全 文 ：西北林学院学报 2006, 21( 5): 120～ 124
Journal of No r thw est Fo r estry Univ e rsity
马占相思根瘤菌生物学特性的研究
⒇
韦原莲 ,　黄宝灵 ,　吕成群 ,　张慧 ,　樊利勤 ,　李清香
(广西大学林学院 , 广西南宁 530005)
摘　要: 为了探讨马占相思根瘤菌的生物学特性 ,从广西高峰林场马占相思林分采集分离到 9株根
瘤菌 ,并对其生理生化特性、抗逆性和固N酶活性进行研究。结果表明 ,大部分菌株能较好利用供试
糖源 ,所有供试菌株在 3- 酮基乳糖反应、牛肉膏蛋白胨、明胶水解、淀粉水解试验中呈阴性 ;在 B.
T. B反应、无机 N源利用、柠檬酸盐利用呈阳性 ,硝酸盐还原试验大多呈阳性 ;石蕊牛奶试验除
MZ02、 MZ04产酸外 ,其余菌株产碱。 所有供试菌株在温度 30℃时生长最好 ,耐盐、耐酸碱范围较
宽 , M Z04在含盐浓度为 2. 0%环境还能生长良好 , M Z04、 MZ10在 pH9. 0环境仍能生长较好 ;所有
菌株对 250μg /mL庆大霉素 ( Sm3)均无抗性 ,不同菌株对其余供试抗菌素表现出不同的抗性 ,
M Z02抗性最差 ,对所供试的抗生素均无抗性 ; M Z04、 MZ08、 M Z09抗性相对较强。所有供试菌株
都具有固 N酶活性 ,其中 MZ02、 MZ06、M Z08的固 N酶活性最高。根据广西马占相思栽培区的生态
条件 ,筛选出 MZ02和 MZ06为优良菌株。
关键词: 马占相思 ;根瘤菌 ;生理生化特性 ;抗逆性 ;固 N酶活性
中图分类号: S718. 81　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1001-7461( 2006) 05-0120-05
Biological Characteristics of Rhizobia in Acacia mangium
WEI Yuan-lian, HUANG Bao-l ing, LU Cheng-qun, ZHANG Hui, FAN Li-qin, LI Qing-xiang
(College of Forest ry Guang xi Universi ty , Nannin g ,Guangx i 530005,Ch ina )
Abstract: To study the biological characteristics of Rhizobia in Acacia mangium , 9 rhizobia st rains w ere
isolated f rom A. mangium in Gaofeng fo rest fa rm of Guangxi , and the physio logical and bio chemical cha r-
acteristics, resistances and nit rog enase activ ities w ere detected, respectiv ely. The resul ts show ed tha t sug-
ar sources could be w ell used by most st rains. In the experiments treated wi th 3-keto-lacto se, beef-pro-
tein, gelatin hydro lysis and starch hydrolysis, all of testied st rains w ere nega tiv e, In B. T. B reaction, in-
o rg anic ni t rogen sources utilization and ci t rate utili zation, the results w ere po si tiv e. Nit rate reduction ex-
periment presented po si tiv e largely. In litmus milk experiment , al l of st rains produced alkai expect fo r
M Z02 and M Z04 produced acid reactions. At 30℃ , all o f st rains g rew best , and had a wide range in sal t,
acid and basic resistance. M Z04 w as capable of go od g row th at sal t densi ty of 2. 0% , M Z04 and M Z10
could stil l g rew bet ter a t pH 9. 0. All of the st rains w ere not resistant to 250μg /mL gentamicin( Sm3) ,
and to other antibiotics, di fferent resistances w ere presented by dif ferent st rains, M Z02 had wo rst resis-
tance to all antibio tics, w hi le M Z04, M Z08, M Z09 had st rong resistance. All strains had ni t ro genase activ-
ity, o f w hich M Z02, M Z06 and M Z08 had higher ni trog enase activi ty. M Z02 and M Z06 w ere selected as
fine st rains acco rding to the eco logical conditions o f cultural area of A . mangium in Guangxi.
