐照后龙须菜藻尖的形态变化
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　ｓｔｅｍ　ｔｉｐｓ　ｏｆ
Ｇｐ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ　ａｆｔｅｒ　Ｘ－ｒａｙ（９０Ｇｙ）ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ
　　根据不同剂量水平对果孢子的致死率，得到诱变
剂量与致死率的线性关系（见图２）。通过计算得出，Ｘ
射线辐照的半致死剂量约为４８Ｇｙ，致死率为９０％时辐
照剂量约为９０Ｇｙ。为了得到更高的正突变率，本实验
选定９０Ｇｙ作为后续诱变的辐照剂量。
图２　不同Ｘ射线辐照剂量对龙须菜果孢子的致死率
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｌｅｔｈａｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｃａｒｐｏｓｐｏｒｅｓ　ｏｆ　Ｇｐ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ
ｂｙ　Ｘ－ｒａｙ　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｏｓｅｓ
２．２诱变后小苗耐高温筛选温度的确定
野生的四分孢子体幼苗在高温水浴中胁迫３０ｍｉｎ
后，结果显示，在４１℃时，小苗存活率为０（见图３）。以
导致野生型小苗全部死亡的最低处理温度，即４１℃，作
为突变藻株的耐高温筛选温度。
２．３龙须菜果孢子的Ｘ射线诱变及诱变后的形态变化
将放散后刚附着的果孢子（每个六孔板中约有１０５
个孢子，共２００个六孔板）按照９０Ｇｙ的剂量进行Ｘ射
线辐照。与未作处理的果孢子相比，辐照后的果孢子
分裂速度变慢，发育明显滞后（见图４）。并且分裂过程
中形状不规则，出现非正常发育时期———三细胞期（见
图Ｂ１）。
图３　不同温度下野生型龙须菜果孢子幼苗的存活率
Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｗｉｌｄ　ｃａｒｐｏｓｐｏｒｉｃ　ｇｅｒｍｌｉｎｇｓ　ｏｆ
Ｇｐ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ　ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
（Ａ．１～３分别为正常果孢子发育第３、６、９天；Ｂ．１～３分别为诱变后果孢
子发育第３、６、９天（标尺：２０μｍ）。Ａ．１～３ｉｓ　３ｒｄ，６ｔｈ，９ｔｈ　ｄａｙ　ｗｉｔｈｏｕｔ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ｂ．１～３ｉｓ　３ｒｄ，６ｔｈ，９ｔｈ　ｄａｙ　ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ（Ｓｃａｌｅ　ｂａｒｓ＝２０μｍ）．）
图４　Ｘ射线诱变和未经处理的龙须菜
果孢子发育情况对比（×４００）
Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃａｒｐｏｓｐｏｒｅｓ
ｏｆ　Ｇｐ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｎｄ　ｗｉｔｈｏｕｔ（×４００）
Ｘ－ｒａｙ　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
２．４耐高温藻株的筛选
将长至２～３ｍｍ（约４周后）的小苗置于４１℃水浴
中高温胁迫３０ｍｉｎ，胁迫后初期并没有明显的形态变
化，随着时间的推移，小苗颜色逐渐变浅。在热胁迫后
第３天，小苗呈现出明显的浅紫红色，在第７天大部分
小苗全部变为白色（见图５），而有些小苗则维持或部分
维持红褐色从而存活下来，这些存活下来的小苗被初
步认定为耐高温小苗。
耐高温小苗挂养成熟后，采用在３５℃培养箱中胁
迫培养７２ｈ的方法进行２次筛选，热胁迫后一些藻株
从局部开始逐渐变绿，进而整株藻体死亡，而另一些藻
２５
９期 魏惠惠，等：龙须菜果孢子的Ｘ射线诱变及优势突变体的筛选
株则仅尖端或小部分变绿，剩余藻体很快形成了新的
分支，存活下来。经过２次筛选后存活下来的藻株，被
认定为耐高温藻株，其中一株分支较多，且有显著生长
优势，命名为 ＷＴ－３。
图５　经４１℃热胁迫３０ｍｉｎ后第１、３、７天
的龙须菜果孢子幼苗（标尺：１ｃｍ）
Ｆｉｇ．５　Ｃａｒｐｏｓｐｏｒｉｃ　ｇｅｒｍｌｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｇｐ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ　ｏｎ　１ｓｔ，３ｒｄ，
