全 文 ：氯氰菊酯对斜生栅藻的毒性研究
熊　丽　吴振斌　况琪军　夏宜 　贺　锋
(淡水生态与生物技术国家重点实验室 ;中国科学院水生生物研究所 ,武汉　 430072)
摘要: 研究了农药氯氰菊酯对斜生栅藻的毒性效应 ,结果显示:以丙酮为溶剂时 ,其 96 h EC50
为 112. 45mg / L;以乙酸乙酯为溶剂时 ,其 96 h EC50为 112. 81mg /L。同时也研究了氯氰菊酯
对斜生栅藻的光合色素含量、色素光谱、可溶性蛋白质含量和超氧物歧化酶活性的影响。
关键词: 氯氰菊酯 ;斜生栅藻 ;毒性
中图分类号: X17　　文献标识码: A　　文章编号: 1000-3207( 2002) 01-0066-008
拟除虫菊酯是一类含有苯氧烷基的环丙烷酯 ,由于具有杀虫高效性 ,自 70年代以来
已得到广泛应用 [1 ]。氯氰菊酯 ( Cypermeth rin)又称灭百可、兴棉宝 ,是拟除虫菊酯类的广
谱性杀虫剂 ,为一种神经轴突毒剂 ,适用于棉花、水稻、蔬菜、果树和茶叶等多种作物上害
虫的防治 [2 ]。 施于环境中的农药 ,不仅作用于靶生物以防治病害 ,而且对非靶生物也产生
影响 ,从而导致生态系统结构改变 ,功能破坏。
拟除虫菊酯虽然对哺乳动物等非靶生物低毒 ,但它对鱼类、水蚤等水生动物的毒性却
很高 [3— 6 ]。藻类作为水生态系统的初级生产者 ,其种类的多样性和初级生产量直接影响水
生态系统的结构功能。 因而成为监测评价水环境质量的重要指标 [7 ]。 斜生栅藻对毒物敏
感、易获得、个体小、繁殖快 ,在较短时间内可得到化学物质对其许多世代及种群水平的影
响评价 ,是一种很好的测试生物。但一般地说 ,栅藻、小球藻对农药的抗性较强 [8 ] ,故恢复
较快 ,不同天数的 EC50值有较大差别。本实验选择极常见的浮游藻类斜生栅藻作为实验
生物 ,研究氯氰菊酯对其毒性 ,以期为探讨农药对藻类的毒理积累科学依据 ,同时为国家
制定水质标准提供参考。
1　材料与方法
1. 1　实验材料和化学药品　斜生栅藻 ( Scenedesmus obliquus Kǜ t z)由中国科学院水生生
物研究所淡水藻种库提供 ,编号 FACHB39。氯氰菊酯为白色晶体 ,纯度为 96. 4% ,由湖北
省农业科学研究院国家农药检测中心提供。
收稿日期: 2000-10-10;修订日期: 2000-10-25
基金项目:国家杰出青年科学基金项目 ( 39925007) ;欧盟国际合作项目 ( ERBIC18CT960059)
作者简介:熊丽 ( 1968— ) ,女 ,湖北省十堰市人 ;讲师 ,博士生 ;环境生物学专业 ,从事生态毒理学研究。华中师范大
学 2000级硕士研究生袁静参加了部分工作 ,特此致谢
通讯作者:吴振斌
第 2 6卷第 1期
2 0 0 2年 1月
水 生 生 物 学 报　
　 　 　 　 ACT A HYDROBIOLOGICA SIN ICA　 　 　 　　
Vo l. 26, No. 1
Jan . , 2 0 0 2
1. 2　驯化培养　斜生栅藻在无菌条件下转移至水生 4号 ( HB-4)人工培养液中 [ 9] ,培养
至对数生长期进一步扩大培养。培养条件为:温度 25— 28℃ ; pH7— 8;白色日光灯 ,光暗比
12h∶ 12h ,光强为 3000lx左右 ;静止培养 ,每天定时人工摇动三次。
1. 3　溶剂 NOEC值的测定　分别以丙酮和乙酸乙酯为溶剂设置 5个浓度组和一个空白
对照组 , 96h后用血球计数板显微计数 ,测定藻细胞的密度 (个 /mL) ,计算各自的 NO EC
值。
1. 4　以丙酮和乙酸乙酯为溶剂测定 EC50　以丙酮和乙酸乙酯为溶剂配制氯氰菊酯母
液 ,根据预实验的结果设置 5个浓度组和一个空白对照组 ,每个组设三个平行样 ,测定氯
