全 文 ：1 4 4
中 国 药 科 大 学 学 报
Jo u r na l o f C i h na P ha r m a eu e tica l U ni v er s i ty 1 2 9 9; 2 3( 3)
: 14 4 一 1 4 7
暗紫贝母鳞茎器官培养生长特征和
生物碱累积的研究
高山林 朱丹妮 , 蔡朝晖 徐德然
(遗传育种研究室 ; ’ 中药理论研究室 )
摘 典 本文应用组织培养中器官培养技术对我国特有的名贵中药材一暗紫贝母进行了生长 ,
t
、 生物碱含量等八个指标和培养天数关系的研究 。 结果表明 :培养 3 0一 50 d 期间是鳞茎组织快速
生长期 , 50 d 时鳞茎培养物中干物质积累最高 ,为适宜采收期· 培养鳞茎在全生长阶段中生物孩含
t 都较高 ,是野生商品药材的 1 . 2 一 1 . 50 倍 ,从而有效地保持和提高了主要化学成分 。
关镇询 暗紫贝母 ,器官培养 ;生物碱
暗紫贝母 (外添如而 。 : 让甲口改公勿 H ias o e t
K
.
C
.
isH a) 是我国特有的名贵中药材 , 是川
贝母的主要植物来源之一 , 为止咳化痰 , 清
热润肺之要药 , 味甘而补 , 尤其适合于老年
人和儿童久治不愈的顽固性虚寒咳嗽 , 国内
药材市场的需求量较大 。 但是暗紫贝母只能
野生在川藏一带海拔 3 0 0 0一 3 5 0 0 m 寒冷的
高原地带 ,半荫蔽 , 富含腐殖质的黑油沙土
中 , 种子需经过四年才能长成商品药材 lj[ 。
由于暗紫贝母对气候 、 温度 、 土质等生长环
境条件要求特殊 ,人工栽培很困难 , 商品药
材全靠采挖野生资源 , 由于连年过度采挖 ,
资撅日趋减少并面临枯竭 。
植物组织培养是近几年发展较快 ,应用
价值较高的生物技术之一 , 在药用植物开发
研究和生产中具有特殊的意义和应用潜力 。
暗紫贝母组织培养未见报道 , 我们把暗紫贝
母药用部位 一 一鳞茎的器官培养作为主攻
方向 , 以期克服和避免愈伤组织尤其是细胞
培养中由于脱分化带来的化学成分下降的
问题 ,从而保证应有的药效 。
培养材料采集于四川省阿坝自治州红
原县山区 ,全株标本均经本校生药教研室鉴
定为暗紫贝母 (外 “沥 , 她 抓扮 a c et a at H isa o et
K
.
c
.
sH ia )
。 商品药材见图 1 。
l 材料和方法
1
.
1 培养材抖的采集与鉴定
F地 1 . rC u血 d r u g o f F r山肠叶协 姗沥配自肠如
1
.
2 无菌材料和培养条件
取野外采回的暗紫贝母鳞茎洗净后放
入 2%次氯酸钠溶液中消毒 20 m in ,用无菌
水冲洗 5 次 , 在无菌条件下切成 0 . 5 c m 直
径的方块接种到添加 BA 1 . 0 m g L/ ,认 A 1 . 0
m g L/ 的 M S 培养基上 ,获得无菌材料 , 50 d
后 继代培养并扩大供试材料 , 提供实验种
源 。 培养材料接种在装有 40 ml 培养基的
10 O ml 三角瓶中 ,放入光照培养箱 ,恒温 ( 20
士 1℃ )培养 , 每天 12 h 中等强度光 照 ( 6 0 0
收稿日期 19 9 2一。 3 , 1 8 江苏省科委科研项 目
3期 高山林等 : 暗紫贝母鳞茎器官培养生长特征和生物碱累积的研究 4 15
L u
x)
。
1
.
3试验方法及资料分析计算方法
每瓶接种前后均称取重量 , 测得每瓶接
种量 。 从培养后 30 一 80 d ,每 I O d 随机取出
2 0 瓶分别测定收获量 、 生长率 、 每升培养基
可增鲜重 、折干率 , 每升培养基可增干重 , 培
养鳞茎总生物碱含量和每升培养基可增总
生物碱数量共 8 项指标 ,进行资料汇总统计
分析 ,并绘出培养过程中的生长曲线和生物
碱变化曲线图 。 计算方法如下 :
接种量 ~ 接种后瓶重一接种前瓶重 ( g)
收获量 = 收获前瓶重一收获后瓶重 ( g)
生长率 = 收获量 /接种量
可增鲜重 / L二 (收获量一接种量 ) x 2 5 ( s)
折干率~ 烘干物重量 /鲜重 x 10 % (6 o℃烘 48 h)
可增干重 / L~ 可增鲜重 L/ x 折干率 ( g )
可增生物碱 / L~ 可增干重 / L x 干品生物碱含量 x
1 00 0 (m g )
对接种量 、 收获量和生长率均计算 20 瓶的平均值和
标准误 ( x 士 s )E
1
.