７ｔｈ　ｄａｙ　ａｆｔｅｒ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｆｏｒ　３０ｍｉｎ　ｕｎｄｅｒ　４１℃（Ｓｃａｌｅ　ｂａｒｓ＝１ｃｍ）
２．５低磷速生藻株的筛选
４个磷浓度组的幼苗连续６周的长度测量结果（见
图６）显示，添加正常Ｐｒｏ培养基（１ｍｇ／Ｌ）的小苗，生长
速度显著高于其他３组（Ｐ＜０．０５）；０．１ｍｇ／Ｌ组居中，
显著高于０．０１、０ｍｇ／Ｌ组（Ｐ＜０．０５）。后２组长势相
似，差异不显著（Ｐ＞０．０５）。由于用于幼苗培养的海水
中本身磷浓度约为０．０２～０．０４ｍｇ／Ｌ，因此后２组培养
液的磷终浓度均为１０－２　ｍｇ／Ｌ水平，实验结果与其一
致。由图可知，海水磷浓度在１０－２　ｍｇ／Ｌ水平时，龙须
菜生长速度缓慢，生长明显受到抑制，因此该水平的磷
浓度可用于低磷筛选。另外，为了避免天然海水中磷
浓度的不稳定性对藻体生长带来的影响，实验选择添
加磷终浓度０．０１ｍｇ／Ｌ作为后续低磷速生藻株筛选浓
度。
图６　４个磷浓度组龙须菜幼苗的生长
Ｆｉｇ．６　Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｇｐ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ
ｉｎ　ｆｏｕｒ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｄｅｇｒｅｅｓ
　　将同时放散的等量的（１００个六孔板）经诱变和未
经诱变的果孢子采用低磷培养基，在相同条件下培养。
约１６周后，果孢子长成了２ｃｍ左右的幼苗，测量统计
幼苗长度，统计结果（见图７）显示：诱变组相对于未诱
变组小苗，平均长度较小，标准偏差较大。另外，测得
野生小苗的最大长度约为２．４ｃｍ，将诱变组中长于２．４
ｃｍ的小苗挑出，共２７株，其中最大长度达到３．６ｃｍ。
将初筛得到耐低磷小苗挂至海上培养成熟后。每
株取０．５ｇ，设置３个平行，另外３０株野生小苗为对照
组，在实验室中进行低磷培养，３０ｄ后计算日平均生长
速率。结果显示（见图８），野生组最大生长速率为
２．２１％，诱变藻株中，有３株日平均生长速率分别为
２．７９％、２．７２％、３．０１％，显著高于野生组的最大速率
（Ｐ＜０．０５），被分别命名为 ＷＬＰ－１、ＷＬＰ－９、ＷＬＰ－２２。
图７　诱变和未经诱变龙须菜小苗１６周时长度比较
Ｆｉｇ．７　Ｌｅｎｇｔｈ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｇｐ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ
ｗｉｔｈ　ａｎｄ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　１６ｗｅｅｋｓ’ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ
图８　龙须菜藻株在实验室的日平均生长速率比较
Ｆｉｇ．８　Ｔｈｅ　ＳＧＲ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ
Ｇｐ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ　ｕｎｄｅｒ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｌａｂ
３　讨论
３．１诱变材料
江蓠的辐照诱变大多采用 Ｃｏ６０－γ射线或者紫外
线，用于辐照诱变的材料也根据诱变源的不同而有所
差异。针对特定的诱变源，选择合适的诱变材料，能够
有效提高诱变效率。Ｓｈｅｎ等［１０］用紫外线辐照细基江
３５
中　国　海　洋　大　学　学　报 ２　０　１　６年
蓠（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ　ｔｅｎｕｉｓｔｉｐｉｔａｔａ）２ｍｍ厚的藻段，对其进
行诱变育种。而龙须菜中常用的诱变材料有２种，藻
尖和放散的孢子。张学成等［１１］报道幼嫩的藻尖常被用
作龙须菜紫外诱变的材料。而孟琳［１２］在利用 Ｃｏ６０－γ
射线诱变龙须菜时，选用的材料也为２０～３０ｍｍ长的
藻尖。付峰［１３］则选用了龙须菜的果孢子和四分孢子对
其进行紫外诱变。
本实验选取了２种材料进行Ｘ射线辐照，即龙须
菜藻尖和刚附着的果孢子，从而获得更适合于Ｘ射线
诱变的材料。预实验的结果表明，果孢子相对于藻尖
而言对Ｘ射线具有更高的灵敏度，在诱变剂量为９０Ｇｙ
时致死率已达到９０％，而藻尖在９０Ｇｙ时，只有部分尖
端变白，并无藻尖完全死亡的情况。放散后刚附着的
果孢子作为诱变材料有其特有的优点，由于孢子只有
在接触六孔板底部时才能附着，所以用于辐照的果孢
子均平铺在六孔板底面，不存在孢子重叠的现象，能保
证所有孢子均匀接受辐照，且辐照距离相等；放散后刚