氰菊酯对斜生栅藻的毒性。每隔 24h取样 ,用血球计数板显微计数 ,测定藻细胞的密度 (个
/mL) ,并测定 650nm波长处的光密度值。用概率单位 -浓度对数法 [ 10]分别计算出 96h半
效应浓度 ( EC50 )。以生物量为实验终点计算的 50%抑制浓度记为 EC50。最大特定生长率
( U)按以下公式计算:
U= ( LnNt - LnN0 ) / ( t- t0 )
N 0 , Nt: 分别为开始期 ( t0 )和 t时刻 ( t )的细胞数。
抑制率 ( I% )= ( Uck- Utox ) /Uck* 100
Uck: 对照组的生长速度 , Utox:有供试化合物时的生长速度。
根据抑制率的机率单位和相应的浓度对数 ,用直线回归法得到浓度效应方程 ,计算出
半效应浓度 ( EC50 )。 并将回归方程进行 X2检验 ,结果 P < 0. 05,表明结果可靠 ,统计分析
用 ST ATISTICA软件进行。
1. 5　氯氰菊酯对斜生栅藻生理特性的影响　根据以上测得的 EC50 ,设置两个浓度组 ,一
个以丙酮为溶剂 ;另一个以乙酸乙酯为溶剂。同时设置两个溶剂对照组和一个空白对照
组。每隔 24 h取样 ,测定藻细胞浓度。 96h后 ,五个试样组均按以下步骤操作。取 10m L藻
液 ,过孔径 0. 8μm醋酸纤维素滤膜 ,真空抽滤后 ,剪碎滤膜 ,转移到 10mL具塞试管中 ,加
80%丙酮 5mL,置黑暗中抽提 24h, 4 000r /min离心 5min,取上清置于 1cm石英比色杯
中 ,于紫外-可见光分光光度计 (岛津 , UV-1601型 ) ,以 80%丙酮为参比 ,记录 350—
750nm波长范围内色素吸收光谱。
测定藻类色素含量采用分光光度法。具体方法为: 取 20mL藻液 , 4 000r /min离心
10min,去上清 ,直接加入 5mL 80%的丙酮 ,摇匀 ,在黑暗处抽提 24h。 再分别于 663nm ,
645nm和 440nm波长处测定抽提液的吸光值。 96h后 ,离心收集藻细胞 ,真空冷冻干燥 ,
低温保存 ,用于测定可溶性蛋白质含量和超氧物歧化酶 ( SOD)活性。蛋白质含量用 Folin-
酚法测定 [11 ] ,以小牛血清蛋白作标准曲线。 SOD活性测定用 NBT光还原反应法 [ 12]。
2　结果与分析
2. 1　溶剂 NOEC值的测定
不可见效应浓度 ( No Observ ed Ef fect Concentra tion, NOEC)值可以用下述方法确
定: ( 1)通过方差分析 ,与空白试验组没有显著性差异的最高浓度 ,可以认为是 NOEC值。
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(本实验即采用此法 )。( 2)根据实验得到的良好的浓度- 效应关系 ,与空白实验组相比 ,影
响程度低于 10%的浓度 ,也可以当做 NO EC值。
2. 1. 1　丙酮的 NOEC值的测定　分别以 0. 1% , 0. 15% , 0. 20% , 0. 50%和 1%的丙酮处
理斜生栅藻 ,结果显示 , 96h后 ,与对照组相比 , 0. 1%及以下浓度的丙酮对斜生栅藻的生
长有促进作用 , 0. 50%和 1%的丙酮有明显的抑制作用 ,经方差分析 ,丙酮对斜生栅藻的
NO EC值为 0. 15% ,即正式实验中丙酮的浓度应低于 0. 15%。
2. 1. 2　乙酸乙酯的 NOEC值的测定　同上以 0. 1% , 0. 15% , 0. 20% , 0. 50%和 1%的乙
酸乙酯处理斜生栅藻 ,结果表明其 NO EC值为 0. 20% 。
2. 2　氯氰菊酯对斜生栅藻的毒性效应
