全 文 ：收稿日期:2015-10-28
基金项目:甘肃省青年科技基金计划项目(1308ＲJYA098);甘肃省科学院应用研究与开发项目(2012JK-02)
作者简介:杨涛(1983-)，男，硕士，助理研究员，研究方向:农林生物技术。
* 通讯作者:周剑平，E-mail:zhjp8818@ 163. com。
濒危药材甘肃贝母试管小鳞茎再生的研究
杨 涛1，王沛雅1，张 军1，郭 琪1，杨 晖1，2，王治业1，2，周剑平2*
(1. 甘肃省科学院生物研究所，甘肃 兰州 730000;2. 甘肃省微生物资源开发利用重点实验室，甘肃 兰州
730000)
摘要 目的:以甘肃贝母鳞茎为外植体，建立组培快繁体系，为资源保护和有效利用奠定基础。方法:研究了
不同的外植体消毒方法，不同的激素浓度及配比，不同的培养条件等对原球茎发生、生长膨大、发芽生长的影响。结
果:通过内吸性杀菌剂预处理，结合二次消毒可以较有效的控制外植体的污染;原球茎诱导过程中以鳞瓣为外植体
的最优激素组合是 ZT 3 mg /L + MEJA 3 mg /L + IAA 3 mg /L + BＲ 0. 3 mg /L(或 GA 4 + 7 0. 2 mg /L)，以鳞心为外植
体最优激素组合是 ZT 2 mg /L + SA 10 mg /L + BＲ 0. 2 mg /L(或 GA 4 + 7 0. 2 mg /L)，鳞心诱导效率高于鳞瓣;原球
茎生长膨大阶段，鳞瓣原球茎生长膨大的最优激素组合是 NAA 3 mg /L + SA 40 mg /L + BＲ 0. 3 mg /L(或 S-3307 5
mg /L)，鳞心原球茎生长膨大的最优激素组合是 NAA 2 mg /L + SA 20 mg /L + BＲ 0. 3 mg /L(或 S-3307 3 mg /L) ，鳞
瓣原球茎生长膨大效果明显优于鳞心原球茎;不同大小的试管小鳞茎在发芽生长特性方面存在较大差异。结论:
建立了甘肃贝母试管小鳞茎的组培再生体系。
关键词 油菜素内酯;甘肃贝母;赤霉素 4 + 7;试管小鳞茎;组织培养
中图分类号:Ｒ282. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2016)05-0971-04
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2016. 05. 006
甘肃贝母 Fritillaria przewalskii Maxim. 分布于
甘肃南部、四川西部、青海东部和南部、陕西西部，生
长在海拔 2 800 ～ 4 400 m 的灌丛中或草地上，是著
名药材川贝母的基原植物〔1〕。甘肃贝母从播种到
开花需要 4 ～ 5 年，主要以种子繁殖为主，种子存在
形态和生理双重休眠，实生苗生长非常缓慢，生长周
期长〔2〕。甘肃贝母自身的生长习性导致其人工栽
培很困难，造成资源紧缺。通过生物技术的手段，在
试管中繁育优质小鳞茎，探索其生长状况，以期为资
源的保护和集约化生产奠定基础，为解决贝母生长
缓慢的问题开辟新的途径。
1 材料与方法
1. 1 材料 每年 6 月中旬在甘肃岷县采挖开花的
甘肃贝母 Fritillaria przewalskii Maxim. ，鳞茎既可直
接用于试验，也可 － 1 ℃沙藏。
1. 2 试剂 MS 培养基、1 /2MS 培养基、蔗糖、琼
脂、活性炭等均为分析纯试剂。吲哚乙酸(Indolea-
cetic acid，IAA)、萘乙酸(Naphthylacetic acid，NAA)、
玉米素(Zeatin，ZT)、赤霉素 4 + 7(Gibberellic acid，
GA 4 + 7)、油菜素内酯(Epibrassinolide，BＲ)、水杨
酸(Salicylic acid，SA )、茉莉酸甲酯(Methyl jas-
monate，MEJA)、烯效唑(Uniconazole，S-3307)等均为
生物纯试剂。培养基均 121 ℃灭菌 20 min。