Key words: Acacia mangium; Rhizobia; physiolo gical and biochemical characteristics; resistance; ni trog e-
nase activi ties
　　马占相思 ( Acacia mangium )为含羞草科 ( Mi- mosoideac)的强阳性树种 [1 ] ,是速生的优良多用途
⒇ 收稿日期: 2006-02-24　修回日期: 2006-03-16
基金项目:广西自然科学基金项目 ( 0448005)
作者简介:韦原莲 ( 1965-) ,女 ,广西上林人 ,实验师 ,主要从事林业方面的研究。
树种 ,其根部具有根瘤 ,具有共生固 N的功能 [ 2] ,为
了使根瘤菌更好地促进马占相思林木的生长 ,国内
外对其根瘤菌进行了大量的研究。马占相思在广西
引种的时间不长 ,但已充分表现出其速生、丰产、耐
干旱、耐瘠薄等特性。广西桂南地区的自然条件适合
发展马占相思 ,其中广西高峰林场把它作为短周期
工业用材林大面积种植。但由于引种时间短 ,对于马
占相思与广西本土共生的根瘤菌的研究极少 ,为此 ,
作者从广西高峰林场采集不同单株的马占相思根
瘤 ,经分离纯化获得 9株根瘤菌菌株 ,并进行生理生
化特性、抗逆性和固N酶活性测定 ,从中筛选出马占
相思根瘤菌优良菌株 ,为今后根瘤菌在相思树种造
林上的应用推广、进一步利用优良菌株资源和指导
引种栽培提供科学依据。
1　材料与方法
1. 1　根瘤的来源、分离和纯化
从广西高峰林场界牌分场界牌林站和芭蕉弄林
站 3年生马占相思林分分别采集到 11份根瘤样品 ,
洗净后按 J. M.芬森特方法 [3 ]进行根瘤表面消毒 ,无
菌水冲洗后 ,用灭菌玻棒将根瘤压碎 ,取汁液接至
YM A培养基 [4 ]上进行划线分离 , 28～ 30℃恒温培
养至菌落出现 ,挑取独立、典型的菌落进行纯化 ,获
得 MZ02、 MZ03、 MZ04、 MZ05、 MZ06、 MZ08、
MZ09、 MZ10、 MZ11等 9株根瘤菌菌株。
1. 2　生理生化试验
参照“一般细菌常用鉴定方法 [5 ]”。
1. 3　抗逆性试验
1. 3. 1　温度试验　在 YM A培养基上划线接种 ,分
别置于 9℃、 17℃、 20℃、 30℃、 39℃恒温水浴中培养 6
～ 8 d,观察菌落生长情况。
1. 3. 2　耐盐试验　将不含盐的 YM A培养基制成
含有 0. 01%、 0. 2% 、 0. 5%、 1. 0% 、 1. 5%、 2. 0% Na-
Cl培养基 ,以不含盐的培养基作对照 , 28℃培养 7 d。
1. 3. 3　酸碱度试验　用 1 mol /L NaOH或 1 mol /L
HCl将 YM A培养液的 pH值调至 4. 0、 4. 5、 5. 0、 5.
5、 6. 0、 6. 5、 7. 0、 7. 5、 8. 0、 8. 5、 9. 0等 11个梯度 (用
PHS— 25型 pH计测定 ) ,接种后于 28～ 30℃培养 ,
以不接种为对照 , 1周后观察培养液的混浊
度 [6, 7 ]。　　　　　
1. 3. 4　抗菌素试验　在经过灭菌并冷却至 50℃左
右的 YMA培养基中分别加入已配制好的各种浓度
抗菌素溶液 ,混合均匀后制成平板培养基。培养基中
的各种抗菌素浓度 (μg /mL)保持为: 庆大霉素
( Gm ) 10、利福平 ( Ri f ) 50、氯霉素 ( Cm ) 100、壮观霉
素 ( Spc) 50、卡那霉素 ( Km ) 25、链霉素 ( Sm) 25、 50、
250、氨苄青霉素 ( Amp) 50、 100。将菌株点接在配制
好的平板培养基上 ,以不加抗菌素的 YMA培养基
作为对照 , 28～ 30℃培养 5～ 7 d后观察生长情
况 [8 ]。　　　　　　
1. 4　回接试验及固 N酶活性测定
供试马占相思种子由高峰林场提供。回接试验
用大试管 Jensen培养基 [4 ]密封培养法 ,将纯化后培
养 5 d的 MZ02、 MZ03、 MZ04、 MZ05、 MZ06、 MZ08、
MZ09、 MZ10、M Z11根瘤菌菌株在无菌工作台上制
成菌液 ,摇匀。 将已消毒、催芽好的马占相思种子在
无菌条件下点种到大试管培养基上 ,用移液管吸取 2
ml的菌液注射接种到种子周围 ,灭菌纸密封试管
口 ,室温培养 ,每个菌种设 20个重复 ,以不接种为对
照 ,定期观测结瘤情况 , 80 d后测结瘤量和固 N酶
活性 [9 ]。
2　结果与分析
2. 1　菌落特征
从马占相思根瘤分离到的根瘤菌株 MZ02、
MZ03、 MZ04、 M Z05、 MZ06、 MZ08、 MZ09、 MZ10、