2. 2. 1　氯氰菊酯对斜生栅藻生长的影响　用不同浓度的氯氰菊酯处理 (乙酸乙酯为溶
剂 ) ,以藻细胞密度为指标所作的生长曲线见图 1。由图 1可以看出 ,加了氯氰菊酯的各试
样组中 ,藻细胞的生长受到不同程度的抑制 ,且抑制程度与氯氰菊酯的浓度呈正相关 ,显
示明显的浓度 -剂量相关性。 另一方面 ,镜检过程中 ,在氯氰菊酯高浓度时 ,可以观察到部
分藻细胞体积增大 ,子细胞出现畸形分裂 ,出现人字形和裤形 ,这种现象和其它作者在高
温和城市污水对栅藻细胞形态所产生的影响有相似之处 [ 13, 14] ,说明氯氰菊酯使斜生栅藻
的生长与分裂产生一定的脱偶联作用。
由图 1的数据 ,用前面所介绍的方法得到不同时间的概率单位 -浓度对数曲线方程 ,
如下:
概率单位 ( Y)= b×浓度对数 (X)+ a
经统计分析 ,确定各时间 ( 24h、 48h、 72h、 96h )的 EC50值及其 95%置信区间 ,如表 1所
示。
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表 1　氯氰菊酯对斜生栅藻的毒性
Tab. 1　 The toxici ty of Cyp ermeth rin to S . obliquus
回归方程 EC50 r Up Dow n
24h y= 0. 6346x+ 2. 4547 55. 20 0. 976 65. 56 44. 70
48h y= 0. 9795x- 0. 1304 188. 25 0. 994 228. 59 147. 53
72h y= 1. 0894x- 0. 2193 120. 42 0. 994 135. 10 106. 38
96h y= 1. 1545x- 0. 4521 112. 45 0. 998 122. 24 103. 44
96h的 EC50为 112. 45mg /L,由表 1可见以乙酸乙酯做溶剂时 ,氯氰菊酯对斜生栅藻
的毒性较低。另一方面 ,随着天数增加 , EC50急剧上升 ,且数值较大。显示斜生栅藻抗性较
大 ,恢复很快。同样测得以丙酮为溶剂的 EC50为 112. 81mg /L。结果见表 2。
表 2　氯氰菊酯在不同溶剂中的 EC50
Tab. 2　 EC50 of Cypermethrin diss olved in dif ferent s olv en ts
回归方程 EC50 r Up Dow n
96Hrs y= 1. 1545x- 0. 4521 112. 45 0. 998 122. 24 103. 44
96Hrs y= 1. 0624x- 0. 0206 112. 81 1. 000 120. 78 108. 31
2. 2. 2　在两种不同溶剂中的毒性对比试验结果　由图 2可见 , A、 B两组栅藻的生长均
低于对照组 ,但 A组 (以乙酸乙酯为溶剂 )藻细胞的生长情况比 B组 (以丙酮为溶剂 )好。
说明在两种情况下 ,氯氰菊酯对斜生栅藻生长的抑制作用不同 ,以丙酮为溶剂时的抑制作
用较大。
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2. 3　氯氰菊酯对斜生栅藻的生理生化特性的影响
2. 3. 1　氯氰菊酯对斜生栅藻的光合色素含量的影响　将 96h藻液的叶绿素 a( C-a ) ,叶
绿素 b( C-b) ,叶绿素总量 ( C-a+ b)和类胡萝卜素 ( C-k)含量以及叶绿素 a /叶绿素 b列于
表 3。
表 3　氯氰菊酯对斜生栅藻光合色素的影响
Tab. 3　 Ef fect of Cypermethrin on th e pigment in S . obliquus
Chl CK B丙酮 A乙酸乙酯