附着的果孢子没有厚实的多糖细胞壁，Ｘ射线更容易
穿透，进而发挥效应；其为单细胞，突变发生后能够随
着细胞分裂分化在完整藻株中表现出来，而藻尖则可
能会由于射线辐照的不均匀性而形成嵌合体。另外，
孢子制备方便，可以大量获得，且成活率高，能够为 Ｘ
射线诱变提供大量的材料，提高了正突变株产生的几
率。
３．２诱变方法
辐射诱变被普遍应用于高等植物、藻类和微生物
的育种研究，其具有突变谱较广、突变率高等优势。不
同的物理射线会对生物体产生不同的辐射生物效
应［１４］。Ｘ射线是一种电离辐射，具有强的穿透能力，照
射在分子上能够将分子中的电子击出，产生离子，即产
生电离作用，其发生在 ＤＮＡ分子上能够诱发基因突
变。
Ｘ射线在高等植物和微生物诱变育种中应用广
泛，而在藻类尤其是大型藻类中应用较少。黄海水产
研究所和中科院海洋研究所［１５－１６］用Ｘ射线进行辐照诱
变，再经筛选和自交，得到了干物质含量高且耐高温的
海带品种“１１７０”。蒋霞敏等［１７］以雨生红球藻作为诱变
材料，从超微结构变化的角度研究了Ｘ射线的致突变
效应，推测Ｘ射线辐照引起的细胞核、线粒体、叶绿体
等细胞器的损伤，可能是造成突变的原因。
诱变育种被广泛应用于龙须菜优良品系的选育。
包括物理和化学诱变２种手段，常用的化学诱变剂有
Ｎ－甲基－Ｎ′－亚硝基胍（ＭＮＮＧ）和甲基磺酸乙酯（ＥＭＳ）
等。张学成等［３，１８］用 ＭＮＮＧ对龙须菜进行诱变，先是
获得了多种色素突变体，为龙须菜的色素组成研究提
供了材料；后又结合羟脯氨酸以及高温胁迫筛选，选育
出了耐高温良种—品系９８１。Ｚｈａｎｇ等［１９］利用 ＥＭＳ
对龙须菜进行诱变，获得了色素突变体，为龙须菜遗传
研究提供了基础。孟琳等［１２］利用 ＭＮＮＧ对品系９８１
的藻尖进行诱变，再对其进行高温筛选，获得了耐高温
品系０７－２，与品系９８１相比，具有更好的耐高温性、更
快的生长速率和更高的琼胶含量。常用的物理方法主
要是紫外线辐照诱变，付峰等［１３］用紫外线诱变龙须菜，
通过高温筛选获得了两株耐高温藻株，生长速率明显
高于品系９８１和野生型，且通过对其热胁迫下耐高温
指标的测定，证明其相对于品系９８１和野生型具有显
著的耐高温优势。
Ｘ射线具有比紫外线更强的穿透力，其致突变效
应也在多种植物的育种研究中得到证实。但其在龙须
菜的诱变育种中一直未被采用。在本实验中，利用医
用电子直线加速器产生的Ｘ射线对龙须菜释放刚附着
的果孢子进行辐照诱变，更加安全高效，果孢子相对传
统的诱变材料而言，具有其特有的优点。且实验结合
高温和低磷筛选获得了具有耐高温和低磷速生优良性
状的藻株，结果显示了Ｘ射线辐照方法诱变果孢子的
可行性。
３．３诱变后果孢子的形态变化
孢子的正常发育过程一般为单细胞期→二细胞期
→四细胞期→多细胞盘状体→直立体→小苗。诱变后
的果孢子在发育过程中出现了为数不少的三细胞期，
发育到多细胞阶段，大多呈现为形状不规则的细胞团
块。推测Ｘ射线对细胞核内遗传物质产生了损伤或改
变，以致细胞分裂和发育出现异常。对不规则分裂的
果孢子进行跟踪观察，发现部分不规则细胞团块发育
迟缓，渐而凋亡，而另一部分则通过细胞的分裂修整，
形成了基部为同心圆或接近圆形的盘状体。有关诱变
对细胞形态及发育进程的影响及其调控过程是有待于
深入研究的课题。
３．４耐高温突变体的筛选
建立起一套有效的突变体筛选的方法和技术，是
植物诱变育种中的关键步骤。对于耐高温突变株的筛
选，一般分为一步法和多步法。由于多步法需要长期
逐步地筛选，耗时长、劳动强度大，许多研究者比较倾
向于一步筛选法，将植株或藻株培养于大于其最适生
长温度的高温中，挑选出在该温度下能够存活或者生
长快速的藻株。黄瑞芳等［２０］利用连续７ｄ的夏季强光
高温（４２～５２℃）筛选经紫外诱变的巴氏杜氏藻（Ｄｕ－
ｎａｌｉｅｌｌａ　ｂａｒｄａｗｉｌ），获得了一株耐高温的突变株。Ｏｎｇ
等［２１］通过在４０℃高温培养筛选诱变后的小球藻，获得
了两株耐高温突变体。
另外，植株在不同发育阶段可能会显示出不同的
耐受性［２２－２３］。樊恭炬［２４］等通过实验和调查研究，推测
４５
９期 魏惠惠，等：龙须菜果孢子的Ｘ射线诱变及优势突变体的筛选
龙须菜幼株比成熟藻体更耐高温。于是，本实验在龙
须菜幼苗期和成熟期均设置了耐高温筛选，来获得耐
热性能够稳定表达的藻株。
Ｂｕｒｋｅ等［２５］采用远高于拟南芥最适生长温度的４８～
５０℃温浴３０ｍｉｎ来分离缺少获得性耐热成分的拟南芥。
Ｍｕｌａｒｋｅｙ等［２２］在筛选ＥＭＳ诱变的小麦耐高温突变
体时，采用的方法是将 Ｍ２代幼苗置于４７℃的高温中
热胁迫９０ｍｉｎ。本实验采用高温水浴胁迫的方法对幼
苗期的诱变藻株进行首次筛选。首先通过预实验得到
致使野生小苗全部死亡的最低温度－４１℃，然后将２～
３ｍｍ长的经诱变的果孢子幼苗置于该温度下胁迫３０
ｍｉｎ。成熟期藻体的耐高温筛选为３５℃热胁迫７２ｈ。
结果显示，该筛选方法耗费时间较短，降低了筛选的劳