1. 3 试验方法
1. 3. 1 外植体的预处理:将新鲜的或贮藏的甘肃
贝母鳞茎用洗衣粉水清洗干净，自来水流水冲洗，用
1000 倍液的内吸性杀菌剂(嘧菌酯和农用链霉素)
浸泡 20 min，期间不断搅拌，自来水流水冲洗干净备
用。
1. 3. 2 外植体的消毒:将上述材料分掰成鳞瓣和
鳞心，分别进行外植体消毒，鳞心采用单次消毒法:
用 0. 2%的生汞浸泡 20 min，期间不断摇晃，灭菌蒸
馏水冲洗 3 ～ 5 遍;鳞瓣采用二次消毒法:用 0. 2%
的生汞浸泡 20 min，期间不断摇晃，灭菌蒸馏水冲洗
3 ～ 5 遍，接种于 MS 培养基，23 ℃培养，间隔 2 天，
再用 0. 2%的生汞浸泡 20 min，期间不断摇晃，灭菌
蒸馏水冲洗 3 ～ 5 遍，接种于原球茎诱导培养基。
1. 3. 3 原球茎的诱导:以含有 50 g /L 蔗糖，2 g /L
活性炭的 1 /2 MS固体培养基为基础，分别添加不同
搭配组合和浓度的 ZT、BＲ、GA 4 + 7、MEJA、SA、
IAA，将上述外植体消毒后的材料接入上述不同培
养基，黑暗条件下分别于(16 ± 2)℃和(23 ± 2)℃培
养，40 天后统计原球茎诱导率(长出原球茎的外植
体个数 /接种外植体个数)。
1. 3. 4 原球茎的膨大:以含有 80 g /L 蔗糖，2 g /L
活性炭，500 mg /L 水解酪蛋白，500 mg /L 酵母提取
物的 MS 固体培养基为基础，分别添加不同搭配组
合和浓度的 NAA、SA、BＲ、S-3307，将诱导的原球茎
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接入上述不同的培养基，黑暗条件下(16 ± 2)℃和
(23 ± 2)℃培养，60 天后测量试管小鳞茎直径。
1. 3. 5 试管小鳞茎的发芽与生长:将上述试管小
鳞茎接入含有 20 g /L 蔗糖的 1 /2 MS 固体培养基，
16 ℃，光暗周期 10 h /14 h条件下培养，20 天左右统
计其发芽率，观察生长情况;或将试管小鳞茎埋藏于
草炭土 +珍珠岩 +蛭石(3∶ 1∶ 1)配有少许陶粒的混
合基质中，放置于 16 ℃，光暗周期 10 h /14 h条件下
培养，统计其发芽率，观察生长情况。
2 结果与分析
2. 1 不同处理方法对外植体消毒的效果 前期预
试验表明，使用传统的外植体消毒方法，很难达到有
效的外植体消毒。本实验使用内吸性的杀菌剂浸泡
处理，然后进行外植体消毒，有效的解决了以鳞心为
外植体的污染问题;因鳞瓣含有内生菌及从伤口和
病斑处入侵的深层菌，内吸性杀菌剂预处理只是有
效的抑制了菌落的生长，随着培养时间的延长，外植
体污染会逐渐增加。本实验也试图通过一些市售的
复配外植体消毒剂和培养基中添加抗菌素解决外植
体污染问题，但外植体褐化率增加，生长发育受到影
响。
2. 2 不同激素配比对原球茎发生的影响 在前期
预试验的基础上，着重研究了表 1 中不同处理对原
球茎诱导的影响。以鳞瓣为外植体，玉米素、茉莉酸
甲酯、有机酸(水杨酸或吲哚乙酸)与赤霉素或油菜
素内酯搭配组合都能诱导出原球茎。水杨酸和吲哚
乙酸的差异主要表现在诱导起始时间，吲哚乙酸能
够提前 10 天左右诱导出原球茎，起始效果较好;赤
霉素和油菜素内酯差异主要表现在:随着赤霉素浓
度的升高，诱导率逐渐降低，并且有发育成细长芽的
趋势;随着油菜素内酯浓度的升高，诱导率逐渐提
高，有发育成圆润饱满原球茎的趋势。以鳞心为外
植体，因其自身含有的激素较多，玉米素、有机酸
(茉莉酸甲酯、水杨酸、吲哚乙酸)与赤霉素或油菜
素内酯的激素组合就可以诱导原球茎的发生，但不
同的处理有所差异，同样浓度的赤霉素和油菜素内
酯相比，赤霉素趋向于发育成芽而油菜素内酯趋向
于原球茎的发育，吲哚乙酸能够提前诱导起始的时
间。图 1 是分别为以鳞心和鳞瓣为外植体诱导出的
原球茎。在 16 ℃和 23 ℃的条件下，都可以诱导出