C-a 3. 74 1. 59 3. 27
C-b 1. 32 0. 66 1. 25
C-a+ b 5. 07 2. 25 4. 51
C-k 1. 73 0. 92 1. 75
C-a /C-b 2. 83 2. 41 2. 62
由表 3可看出 ,不论用何种溶剂 ,氯氰菊酯均显著减少斜生栅藻的光和色素含量。 其
中对叶绿素 a影响最大 , B组 (丙酮溶 )的叶绿素 a含量比对照组减少了 57. 5% ; A组 (乙
酸乙酯溶 )比对照组减少 12. 7%。叶绿素 k对环境变化最敏感 , B组叶绿素 k比对照组减
少 46. 7% ,而 A组叶绿素 k则比对照组增加 1. 1% 。叶绿素 a /b值亦有变化 ,表明叶绿素
的结构受到一定损害。
2. 3. 2　氯氰菊酯对斜生栅藻色素光谱的影响　实验分别选用空白组 ( CK)、 B组和 A组
的三种藻细胞作为测定色素吸收光谱的样品 ,结果见图 3。结果表明 ,在 96h内 ,斜生栅藻
各样品吸收光谱谱带完全相似 ,在红光区 663nm处和蓝光区 430nm处均出现明显的峰 ,
不同的处理明显影响了峰值的大小 ,这与光合色素含量的变化是一致的。
图 3　斜生栅藻 96h色素的吸收光谱
Fig. 3　 Absorpt ion spect rum of S . obliquus af ter 96h
1. 对照　 2. 处理 A　 3.处理 B
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2. 3. 3　氯氰菊酯对斜生栅藻可溶性蛋白质含量的影响　斜生栅藻在不同条件下培养
96h后 ,其可溶性蛋白含量如图 4。总体上 ,不论何种处理 ,有氯氰菊酯存在下栅藻的蛋白
质含量均比对照组低。但 (丙酮溶 )比处理 A(乙酸乙酯溶 )的蛋白质含量降低更多 ,可见处
理 B对斜生栅藻的毒性更大。另外 ,不同浓度处理 ,蛋白质含量亦有不同 ,但变化不显著。
图 4　氯氰菊酯对斜生栅藻可溶性蛋白质含量的影响
Fig. 4　 Ef fect of cyperm ethrinon on solu ble protein conten t of S. obl iquus
1. 对照　 2. 50mg /L　 3. 100mg /L　 4. 150mg /L　 5. 200mg /L　 6. 250mg /L
2. 3. 4　氯氰菊酯对斜生栅藻 SOD活性的影响　 96h后 ,斜生栅藻的 SO D活性的变化如
图 5。 从图中可看出 ,随着氯氰菊酯浓度的升高 ,不论何种处理 , SOD活性均迅速上升 ,
50mg /L处理时 , SOD活性即达到最高值 ,而后各处理 SOD活性变化不显著 ,但仍维持较
高水平。两种溶剂处理的 SOD活性有较大差异 ,丙酮为溶剂的氯氰菊酯处理组 ,其 SOD
活性均高于乙酸乙酯为溶剂的处理 ,显示明显的应激反应。
图 5　氯氰菊酯对斜生栅藻 SOD活性的影响
Fig. 5　 Effect of Cyperm ethrin on SOD act ivi ty of S . obl iquus
1. 对照　 2. 50mg /L　 3. 100mg /L　 4. 150mg /L　 5. 200mg /L　 6. 250mg /L
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3　讨论
氯氰菊酯对斜生栅藻 96h的 EC50为 112. 45mg /L,而在其它资料 [ 15]中记载的一般农
药对栅藻的 EC50都较低 ,如林丹的为 2. 5mg /L( 96h ) ,单甲脒的为 6. 5mg /L ( 96h ) ,甲基
对硫磷的为 15mg /L( 72h )。 相比较可见氯氰菊酯对非靶生物中的水生藻类也是低毒的。
