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小冠花(Coronilla varia)根瘤菌生理生化特性和共生效应的研究



全 文 :1。 。 2年第 1期
N o

1
,
l , 9 2
华 南 师 范 大 学 学 报 、 自 然 科 学 版 )
JO U R N A L O F S O U T H C H IN A N O RM A L U N I V E R S I T Y
( N A T U R A L S C I E N C E E D In 0 N )
小冠花仕些丛卫旦 y翌终 )根瘤菌生理生化
特性和共生效应的研究
刘再奇 程双奇
( 生物学系
莫熙穆
摘 要
小冠花根瘤菌 5 4 0 6 、 M X C V z 、 M X C v Z . MW C V 3 , , M X C V 4 等五菌株的生理生化特性研
究表明 : 5 4 0 6 、 M X C V I 、 M X C V Z 在Y E M 培养基中生长较快 ,代时在 5小时以下 ; 而 M X C V 3 ;
M X C V 4 生长较慢 , 代时分别为 8 . 。和 8 . 4小时 . 所有菌株在 Y E M培养基中产酸 , 对单糖 、 双糖 、
多糖等多种碳源的利用行为相似 , 在碳源利用时大多产酸 , 对抗菌素的抗性特征等都与一般快生
型根瘤菌相似 . 菌株对有机氮源利用较好 , 而利用无机氮源生长较差 . 石蕊牛奶反应中均出现血
清环 、 产酸或产碱 , 菌株在 3 4 ’ C以上高温均不生长 , 生长 p H范围为 6 . 。一 8 . 5 , 菌株的耐盐能力
不超过 o . l m ol / L N a C I . 小冠花一一根瘤菌共生效应表明 , 菌株M X C V Z 的接种效果最显著 ,
有作为优良菌株用于生产菌剂的前景 。
突健词 : 小冠花根瘤菌 . 生理生化特性 , 快生型 , 共生效应
中圈法分类号 : Q o 3 9 . z l 4
O 前言
小冠花 ( C or 。川 “ a 厂ar 沁 ) 是一种耐寒 、 耐旱的多年生温带豆科固氮草木植物 , 根 系
发达 , 植株营养丰富 , 兼作水土保持与饲料之用 . 在 美国宾州地区 、 东欧 、 西欧 、 阿拉伯半
岛的部分国家和地区广泛用于控制水土流失 , 在我国黄河流域的水土流失区 、 华北的风沙地
带近年 引种固土固沙已成功 , 在广东连县和梅县、的紫色沙页岩风化层土质脊薄地带引种也已
获初步成功 , 固土保水作用显著 . 但小冠花必须拌接专一性根瘤菌才能生长良好 , 发育成群
落 . 澳大利亚学者 D a t e( 1 9 7 6) 曾分离到小冠花根瘤菌 , 发现它们与寄主植物有高度专一性 〔 ”
C or 二 ( 1 9 8 1 ) 研究过小冠花根瘤菌株的分类地位 〔 “ 〕 . 中国农科院土肥所从北京地 区中 性
土壤中分离到一株小冠花根瘤菌株 8 4 0 6用于菌剂生产 , 但有关小冠花根瘤菌生理生化特性的
研究均未见根道 , 作者比较系统地研究了小冠花根瘤菌的生理生化特性及与对应宿主的共生
效应 , 以期为生产实践提供有用的参考依据 .
收 . 日期 一 l仑9 1一 0。 5一 2 1 .
1 材料与方法
小冠花根摘菌的分离与纯化
从广东连县采集生长较好 的小冠花植株 , 选取健壮根瘤 , 用常规方法分离 、纯化 、 鉴定 ,
证实所得到的菌株为小冠花根瘤菌 , 编号为 M X C V
小冠花菌株 8 4 0 6由中国农科院土肥所提供 .
M X C V Z

M X C V 3

M X CV 4
,
菌株的生长特征和生理生化反应 _
菌株生长速度 、 菌落形态特征观察 、 省嫩二似舀袖的掀劫碳源利 用 、 B T “ 反应 、
氮源利用 、 耐盐能力 、 生长温度 、 生 ·片必范围 、石蕊牛奶反应一 6 〕 的方法进行 , 并以国际上广泛研究过的快生大豆根瘤菌
根瘤菌 P R C l l3 一 2 作为参考菌株 .
、 抗菌素抗性谱等按文献 〔 3
U S D A一 191 一 4 和慢生大豆
1