原球茎，随着温度的升高，诱导速度逐渐加快，但温
度过高(如 25 ℃以上)会导致外植体材料的休眠。
不同的外植体实际诱导效率差别较大，鳞心较鳞瓣
外植体消毒效果好，而且是生长中心，不同处理的诱
导效率都较高，基本都能够达到 85%以上;而鳞瓣
除了污染严重，显著影响诱导率外，鳞瓣的大小、厚
度、颜色等都对诱导率存在直接的影响，大小越大、
厚度越厚、比重越大诱导率越高，颜色发青则诱导的
难度较大。除此之外，还研究了不同的取材时间对
原球茎诱导的影响，6 月取材直接用于试验，诱导效
率最高，而随着低温沙藏时间的延长，诱导率呈现出
先降低后升高的趋势，这种现象的发生，可能是因为
取样时贝母处于旺盛生长时期，随着低温贮藏时间
的延长，逐渐进入休眠，诱导率降低，随着贮藏时间
超过 5 个月，休眠逐渐解除，诱导率重新升高。
2. 3 不同激素配比对原球茎生长膨大的影响 在
前期预试验的基础上，着重研究了表 2 中不同浓度
的激素搭配组合对原球茎生长膨大的影响。以鳞心
为外植体诱导的原球茎在上述不同激素组合的培养
基中生长速度都较慢，但快于不加任何激素的对照，
表 1 不同激素配比对甘肃贝母原球茎发生的影响
处理 外植体
玉米素
/(mg /L)
赤霉素
/(mg /L)
油菜素内酯
/(mg /L)
茉莉酸甲酯
/(mg /L)
水杨酸
/(mg /L)
吲哚乙酸
/(mg /L)
诱导率
/%
开始形成
时间 /d
每外植体
原球茎个数
原球茎生长状况
1 鳞瓣 3 0. 2 0 3 20 0 70 30 1 ～ 2 细长，芽趋势，效果好
2 3 0. 2 0 3 0 3 73 20 1 ～ 2 细长，芽趋势，效果更好
3 3 2 0 3 20 0 43 30 2 ～ 3 细长，芽趋势
4 3 2 0 3 0 3 50 20 2 ～ 3 细长，芽趋势
5 3 0 0. 03 3 20 0 53 30 2 ～ 3 细长，芽趋势
6 3 0 0. 03 3 0 3 58 20 2 ～ 3 细长，芽趋势
7 3 0 0. 3 3 20 0 68 30 2 ～ 3 饱满，鳞茎趋势，效果好
8 3 0 0. 3 3 0 3 75 20 2 ～ 3 饱满，鳞茎趋势，效果最好
9 鳞心 2 0. 2 0 3 0 0 88 25 3 ～ 4 细长，芽趋势，效果好
10 2 0. 2 0 0 10 0 90 25 4 ～ 5 细长，芽趋势，效果更好
11 2 0. 2 0 0 0 3 86 18 3 ～ 4 细长，芽趋势，效果好
12 2 0 0. 2 3 0 0 90 25 3 ～ 4 饱满，鳞茎趋势，效果好
13 2 0 0. 2 0 10 0 93 25 4 ～ 5 饱满，鳞茎趋势，效果最好
14 2 0 0. 2 0 0 3 89 18 3 ～ 4 饱满，鳞茎趋势，效果好
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图 1 不同外植体诱导的甘肃贝母原球茎
A. 鳞瓣外植体诱导的原球茎 B. 鳞心外植体诱导的原球茎
图 2 不同外植体来源的甘肃贝母原球茎生长膨大情况
A. 鳞瓣原球茎生长膨大 B. 鳞心原球茎生长膨大
暗示培养基的营养成分有待于进一步筛选。香蕉提
取物、马铃薯提取物等活性提取物能否促进生长，有
待进一步研究;原球茎营养吸收能力较弱，如果生长
膨大时能诱导出根系效果可能会更好。在不同激素
的使用中，随着水杨酸浓度的增加，褐化现象逐渐增
加，高浓度的油菜素内酯和高浓度的烯效唑对原球
茎的生长膨大都有促进作用。以鳞瓣为外植体诱导
的原球茎生长膨大速度都较快。在不同激素的使用
中，高浓度的油菜素内酯和烯效唑都能够诱导原球
茎的径向生长，而低浓度的油菜素内酯促进原球茎
纵向生长，并且有长叶的趋势。图 2 是分别为以鳞
瓣和鳞心诱导的原球茎生长膨大情况。上述两种材
料诱导的原球茎在 16 ℃和 23 ℃的不同温度培养条
件下，都表现出较低的温度生长速度较快，可能是因
为甘肃贝母是一种高山喜冷凉的野生种，自然生长