MZ11经纯化后 ,在 YM A平板上生长 3～ 5 d,菌落
圆形 ,乳白色 ,边缘整齐 ,表面凸起 ,具光泽。
2. 2　生理生化特性
2. 2. 1　糖源的利用　根瘤菌一般均能较好地利用
单糖和双糖 [10 ] ,但部分根瘤菌利用双糖类化合物的
速度不如单糖类化合物快。从表 1试验结果来看 ,供
试的所有菌株均能在木糖和半乳糖上正常生长 ,
M Z02、 MZ03、M Z04菌株对所有供试的糖源均能很
好利用 ,而 M Z08、 M Z09、 M Z10、 MZ11菌株对麦芽
糖、蔗糖、乳糖的利用则显得较差。 这说明了马占相
思根瘤菌不同菌株对不同糖源的利用存在一定的差
异。 　　　　　
2. 2. 2　部分生理生化反应　表 2试验结果表明 ,供
试的马占相思根瘤菌株不能进行 3-酮基乳糖的反
应 ,在牛肉膏蛋白胨培养基上生长很差 , B. T. B试
验能使培养基变黄色 ,能利用铵态 N和硝态 N作为
N源 ,不能液化明胶 ,不利用淀粉 ,这与一般根瘤菌
的特性相同 ;硝酸盐还原试验除菌株 M Z03、 MZ05、
MZ06呈阴性外 ,其余菌株呈阳性。 石蕊牛奶反应
中 ,除菌株 MZ02、 MZ04不还原、产酸外 ,其余菌株
均能还原、产碱。据前人的有关资料报道 ,根瘤菌不
能利用柠檬酸盐 [ 11, 13] ,而近年来国内外大多资料都
报道说有些根瘤菌也可以利用柠檬酸盐 ,黄维南等
人所做的异叶银合欢根瘤菌的分离试验中也证明了
121第 5期 韦原莲等　马占相思根瘤菌生物学特性的研究
异叶银合欢也能利用柠檬酸盐 [14 ] ,表 2的试验结果 证明马占相思根瘤菌能利用柠檬酸盐。
表 1　马占相思根瘤菌对双糖和单糖的利用
Table 1　 The u tili zation of dis accharides and monosaccharides by dif ferents s trains of Rhizobia
菌株 CK 木糖 半乳糖 葡萄糖 果糖 甘露醇 麦芽糖 蔗糖 乳糖
M Z02 - + + + + + + + + + + + + + +
M Z03 - + + + + + + + + +
M Z04 - + + + + + + + + + + + +
M Z05 - + + + + + + + + + + + + -
M Z06 - + + + + + + + + + + + -
M Z08 - + + + + - + + - + - + -
M Z09 - + + + - + + - + - + - + -
M Z10 - + + + + + + - + - + -
M Z11 - + + + + + + + - + - + -
　　“+ + ”生长较好 ,“+ ”生长一般 ,“+ - ”生长不好 ,“ - ”不生长
表 2　根瘤菌的部分生理生化特性
Table 2　 Part s of the ph ysiological and bioch emical ch aracteri s tics of Rh izobia s t rains
菌株 3-酮基乳糖反应
牛肉膏蛋白
胨培养基
B. T. B
反应
无机 N
源利用
明胶
水解
淀粉
水解
柠檬酸
盐利用
硝酸盐还
原反应
石蕊牛
奶反应
M Z02 - - + + - - + + 胨化、不还原、产酸
M Z03 - - + + - - + - 胨化、还原、产碱
M Z04 - - + + - - + + 胨化、不还原、产酸
M Z05 - - + + - - + - 胨化、还原、产碱
M Z06 - - + + - - + - 胨化、还原、产碱
M Z08 - - + + - - + + 胨化、还原、产碱
M Z09 - - + + - - + + 胨化、还原、产碱
M Z10 - - + + - - + + 胨化、还原、产碱
M Z11 - - + + - - + + 胨化、还原、产碱
　　“+ ”阳性 ,“- ”阴性
2. 3　抗逆性试验
2. 3. 1　温度对马占相思根瘤生长的影响　温度是
影响根瘤菌生长的主要因素之一。 从表 3的温度试
验表明 ,供试的所有菌株在温度为 17℃～ 30℃均能
生长 ,大部分菌株最适宜生长的温度为 20℃～ 30℃ ,
而不同根瘤菌株对温度的要求稍有差异 , M Z10耐
高温性较好 ,在 39℃还能正常生长 ; M Z02耐高温、
低温性很差 ,只有在 30℃能生长良好。这说明不同的
马占相思根瘤菌对温度的适应范围不同 ,大多数都
不能耐高温和低温。
2. 3. 2　马占相思根瘤的耐盐性试验　土壤盐碱化
是我国目前普遍存在的问题 ,因此筛选耐盐性的根