4 总生物城含蚤测定
1
.
4
.
1 仅器和试荆
7 2 2 光栅分光光度计 , p H s 一 Zc 精密 pH
计 , P B Q~ l 型薄层 自动铺板器 , A A 一 6 70 原子
吸收 /光焰发射分光光度计 (配岛津 P R 一 4记
录仪 ) 。 实验所用试剂均为分析纯 。
1
.
.4 2 方法
用采 自产 区的商品暗紫贝母药材作对
照 ,对组织培养得到的鳞茎组织干品及培养
基进行化学成分预测 , 贝母生物碱定性分析
(薄层层析 ) 。 在这一基础上再用酸性染料比
色法测定总生物碱含量 (澳甲酚绿为染料 ,
PH = 5
, 最大吸收波长 41 0 n m , , ~ 0 . 9 9 91
(掀 = 5 )
。
总生物孩含 t ( % )~
应阶段后开始恢复生长 , 30 d 后陆续从切 口
部位萌生出小鳞茎 (图 2 ) , 小鳞茎经过 20 d
长成直径 0 . 5一 1 c m 大小的鳞茎 ,形状大小
和野外暗紫贝母相似 (图 3 ) 。 培养材料 50 d
后即生长缓慢并逐渐停止 。 现将从 30 ~ 8 0 d
每隔 1 d0 取样测定数据列于下表 1 ,与图 4 。
F i g 2
.
C l u m Py b u lb l e t s i n e u l t u r e
Fi g 3
.
C ! u m Py bu lbs a ft e r s u比 u l t u r e
X 1 00%
2 结果与分析
鳞茎切块在培养基上经过 Zo d 静止适
F i g 4
.
H a r v es t目 e u l t u r ed b u l比 of 外角以即如 断砚冲公翻叮的
2
.
1 结果表明在适宜培养基上 ,培养材料
的生长率随培养天数增加迅速增长 , 但增长
14 6中 国 药 科 大 学 学 报 2 3卷
速度在各培养阶段差异较大 ;0 3一 4 o d期间
生长率净增长 0 .“ 8, 40 一 50 d 期间净增长
0
.
7 9 7
,是生长最快的时期 , 50 一 60 d 期间净
增长仅 为 0 . 2 , 60 d 以后生长逐渐减慢 。 这
一生长规律说明 ; 暗紫贝母鳞茎在适宜培养
基上生长最快的时期是培养后 30 一 50 d 。
T a b 1
.
T h e r e l a t i o n s a m o n g e u l t u r a l d a y s , g r o w t h r a t e a n d t h e e o n t e n t o f a l k a l o i d
C u l t u r a l d a y s 3 0 4 0 50 6 0 7 0 8 0
N 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0
I n oc
u l a t de w
e ig h t ( g ) X 士 S E 1 . 3 7 2 士 0 . 04 4 1 . 3 89 士 0 . 05 8 1 . 34 9士 0 . 048 1 . 4 2 6士 0 . 0 4 5 1. 4 25 士 0 . 05 2 1 . 37 0士 0 . 0 65
妇泊 r y . 1团 w e igh t ( g ) X 士 S E 3 . 7 59 士 0 . 19 1 4 . 6 7 2 士 0 . 225 5 . 53 1士 0 . 1 89 6 . 2 1 2士 0 . 2 1 7 6 . 4 7 2 士 0 . 20 2 6 . 45 5士 0 . 2 12
G r o w ht r a t e X 士 S E 2 . 7 3 5 士 0 . 1 0 5 3 . 4 03 士 0 . 1 5 5 4 . 2 0 0士 0 . 2 1 3 4 4 2 0士 0 . 1 8 2 4 . 6 6 1士 0 . 2 1 5 4 . 8 3 5士 0 . 1 8 4
Y i. Id o f f r o h d r es h d r u ` ( g / L ) 59 . 68 8 2 . 0 8 1 0 4. 5 5 1 1 9
.