环境的温度较低所至。
表 2 不同激素配比对甘肃贝母原球茎生长膨大的影响
处理 材料
萘乙酸
/(mg /L)
水杨酸
/(mg /L)
油菜素内酯
/(mg /L)
烯效唑
/(mg /L)
小鳞茎直径
/mm 小鳞茎生长状况
1 鳞心原球茎 2 20 0. 3 0 2 ± 0. 5 生长缓慢
2 2 40 0. 3 0 2 ± 0. 5 生长缓慢，褐化
3 2 20 0 3 2 ± 0. 5 生长缓慢
CK 0 0 0 0 1 ± 0. 5 生长更缓慢
4 鳞瓣原球茎 3 40 0. 03 0 3 ± 0. 5 生长更快，趋向于长叶
5 3 40 0. 3 0 5 ± 0. 5 生长最快
6 3 40 0 5 5 ± 0. 5 生长最快
CK 0 0 0 0 2 ± 0. 5 生长缓慢
2. 4 不同条件下试管小鳞茎的生长状况比较 上
述试管小鳞茎接种在培养基中，10 天左右顶端变
绿，有发芽趋势(如图 3-A)。20 天统计发芽率，2
mm以下的小鳞茎发芽率较低;2 ～ 5 mm 的小鳞茎
90%以上都能发芽，芽是由鳞瓣顶端长出的鳞片叶;
5 mm以上的小鳞茎能够长出心芽，但发芽非常缓
慢，可能是因为心芽结构尚未发育完全，存在形态和
生理休眠的缘故(如图 3-B)。40 天左右观察不同
大小的小鳞茎生长状况，小于 2 mm和大于 5 mm的
小鳞茎没有明显变化，而 2 ～ 5 mm 的小鳞茎明显的
观察到生长量增加，小鳞茎直径增大，但表面形成紫
色的斑点，可能是因为试验光照度过强，光质不适合
贝母生长所致(如图 3-C)。将试管小鳞茎直接栽培
于无土基质中，污染、腐烂现象较为严重，能够发芽
的主要是 2 ～ 5 mm的小鳞茎，发芽出苗时间较试管
中推迟 20 天左右，鳞瓣叶较试管中细弱，但叶色更
加浓绿(如图 3-D)。
3 讨论
本研究沿着甘肃贝母试管原球茎的诱导、试管
图 3 甘肃贝母试管小鳞茎不同条件下生长情况
A. 试管条件下 10 天试管小鳞茎开始发芽 B. 试管条件下
20 天不同大小的试管小鳞茎出芽情况 C. 试管条件下试管
小鳞茎 40 天生长状况 D. 无土基质条件下试管小鳞茎生
长状况
小鳞茎的膨大、小鳞茎的发芽生长的策略，分别研究
了不同阶段的培养基组成、激素浓度和配比、培养条
件等对组培再生体系建立的影响。有别于张振霞
等〔3〕通过外植体或愈伤组织诱导不定芽的研究。
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本研究较不定芽诱导方法具有培养周期短、节省能
源、试管鳞茎方便运输贮藏、栽培便捷、成活率高等
优点。但也有一些问题有待进一步研究和解决，主
要有如下几个方面:(1)本研究主要以甘肃贝母鳞
茎为外植体进行相关研究，也选取叶片、茎杆进行了
相关试验，效果不甚理想，因取材困难以花茎为外植
体尚未进行试验。(2)外植体的消毒是制约组培结
果的首要因素，虽然试验采取了内吸性杀菌剂预处
理及二次消毒等方法有效的提高了消毒效果，但随
着培养时间的延长，内生性杂菌、损伤部位深部菌仍
然会影响试验，尤其是以鳞瓣为外植体影响更为严
重。试验筛选了一些防腐剂添加于培养基中，虽有
效的抑制了杂菌污染，但对植株的生长有一些抑制
作用，需要进一步研究。(3)本研究发现高浓度的
油菜素内酯和低浓度的赤霉素较低浓度的油菜素内
酯和高浓度的赤霉素更容易诱导原球茎的发生，油
菜素内酯和赤霉素在信号传递途径中是否有上下游
的负相关性有待深入研究。
参 考 文 献
［1］国家药典委员会 . 中华人民共和国药典［S］．一部 . 北
京:中国医药科技出版社，2010:34-35.
［2］潘宣 . 百合川贝母平贝母伊贝母［M］．北京:科学技术
文献出版社，2004.
［3］张振霞，李彩萍，张秋枚，等 . 甘肃贝母的组织培养和植
株再生研究［J］．北方园艺，2014，(10) :80-84.
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