瘤菌树种对盐碱地土壤的改良利用有重要的意义。
表 4试验结果表明 ,除菌株 MZ11外 ,其余菌株均能
在含盐 1. 0%的培养基中生长 ,菌株 MZ02和 M Z04
的耐盐性最好 ,在含盐 2. 0%的浓度下仍能生长或生
长良好 ;菌株 MZ05和 MZ06的耐盐性也较好 ,在含
盐 1. 5%的浓度下能生长较好或生长。由此说明了马
占相思根瘤菌具有较好的耐盐性 ,但不同菌株耐盐
性有一定的差异。
表 3　不同温度对马占相思根瘤菌生长的影响
Table 3　 Th e effect s of dif f erent temperature on th e grow ths of Rhizobia st rains
温度
/℃
菌株
M Z02 MZ03 M Z04 M Z05 M Z06 MZ08 M Z09 M Z10 M Z11
9 - + - - + - + - - - - -
17 + - + + + + + + + + - + - + + + -
20 + - + + + + + + + + + + + + + + +
30 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
39 - + - - + - + - - - + -
　　“+ + + ”生长良好 , + + 生长较好 , + 生长一般 ,“+ - ”生长差 ,“- 不生长
122 西北林学院学报 21卷　
表 4　不同浓度的 NaCl对根瘤菌生长的影响
Table 4　 The ef fect s of NaCl of dif f erent concent ration on th e grow th s of Rhizobia s t rains
NaCl浓度
/%
菌株
M Z02 MZ03 M Z04 M Z05 M Z06 MZ08 M Z09 M Z10 M Z11
CK + + + - + + + + + + + + + + + + + + + +
0. 01 + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + +
0. 2 + + + + + + + + + + + + + + + +
0. 5 + + + + + + + + + + + + + + + + + +
1. 0 + + + + + + + + + + + + + + + -
1. 5 + + - + + + + + + - - - -
2. 0 + + - + + + + - + - - - - -
　　“+ + + ”生长良好 , + + 生长较好 , + 生长一般 ,“+ - ”生长差 , “- 不生长
2. 3. 3　酸碱度对马占相思根瘤菌生长的影响　一
般根瘤菌需要的 pH环境为近中性 ,过酸过碱的环
境条件对根瘤菌的生长和结瘤均有明显的抑制作
用 [15, 16 ]。表 5试验结果表明 ,供试的 9株菌株在 pH4.
0以下都不能生长 ,大多数菌株在 pH6. 0～ 7. 0生长
较好 ,但不同根瘤菌菌株耐酸碱性的差异较大 ,如
MZ04和 M Z10耐酸碱范围较宽 ,在 pH5. 0～ 9. 0能
生长或生长较好 ; M Z03、 M Z05、 M Z06耐酸碱范围
较窄 , M Z03、 MZ05只有在 pH6. 0～ 6. 5时生长较
好 , M Z06只有在 pH5. 5时生长较好。
表 5　 pH值对马占相思根瘤菌生长的影响
Table 5　 The effect s of dif f erent PH v alue on th e grow th s of dif f erent Rhizobia st rains
菌株 pH值
4. 0 4. 5 5. 0 5. 5 6. 0 6. 5 7. 0 7. 5 8. 0 8. 5 9. 0
M Z02 - - + - + - + + + + + + + + +
M Z03 - - - + - + + + + + - + - + - + - -
M Z04 - + - + + + + + + + + + + + + + +
M Z05 - - - + - + + + + + - + - + - + - -
M Z06 - - - + + + - + - + - + - + - + - -
M Z08 - + - + - + + + + + + + - + - + -
M Z09 - + - + - + + + + + + + + +
M Z10 - + - + + + + + + + + + + + + + +
M Z11 - - + - + + + + + + + + + +