动强度；在成熟期时进行２次筛选，其结果能够反映突
变体的性状稳定性，有利于筛选出真正具有耐高温特
性的突变藻株。
在幼苗期时经高温水浴胁迫有大量的果孢子幼苗
存活下来，这些小苗在成熟期热胁迫后却仍有大批藻
株死亡，在一定程度上验证了龙须菜在幼苗期具有更
高的抗高温性的观点。筛选出的耐高温藻株还需要后
续的遗传分析和实践栽培工作来验证其遗传稳定性。
３．５低磷速生突变体的筛选
磷是植物必需的营养元素，在其生长发育、新陈代
谢中起着重要的作用。由于土壤中能够供给作物利用
的有效磷浓度非常低［２６］，因此，在高等植物尤其是农作
物中关于低磷胁迫和耐低磷筛选指标的研究非常之深
入和广泛。在低磷胁迫下作物根系会分泌大量的酸性
磷酸酶来活化土壤中的有机磷，被认为是作物适应低
磷胁迫的重要生理机制［２７］。还有研究表明，在缺磷状
态下，小麦［２８］、油菜［２９］等作物的根冠比会增加，这是因
为更多的碳水化合物被迫使向根部运输。武志远等［３０］
利用根际显色反应作为耐低磷品种的筛选方法，筛选
耐低磷的粗山羊草品系，根际显色试验能说明不同材
料根际分泌的酸类物质的数量差异。高亲和性磷酸转
运系统被认为低磷胁迫状态下有效磷的主要转运系
统，其在环境中低磷或者缺磷时被诱导表达，而在正常
供磷情况下表达被抑制［３１］。另外，分蘖能力、根轴长
度、相对叶龄等也经常被用作高等植物耐低磷筛选的
指标。
但在藻类尤其是大型海藻中，耐低磷筛选指标的
研究相对缺乏。有研究表明，钝顶节旋藻细胞内Ｐ含
量受限时，会引起碳水化合物、脂质和Ｃ／Ｎ比的升高以
及蛋白质含量的降低［３２］。另外，Ｎ、Ｐ浓度的变化，会影
响龙须菜叶绿素ａ、藻红蛋白、丙二醛含量以及硝酸还
原酶和过氧化物酶活性［３３］。但这些指标能否反映藻株
对低磷胁迫的耐受力还缺乏足够的证据。但生长速率
作为最直观的性状表征，是高等植物和藻类耐低磷筛
选最基本的指标。
本实验以低磷培养条件下的生长速率为指标，进
行低磷速生品系的选育。首先，幼苗期通过测量各株
幼苗的长度，初步筛选出相对野生型有着明显生长优
势的藻株。诱变组平均长度明显低于野生组，说明 Ｘ
射线辐照使大多数藻株产生了负突变。测量得到野生
型最大长度，以该长度为筛选标准，大于该长度的诱变
组藻株，被初步认定为耐低磷藻株。一方面，野生型藻
株样本与诱变组数量一致，均为１０６～１０７，样本数目足
够大，并且藻株培养条件均一致，因此，以野生型最大
长度为筛选标准具有可信性。大于该长度的诱变组小
苗相对野生型具有显著的生长优势，因此，极有可能是
耐低磷的突变株。
在第一轮筛选的基础上，待其成熟后，设计实验再
次验证耐低磷小苗的生长优势，每株藻设计３个平行，
日平均生长速率显著大于野生型的藻株被确定为低磷
速生藻株，但其遗传变异的稳定性，还需进一步分析鉴
定。
实验验证了用Ｘ射线辐照果孢子是一种有效的龙
须菜诱变育种方法。筛选出的 ＷＴ－３经过幼苗期的高
温水浴胁迫和成熟期的高温培养胁迫后存活下来，说
明其可能具有较高的耐热性。ＷＬＰ－１、ＷＬＰ－９、ＷＬＰ－２２
以生长速率为指标，经过幼苗期和成熟期的双重筛选，
显示了在低磷条件下显著的生长优势。筛选出的耐高
温和低磷速生藻株有望作为优良品系应用于生产栽
培，４株突变体的性状优越性和遗传稳定性的确定还需
大量的后续研究和实践栽培工作。
本实验将Ｘ射线诱变与耐高温和低磷速生筛选相
结合，建立了一套可行的龙须菜优良品系筛选方法，为
龙须菜的优良品系选育提供了研究基础，同时，筛选出
的优良藻株为下一步遗传研究和生产应用提供了材
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［２８］　庞欣，李春俭．部分根系供磷对小麦幼苗生长及同化物分配的影
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６５
９期 魏惠惠，等：龙须菜果孢子的Ｘ射线诱变及优势突变体的筛选
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６９．
Ｄｕａｎ　Ｈ　Ｙ，Ｘｕ　Ｆ　Ｓ，Ｗａｎｇ　Ｙ　Ｈ．Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｒｏｏｔ　ｓｙｓｔｅｍ
ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　Ｐ　ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｏｆ　ｒａｐｅ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆ－
ｆｅｒｅｎｔ　Ｐ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２００２，８（１）：６５－６９．
［３０］　武志远．粗山羊草和小麦耐低磷品种的筛选及Ｐｈｔ１基因的克隆
与序列分析［Ｄ］．开封：河南大学，２０１２．