3 回接 ( 即共生效应 ) 试验
回接分为试管培养和沙基培养 . 试管培养采用 3 x Z o c m 的大试管 , 在无杂菌污染条 件
下观察 结瘤情况 ; 沙基培养 90 天后的植株 , 测定其固氮酶活性 、 根瘤鲜重 、 植株干重 、 含氮
量 , 并计算固氮效率 ( 固氮效率 二 接种株全氮量 十未接种株全抓量怂 1 0 ; 全氮量 二 含 抓 量
X 植株干重 ) 。
2 结果
1
. 菌袜在 Y E M培养基上的生长特征综合于表 1 .
2
。 碳源利用和B T B反应
五株小冠花根瘤菌都能利用包括单糖 、 双糖 、 多糖在内的 13 种碳源 , 即阿拉伯糖 、 D一
木糖 、 D一萄葡糖 、 L一鼠李糖 、 D一半乳糖 、 D一甘露糖 、 果糖 、 蔗糖 、 麦 牙 糖 、 乳 糖 、
海藻糖以及甘露醇 和肌醇 , 且 B T B反应均产酸 , 8 40 6 和 M X C V I 还能利用葡 萄 搪 酸 钠 ,
M X C V Z 能利用菊糖 .
表 1 各菌株在Y E M培养基上的生长特征
代 时 酸 碱 菌落直径 单菌落出现 菌落形奋特征
( h )
3

6 3
变化
产破 4。 0 ( a )
时间 ( 天 )
2
M X C V I
M X CV Z
3

7 2
4 。 4 3
产酸
产酸
4 。 0 ( a )
2 。 0 ( a )
M X C V S 产徽 1 。 5 ( b )
M X C V 4 8
.
4 1
U S D A 1 9 1一 4 3 。 9 7
产酸
产酸
1

5 ( b )
2

5 ( a )
P R C l l 3一 2 产孩 < 1。 0 ( b )
园形 , 无色半进明 ,
徽突 多枯液
同上
园形 、 乳 白色 , 徽突
少枯液
园形 , 无色半透明 ,
傲突 多枯滚
同上
园形 、 无色半通明 ,
徽突多枯掖
园形 , 乳自色 , 少枯液
注 :a :第四天测量结果 , b : 第六夭测量结果
3
. 氨源利用
所有菌株利用蛋白陈 、 酵母汁 、 、 谷氨酸等有机氮源生长 反 应 较 好 , 而 用 无 机 氮 源
( N H户 : 5 0 ; 、 Na N 0 3 、 尿素作为唯一氮源时 , 其生长反应较差 .
4
. 耐盐能力 、 生长 {温度 、 生长 p H范围及石蕊牛奶反应 , 其结果综合于表 2 .
表 2 小冠花根瘤菌的培养行为

~ ~
-一 目卜目巨~ 一一一 一 ` ~ 尸 二 .`` `~~ 月 .目 . ` . 目 .` ~ .一叫 . . . . . ` . . ~目目 . . `` `` . , 曰哈一- 一 ` ~ , 曰匕 - ` 一 -一 _ 一 ~ ~ _ _ 一一 _ 立 ~ ~ 一 ` ~8 4 0 6 M X C V I M X C V Z M X C V 4
, 甲 . ` `一一 ` ` 月 ~ 一` `一 . . ` ` ` ` . 曰山`石 ` . ` 以 . ` “ 一` ` `一 一 J . ` . 卜 `` 目. ` 闷 . ~户~ 响 ~ 一山` ` 于 ` . ` . . 玉 `. . ` ` ~ ~ ~ ` `` ~` . . ` . ` , ` ~ ~ 一~ 声 ~ ~ 户 . 一 ` ~ _耐盐 ( N a C I )
能力 ( m o l / L )
0

1 O

0

2 0 。 1
生长很度 ( “ e ) 4 一 3 4 4 一 34 4 一 3 4 1 0一 3 4
生长 p壬】范围
石蕊牛奶反应
6

0一 8。 5
产酸
有血清环
6 。 0一 8。 5
产碱
有血清环
6

0一 9 。 0
产碱
有血清环
6

0一 8 。 5
产碱
有血清环
6

0一 8 。 5
产碱
有血清环
5
. 各菌株的抗菌素抗性谱表示如表 3 .
表 3 各菌株对几种抗菌宋的抗性
8 4 0 G M X C V 1 M X C X Z M X C V 3 M X C V 4 P R C l l 3一 2
四环 ( 卜g /m l )

2

5
1 0
十 干
十 +
十 十
十 干
5102
、少
m
矛了
g拼r、
卞那每素
+ 十

霉 ( 林g / m l )

飞5 十 +
+ 十
盛Uù1甘,二白
一 一 一 一 ~ 十
叼曰. . . . . . . . . , . . . . , . . . . . . 目 . 嘴 . . . . . . . . . . , . . 旧 . . 目 . . . . . ` . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . 告 . . 门. . r . . . . . . 曰. . . . . . . . .- 一 .一伪 、 “一. .一~ .一 四” . . . “ . . 内口 . . 一 叭 月 ,注 : 干 + 表示生长良好 , 十 表示生长较差 , 一 表示不生长 .
6
. 各菌株与对 应宿主的共生效应综合于表 4 .
表 4 小冠花一根摘菌的共生效应
菌株 现瘤时间
( 天 )
结瘤数
( 个 /株 ) 植株
千 重
( g /株 ) 含氮量( % )
总氮 固笼效率 固 锹 酶
( m g /株 ) ( % ) C Z H一 n m o l / g鲜瘤 · h
肠4 0 6 2 0
M X C V 1 2 0
M X C V 2 1 7
M X C V 5 1 1
M X C V 盛 1 7
C K 一
0
。 3 0
0