　　“+ + ”生长较好 ,“+ ”生长一般 ,“+ -”生长差 ,“ -”不生长
2. 3. 4　马占相思根瘤菌抗菌素的抗性　根瘤菌的
天然抗菌素敏感性是一项重要的生理生化特性 ,而
且可作为分群的一项指标。根瘤菌对抗菌素较敏感 ,
一般被抗菌素抑制 [17 ]。从表 6的抗菌素试验结果表
明 ,马占相思根瘤菌对大多数的抗菌素是敏感的 ,不
同菌株对抗菌素的抗性有差异 ,如所有菌株对 Sm3
都无抗性 , M Z02对抗菌素抗性最差 ,对所有供试的
不同种类不同浓度的抗菌素均无抗性 , M Z04、 MZ08
、M Z09的抗性相对较强。
表 6　根瘤菌对抗菌素的抗性
Table 6　 Resistances to antibiotics of dif f erent s t rain s of Rh izobia
菌株
抗菌素
Gm Rif Cm Spc Km Sm1 Sm 2 Sm 3 Amp1 Amp2
M Z02 - - - - - - - - - -
M Z03 - - - - - + + - + -
M Z04 - - + + - + + - + +
M Z05 - - - - + - - - - -
M Z06 + - - - + - - - - -
M Z08 + + + - - - - - + +
M Z09 - + + + - - - - + +
M Z10 - + + - - - - - - +
M Z11 - + + - - - - - - -
　　注: Amp1( 50μg /mL) , Amp2( 100μg /mL) , Sm 1( 25μg /m L) , Sm2( 50μg /m L) , Sm3( 250μg /mL) ,其余浓度见材料与方法。“+ ”表示有抗
性 , “- ”表示无抗性
123第 5期 韦原莲等　马占相思根瘤菌生物学特性的研究
2. 4　回接试验
马占相思幼苗接种根瘤菌后 22 d开始出现根
瘤 ,白色 ,随后渐渐变成淡红色 , 80 d M Z02和 MZ04
的结瘤率达 100% ,未接种的对照不结瘤。从表 7的
结果显示 ,所有供试根瘤菌都具有固N酶活性 ,其中
MZ02、 MZ06、 MZ08固 N酶活性最高 , M Z04、M Z09
固 N酶活性最低。
表 7　接种根瘤菌结瘤率和根瘤的固 N酶活性
Table 7　 Th e nodulation rates of inoculat ion root nodules and ni t rogenase activi ties of root nodules
菌株 MZ02 M Z03 M Z04 M Z05 MZ06 M Z08 M Z09 M Z10 M Z11
结瘤 /个· 株 - 1 4. 2 3. 3 2. 2 2. 6 4. 3 3. 5 3. 1 2. 7 2. 1
瘤重 /mg· 株 - 1 11. 4 12. 2 3. 8 2. 6 4. 3 5. 5 7. 2 2. 5 3. 2
瘤重 /mg· 个 - 1 2. 7 3. 7 1. 7 1. 2 1. 0 1. 5 2. 3 0. 9 1. 5
结瘤率 /% 100. 0 55. 56 100. 0 77. 78 58. 82 50. 0 58. 10 75. 00 81. 10
固 N酶活性
/nm ol· g- 1· h- 1 4210 1350 373 1920 5400 5820 215 1635 1135
3　结论与讨论
供试的 9个菌株均具有典型的根瘤菌的菌落特
征 ,回接试验不仅结瘤 ,而且均具有固 N酶活性 ,证
明 9个菌株均为根瘤菌 ,并且说明 ,外来的马占相思
树种与广西土著根瘤菌具有良好的共生关系。
从马占相思不同单株上分离获得的 9个菌株都
具有根瘤菌的一般生理生化特性 ,但在菌株间却表
现出一定的差异性 ,如硝酸还原试验大多数菌株呈
阳性 ,少数呈阴性 ;石蕊牛奶试验除 M Z02和 MZ04
产酸外 ,其余产碱 ; M Z02、 MZ06和 MZ08所结根瘤
的固 N酶活性明显高于其他菌株。在抗逆性的差异
上也很明显 ,例如 MZ04能耐 2. 0%的盐浓度 ,而
MZ11在 1. 0%的盐浓度不能生长 ; M Z04和 MZ10
在 pH9. 0环境仍能生长较好 ,不同菌株对供试的抗
菌素表现出不同的抗性 ,这些差异为我们从中筛选
优良菌株提供了可能的条件。在本试验中 ,适应马占
相思引种区桂南温暖气候及酸性土壤条件的优良菌
株为 MZ02和 MZ06。
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124 西北林学院学报 21卷