6 5 1 2 6
.
1 8 12 7
.
1 3
aR
t e o f d r y / f
r es h ( % ) 1 2
.
4 7 1 2
.
1 7 1 3
.
7 1 1 3
.
2 9 1 2
.
7 1 1 1
.
9 8
Y i e ld o f d r u g ( g / L ) 7
.
4 1 1 9
.
9 89 1 4
.
3 3 4 1 5
.
9 0 1 1 6
.
0 37 1 5
.
23 0
C o n t e n t o f a l ka lo i d ( % ) 0
.
0 60 3 1 0
.
0 4 9 0 5 0
.
05 8 4 2 0
.
0 57 9 0 0
.
0 57 8 0 0
.
05 16 3
Y加地 o f a l k目 o id ( m g / L ) 4 . 4 8 8 4 . 8 99 8 . 3 7 4 9 . 20 7 9 . 2 7 1 ` 7 . 8 6 3
ǎ冰é卫。一.当卜。利uoQ
:)
0 5
04
0
.
0 3
0
.
02
ǎ1、碧助,óP忍JO左搜卜
C u it u r a l d a y s
F i s 5
.
G r o w t h e u r v e a n d e o n t e n t o f e r u d e a l k a l o i d s i n e u l t u rde
bu lbs o f 外“ 以如护协 . ”必 r a d 即白 .
2
.
2 从鳞茎培养物折干率看 , 前期随着天数
增加逐渐增高 ,到 培养 50 d 时达到 最高值
13
.
71 %
,此后逐渐下降 ,到 80 d 时降至最低
值 n · 98 写 , 说明 50 d 之前是培养物干物质
积累最佳时期 , 到 50 d 时已长得 比较紧密 ,
含水量少 。 从生长曲线图中每升培养基可增
干重 (实线部分 )变化来看 , 更明显地反映了
上述生长特征 。
2
.
3 生物碱是贝母类药材的主要有效成分 ,
本文把生物碱含量测定作为对培养物的重要
检测指标 ,进行了定性定量分析测定 。 结果表
明 : 组织培养贝母和商品暗紫贝母有一致的
化学成分 , 都具有生物碱 、 有机酸 、 皂贰氨基
酸等 13 种化学成分的显色反应 。 薄层层析结
果表 明 : 组织培养 贝母和商品 贝母都有相似
的几种生物碱 , 有相似的 5一 6 个斑点 。 用酸
性染料比色法测定组培 贝母和商品贝母总生
物碱含量 ,结果表明 :商品暗紫贝母中含量为
.0 0 4 03 0%
, 组织培养物中的各批样含量为
0
.
0 4 9 0 5一 0 . 0 6 0 3 1% ,均高于商品药材 ,是商
品药材的 1 . 2 一 1 . 50 倍 ,说明鳞茎组织培养
可以有效地保持原商品药材的有效化学 成
分 ,从而可望保持应有的药效 2j[ 。
从生物碱含量在整个生长期变化来看 ,
从培养初期至后期 , 始终保持在 比较稳定的
水平 ,这说明 , 生物碱是伴随着生长过程同步
进行合成积 累的 , 并不象大多数次生代谢产
物那样只有到生长后期才合成积累 。 此外从
生物碱含量变化曲线可以看出 , 培养 30 d 时
生物碱含量较高 ,这说明在幼嫩组 织中生物
碱合成累积较好 ,这一结果和前人对 自然植
株中生物碱含量分布的规律相吻合 3[J 。 从图
中生物碱变化曲线可见 ,培养物生长到 40 d
时生物碱含量呈暂时下降趋势 , 可能是这时
鳞茎组织正处于旺盛生长期 , 营养较多地提
供给细胞增殖生长所需 , 生物碱合成速度略
受影响 ;培养到 80 d 生物碱含量开始下降 ,
这是由于生长后期培养基中养分已近耗尽 ,
使生物碱合成受阻 。
2
.