如今 ,氯氰菊酯被广泛用于农用杀虫药剂和家用驱蚊剂。 本实验表明 ,氯氰菊酯对水生态
系统中的藻类也是安全的 ,值得推广。斜生栅藻对不同溶剂中的氯氰菊酯的抗性不同。以
乙酸乙酯为溶剂的情况下 ,藻的抗性很高 ,恢复较快。以丙酮为溶剂情况下 ,藻的抗性低 ,
恢复慢。这表现在以丙酮为溶剂时 ,氯氰菊酯的长期毒性较高些。
由于许多农药难溶于水 ,在毒性试验中常使用佐剂 (农药的溶剂和乳化剂 ) ,佐剂与农
药对藻类的复合毒性表现为加合、协同或拮抗效应 [15 ]。本试验中 ,乙酸乙酯与农药表现出
拮抗作用。由于乙酸乙酯是酯溶性的 ,估计其与氯氰菊酯对细胞膜通道有竞争作用。而丙
酮与农药表现出协同作用。 Stra t ton [16 ]发现丙酮对藻类有毒性 ,并且认为其毒性在于破坏
膜的结构。因而 ,当丙酮破坏了细胞膜结构后 ,细胞严重损伤 ,抵抗能力减弱。在这种情况
下即使低毒性的氯氰菊酯也可能对有机体造成很大的细胞损伤 ,从而使两种受试物在生
物效应上表现出协同效应。氯氰菊酯对栅藻光合色素含量亦有影响 ,三种色素 (叶绿素 a ,
叶绿素 b和类胡萝卜素 )的含量均有所下降 ,表现明显的毒性作用。其中叶绿素 a和类胡
萝卜素变化更为敏感 ,可作为生理毒性指标 [17 ]。
斜生栅藻的可溶性蛋白含量的变化和其生长的变化趋势一致 ,但 SOD活性的变化比
生长的变化超前 , SOD活性的变化 ,是生物对环境的应激反应 ,对生物本身有保护作用。
可以说 ,细胞内 SO D活性变化可以从一个侧面反映生物所处的环境状况。当 SO D活性明
显升高 ,说明了环境中污染物含量有所增加 ,此时细胞内解毒酶系统被诱导 [18 ]。由于这种
应激反应是发生在细胞内分子水平上 ,其变化要比生物的生长或繁殖对环境的变化更灵
敏 ;且环境中能诱导产生活性氧的污染物很多 ,因此 ,反映污染物的范围更广。 可见 SOD
活性是灵敏的生化指标之一 ,可作为污染的早期预警。
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STUDIESON THE TOXICITY OF CYPERMETHRIN
TOSCENEDESMUS OBLIQUUS
XIONG Li , WU Zhen-bin, KU ANG Qi-jun, XIA Yi-cheng and HE Feng
( State Key Laboratory of Fresh water Ecology and B iotechnology; Insti tute of Hydrobiology ,
The Ch inese Academy of Sciences , Wuhan　 430072)
Abstract: In this paper, the toxicity of cypermethrin on Scenedesmus obliquus Kǜ t z is st-
udied. It indicated that the 96h EC50 i s 112. 45mg /L in acetone, and 112. 81mg /L in
ethyl acetate. M eanwhile, the contents of the pigments, thei r absorption spect rum ,
soluable pro tein and the activ ity o f SOD are also studied.
Key words: Cypermethrin; Scenedesmus obliquus Kǜ t z; Toxici ty
731期　　　　　　　　　　　熊　丽等: 氯氰菊酯对斜生栅藻的毒性研究