3 5
0

4 7
0

2 9
0

3 3
O

0习
3。 5 4 1
3

0 6 8
2

9 6 6
3

? 4 5
3

2 6 3
1

1 5 2
1 0

6 2
1 0

8 4
1 3

94
1 0

8 6
1 0

7 7
0

9 2
1 1 5 4
1 1 7 8
1 5 1 5
1 18 0
1 1 7 1
1 0 0
4 5 7 5

4
4 4 2 2

2
5 2 5 0一 7
5 0 4 5

3
4 9 2 2

7
活 性
C Z H ` n m o l /
一 株 . h
3 7 8

2
3 5 2

7
5 19
. 3
4 7 7

7
40 9

1
28肠3715
] 7
广
3讨论
菌株在 Y E M培养基上的菌落形态特征 、 菌株生长速度 (代时 、 酸碱变化 、 碳源利用 、
对 抗菌素的抗性谱等 , 是划分根瘤菌为味生擎声慢鲤菌的童要参考标准; 菌落在 Y耳M 培养基上 2 一 4 夭 内长成直径 2 m m 以上的 , 代时为 2 一 4 小时 , 在 Y E M培养基中产酸 , 能利
用包括单糖 、 双糖 、 多糖在内的多种破源基质 , 对抚菌素抗性水平较低 ,且都不 抗四环素等都
是快生型根瘤菌的一般特征 ; 在 Y E M培养基中培养 7 天以上菌落直径不超过 1 m m , 代时为
6 小时以上 , 只利用甘露醇 、 阿拉伯糖 、 木糖 、 半乳糖 , 而不利用蔗搪 、 乳糖 、 海藻糖 , 对
抗菌素的抗性水平较高 , 对四环素有一定抗性等 , 则是慢生型根瘤菌的特征〔 。 , , 一`红 . 从
以上结果可以看出 , 菌株 M X C v l 、 M X C V Z 、 8 5 0 6 符合典型快生型根瘤菌的 特 征 , 而
M x c v 3

M x C v 4 的代时接近慢生型菌 的特征 , 在菌落形态特征上介平 快 、 `漫 生 型 两
者 之间 , 但其主要生理指标如产酸 、 碳源利用谱 、 抗菌素抗性谱等则与快生型根瘤菌基本一
致 . 因此 , M X C V 3 、 M X C v 4 是一类特殊的 、 生长较慢的 快 生型菌作者认为与小冠花结
瘤 的根瘤菌属于快生型根瘤菌 。
所有菌株耐敖 ( N a CI ) 能力不强 , 相对不耐高温 , 这与它们长期适应温带地区气 候 条
件有关 ; 菌株在偏 碱性环境下比在偏酸性环境下生长较好 , 可能是菌株利用碳源 基质时产酸
所致 . 我们发现各菌株在对 链霉素的自然抗性水平上表现出一定的差异 , 可 以利 用作为菌株
鉴别的手段之一 。
一般根瘤菌在石蕊牛奶反应中产碱 , 但这几株小冠花根瘤菌分别表现出产酸或产碱的反
应类型 , 这与 T ir in k ( 1 9 8 0 ) 〔 1 〕 报道的热带豆科植物根瘤菌及徐玫玲等 ( 1 9料 ) 〔 4 〕 报道
的多种快生大豆根瘤菌在石蕊午奶试验中的行为很一致 。
与对应宿主共生的效应表明 , 菌株 M X C V Z 的接种 效果最显著 , 这与固氮酶活性 、 植
株干重 、 全氮量 、 固氮效率的测量结果一致 , 它比中国农科院土肥所选育的生产菌株8 4 0 6的
固氮效果更好 , 可作为 优良接种生产菌株结合应用逐步扩大试验 。
致谢 : 本研究实验工作得到陈平 、 程惠青同志致谢 ,
参考文献
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M X C V 4
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-
g r o w e r s

T h e s e s t r a i n s e a n u t i l i z e a v a r i e t y o f e a r b o n s o u r e e , a e e o m p a n i斑 b y
a e i d
一 p r o d u e t i o n
,
i n e l u d i n g m o n o s a e e h a r id e s
,
d i s a e e h a r id e s a n d p o ly s a e e h a r i d e s

T h e i r r e s i s t a n e e o f a n t i b i o t i e s i n e l u d i n g k a n a m y e l a
, t e t r a e y e l i n a n d
s t r e p t o m y e i n a c e o r d s w i t h f a s t
一 g r o w i n g s t a n d a r d

I n l i t m u s m i l k r e a e t i o n
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s h o w d i f f e r e n e e i n a e id
一 o r a l k a l i
一 p r o d u e t i o n
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N o s t r a i n e a n t o l e r a t e h i g h
t e m p e r a t u r e a n d t h e y e a n n o t g r o w i n t h e p r e s e n e e o f 0
.
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M X C V Z

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