Ｗｕ　Ｚ　Ｙ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｈｔ１ Ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ａｅｇｉｌｏｐｓ　ｔａｕｓｃｈｉｉ　ａｎｄ
Ｗｈｅａｔ［Ｄ］．Ｋａｉｆｅｎｇ：Ｈｅｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１２．
［３１］　Ｒａｇｈｏｔｈａｍａ　Ｋ　Ｇ．Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ
Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，５０（１）：６６５－６９３．
［３２］　Ｍａｒｋｏｕ　Ｇ．Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｉｏｍａｓｓ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ
（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）ｐｌａｔｅｎｓｉｓ　ｕｎｄｅｒ　ｖａｒｉｏｕｓ　ａｍｏｕｎｔｓ　ｏｆ　ｌｉｍｉｔｅｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒ－
ｕｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，１１６：５３３－５３５．
［３３］　Ｙｕ　Ｊ，Ｙａｎｇ　Ｙ　Ｆ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｓｅａ－
ｗｅｅｄ　Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ　ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ　ｔｏ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　Ｎ　ａｎｄ
Ｐ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，
２００８，３６７（２）：１４２－１４８．
７５
中　国　海　洋　大　学　学　报 ２　０　１　６年
Ｘ－Ｒａｙ－Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｃａｒｐｏｓｐｏｒｅｓ　ｏｆ　Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ
ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ　ａｎｄ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｍｕｔａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　Ｓｕｐｅｒｉｏｒ　Ｔｒａｉｔｓ
ＷＥＩ　Ｈｕｉ－Ｈｕｉ，ＳＵＩ　Ｚｈｅｎｇ－Ｈｏｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｊｉｎ－Ｇｕｏ，ＤＵ　Ｑｉｎｇ－Ｗｅｉ，ＳＨＡＮＧ　Ｅｒ－Ｌｅｉ，ＭＩ　Ｐｉｎｇ，ＱＵＥ　Ｚｈｏｕ
（Ｔｈｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ，Ｑｉｎｇｄａｏ
２６６００３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ｇｒａｃｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ　ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔｅ）ｉｓ　ｏｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｅｃｏｎｏｍｉｃ　ｍａｃｒｏａｌ－
ｇａｅ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ．Ｆｏｌｏｗｉｎｇ　Ｌａｍｉｎａｒｉａａｎｄ　ｐｏｒｐｈｙｒａ，ｉｔ　ｈａｓ　ｂｅｃｏｍｅ　ｔｈｅ　ｔｈｉｒｄ　ｌａｒｇｅｓｔ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　ｓｅａｗｅｅｄ　ｉｎ