4 综合表中每升培养基可增鲜重 ,培养物
折干率和干品中生物碱含量三项指标计算出
来的每升培养基可产生物碱数量 , 可以看到 :
培养 3 0一 4 o d , 生物碱仅增 加 0 . 4 1 1 m g , 4 0
3期 高山林等 : 暗紫贝母鳞茎器官培养生长特征和生物碱累积的研究 1 4 7
一 O Sd 生物碱猛增 , 净增 加 3 . 4 75 m g , 50 一 综上所述 , 直接采用暗紫贝母鳞茎组织
6 o d 净增加 0 . 8 3 m g , 60 d 以后生物碱几乎 进行器官培养可以有效地避免和克服一般组
不再增加并逐渐下降 , 这一规律说明 ,培养到 织和细胞培养中由于脱分化而带来的化学成
50 d 已接近最高值 , 50 d 以后增长很少 。 可以 分下降的问题 , 保持和提高主要化学成分含
看出 ,暗紫贝母鳞茎组织培养以 50 d 为适宜 量 。 同时生长速度也较快 , 培养 50 d 的鳞茎
采收期 ,和一般植物组织或细胞培养生长周 即达到商品药材形状大小 , 生长速度提高 30
期 30 d 相比 , 长 20 d 左右 , 生长较慢 , 其原因 倍以上 ,而且培养设备条件不太高 , 有较好的
可能和暗紫贝母在 自然条件下对生长环境要 开发应用价值 。
求特殊 , 生长周期长 , 生长慢有关 。 致 谢 暗萦贝毋培养材料承徐国钧教授 、 李萍博
2
.
5 对各生长阶段取 出鳞茎后 的培养基进 士审核 、 鉴定 。
行生物碱定性测定 。 结果表明 ,培养基没有显 参 考 文 献
色反应 , 进一步测定二十倍的培养基浓缩液 ’ 四川省中药学 校栽培教研组编 , 药用作物 栽培学 · 四 川
、 - - . ,
一 、 一 , 一 、 - 二 , 一 _ _ . J , _ ` , ` 中药学 校 . 19 81 , 3 : 3 23 一 3 31 .亦没有特定显色反应 , 由此可见 , 生物碱的合 2 采再婉属一妥;陈一唇等.-组织培养川 贝母化学成分 和
成累积仅局限于培养物组织 内 , 不能排入培 药理作 用的研究 , 中国药科 大学学私 ’ 9 9“ ; 2 3 ( 2 :) “ “
.
_
_ `
. ` 、 _ _ 、 一 12 1养基 ,表明今后进行暗紫贝母扩大生产培养 3 王奚楷 主 编 . 天 然 药物化 学 , 北京 : 人 民卫生出 版社 ,
中 ,不大适宜进行固定化细胞培养 。 198 8 ; 。 :96
S t u d i e S o n t h e C h a r a e t e r i s t iC S o f G r o w t h a n d t h e C o n t e n t
o f A lk a l o i d s i n B u l b C u l t u r e o f F r 诬t诬l la r 诬a u n 诬b r a e t e a t a
G a o S h a n l i n
,
Z h u D a n n i
,
C a i Z h a o h u i
,
X u D e r a n
烧那尹 t仍即 t o f G e n e t ics a dn 价 e e d i n g
T h e er l a ti o n s a m o n g e u l t u r a l d a y s
,
g r o w t h r a te a n d t h e e o n t e n t o f a l k a l o i d s w e r e s t u d i e d i n t h e P r o
-
c e s s
of
o r g a n e u l t u r e o f t r a d i t io n a l C h i n e s e d r u g 外乙红艺必 r必 u刀咖 a eeat 勿 . T h e r e s u l st i n d i e a t e d t h a t t h e
e u l t u r ed b u lbs g r o w r a P id ly i n t h e ep r i od o f 3 0一 5 0 d a y s a f t e r i n o e u la t i o n . T h e a e e u m u la t io n o f d r y
m a et
r P r od u e t i o n i n e u l t u r e d b u l b n e a r l y r e a e h e s th e h ihg
e s t l e v e l i n 5 0 d a y s
,
w h i e h 15 s u i at b le f o r
h a r v e s t i n g
.
T h e e o n et n t o f e r u d e a lk a lo i d s i n e u l t u r e d b u l b w e r e k e P t r a t h e r h i g h t l e v e l i n a ll e u l t u r e d
P r oc e s a n d we er
a bo u t 1
.
2 2 一 1 . 5 0 t im e s a s h i g h a s th a t i n w il d b u l b . T h e m a i n e h e m i e a早e o m -
op u n ds in t h e b u l b e o u ld be m a in at i n e d o r i n e r e a s e d i n th e P r o e e s o f e u l t u r e
a n e w w a y ot P r od u e e t r a d i t io n a l C h i n e se m e d ie in e
·
K e y w o r ds 外乞t石la r勿 往砚咖 a e et a at ; o r助 n e u l ut r e , A l k a l o id
i t 15 Po s i b l e t o be e o m e
〕