Ｃｈｉｎａ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｓｃａｌｅ　ｉｓ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｌｙ　ｅｎｌａｒｇｉｎｇ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｆｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ
ｏｆ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｉｓ　１２～２３℃．Ａｌｔｈｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｔｈｅｒｍｏ－ｔｏｌｅｒａｎｔ　ｃｕｌｔｉｖａｒ　９８１ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ　ｃｕｌ－
ｔｉｖａｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｏｕｔｈ　ａｒｅａ，ｉｔ’ｓ　ｓｔｉｌ　ｕｎａｂｌｅ　ｔｏ　ｓｕｒｖｉｖｅ　ｉｎ　ｓｕｍｍｅｒ．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａ－
ｔｉｏｎ　ｉｓ　ｇｅｎｅｒａｌｙ　ｌｏｗ　ｉｎ　ｍｏｓｔ　ｍａｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｒｅａ，ｓｏｍｅｔｉｍｅｓ　ｅｖｅｎ　ｉｓ　ｂｅｌｏｗ　０．０１ｍｇ／Ｌ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ
ａｎｄ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｇｐ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｓｉｓ　ｉｓ　ｓｅｒｉｏｕｓｌｙ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ．Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｅｎｌａｒｇｅ　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｒｅａ，ｔｏ　ｅｘ－
ｔｅｎｄ　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｐｅｒｉｏｄ　ａｎｄ　ｔｏ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｑｕａｌｉｔｙ，ｉｔ　ｉｓ　ｕｒｇｅｎｔｌｙ　ｎｅｅｄｅｄ　ｔｏ　ｉｍｐｒｏｖｅ
ｉｔｓ　ｈｅａｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，ｌｏｗ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ａｎｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒａｔｅ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｔ　ｉｓ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｔｏ　ｃｏｎｄｕｃｔ　ｍｕ－
ｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｓｕｐｅｒｉｏｒ　ｔｒａｉｔｓ．
Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ，Ｘ－ｒａｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｇｅｎ　ｔｏ　ｃｏｎｄｕｃｔ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｐ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ．
Ｃａｒｐｏｓｐｏｒｅｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｏｖｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｔｈｅ　ｂｅｔｔｅｒ　ｍｕｔａｇｅｎｉｃ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｓｔｅｍ－ｔｉｐｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｉｒｒａ－
ｄｉａｔｉｏｎ　ｄｏｓｅ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　９０Ｇｙ（Ｇｒａｙ，１Ｇｙ＝１Ｊ／ｋｇ，ｉｓ　ｔｈｅ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｎｅ　ｊｏｕｌｅ　ｏｆ　ｅｎｅｒｇｙ，
ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｏｒｍ　ｏｆ　ｉｏｎｉｚｉｎｇ　ｒａｄｉａｔｉｏｎ，ｐｅｒ　ｋｉｌｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｍａｔｔｅｒ．）．Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ　１０７～１０８　ｃａｒｐｏｓｐｏｒｅｓ　ｗｅｒｅ
ｍｕｔａｔｅｄ　ｂｙ　Ｘ－ｒａｙ　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｏｕｔ　ｏｆ　ｗｈｉｃｈ　１０６～１０７　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｓｕｒｖｉｖｅｄ　ａｎｄ　ｗｅｒｅ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　２ｇｒｏｕｐｓ　ｔｏ
ｂｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｕｎｄｅｒ　ｈｉｇｈ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｌｏｗ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｓｔｒｅｓｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
Ｔｈｅ　ｔｈｅｒｍｏ－ｔｏｌｅｒａｔｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｓｅｔ　ｕｐ　ｉｎ　ｔｗｏ　ｐｈａｓｅｓ．Ｗｈｅｎ　ｃａｒｐｏｓｐｏｒｅｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｉｎｔｏ　２
～３ｍｍ　ｇｅｒｍｌｉｎｇｓ（４ｗｅｅｋｓ　ａｆｔｅｒ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ），ｔｈｅｙ　ｗｅｒｅ　ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ａｔ　４１℃ｆｏｒ　３０ｍｉｎ　ｉｎ
ｗａｔｅｒ　ｂａｔｈ．Ｆｏｌｏｗｉｎｇ　ｆｉｅｌｄ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｇｅｒｍｌｉｎｇｓ　ｉｎｔｏ　ｍａｔｕｒｅ　ａｌｇａｅ，ｔｈｅｙ　ｗｅｒｅ　ｅｘ－
ｐｏｓｅｄ　ｔｏ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｏｆ　３５℃ｆｏｒ　７２ｈｉｎ　ｉｎｃｕｂａｔｏｒ．Ｏｎｅ　ｍｕｔａｎｔ　ｗｉｔｈ　ｈｅａｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ，ｎａｍｅｄ
ＷＴ－３，ｗｈｉｃｈ　ｓｕｒｖｉｖｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｐｈａｓｅｓ　ａｎｄ　ｄｉｓｐｌａｙｅｄ　ｒａｐｉｄ　ｇｒｏｗｔｈ．Ｌｏｗ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｔｏｌ－
ｅｒａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｍａｉｎｌｙ　ｂｙ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒａｔｅ　ａｔ　ｂｏｔｈ　ｓｅｅｄｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｍａｔｕｒｅ　ｓｔａｇｅｓ．Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｑｕａｎｔｉ－
ｔｉｅｓ　ｏｆ　ｗｉｌｄ　ａｎｄ　ｍｕｔａｔｅｄ　ｃａｒｐｏｓｐｏｒｉｃ　ｇｅｒｍｌｉｎｇｓ　ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅ－
ｄｉｕｍ　ｗａｓ　ｗｉｔｈ　１０－２　ｍｇ／Ｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｐｌａｃｅｄ　ｏｎｃｅ　ａ　ｗｅｅｋ．Ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｏｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ
ａｓ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｍｕｔａｔｅｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ　ｈｉｇｈｅｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒａｔｅ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｍａｘｉｍｕｍ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔ－
ｅｄ．Ｔｈｒｅｅ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｏｆ　ｌｏｗ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ，ｎａｍｅｄ　ＷＬＰ－１，ＷＬＰ－９ａｎｄ　ＷＬＰ－２２．
Ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒａｔｅ（ＳＧＲ）ｏｆ　ｔｈｅｍ　ｗｅｒｅ　２．７９％，２．７２％ａｎｄ　３．０１％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ
ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　２．２１％（Ｐ＜０．０５），ｔｈｅ　ｍａｘｉｍｕｍ　ＳＧＲ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｓｔｒａｉｎｓ．
Ｉｔ　ｉｓ　ｓａｆｅ　ａｎｄ　ｅｆｅｃｔｉｖｅ　ｔｏ　ｕｓｅ　ｔｈｅ　Ｘ－ｒａｙ　ｅｍｉｔｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｃａｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｌｉｎｅａｒ　ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ　ａｓ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｇｅｎ．
Ａｎｄ　ｔｈｅ　ｎｅｗｌｙ　ｒｅｌｅａｓｅｄ　ｃａｒｐｏｓｐｏｒｅｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｃｅｌ　ｗａｌｓ　ａｒｅ　ｍｕｃｈ　ｍｏｒｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　Ｘ－ｒａｙ　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｔｈａｎ
ｔｈｅ　ｓｔｅｍ－ｔｉｐｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ　ｆｏｒ　Ｇｐ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ．
Ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ａｎｄ　ｆｅａｓｉｂｌｅ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　Ｇｐ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒ－
ｍｉｓ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｇｏｏｄ　ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｐｐｌｉｃａ－
ｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｕｔｕｒｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：　 Ｘ－ｒａｙ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；ｈｅａｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ；ｌｏｗ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ；ｆａｓｔ　ｇｒｏｗｉｎｇ；Ｇｒａｃｉｌａｒｉ－
ｏｐｓｉｓ　ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ
责任编辑　高　蓓
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