全 文 ：收稿日期: 2003- 04- 07
基金项目: 广东省自然科学基金资助项目( 4203065) ;中山大学青年
教师启动基金资助项目( 05040- 1130063) ;香港区域合作
基金资助项目( 05040 - 4108062)
作者简介: 洪华嫦( 1979- ) ,女,浙江浦江人,硕士研究生.
五氯酚对斜生栅藻的毒性效应研究
洪华嫦1, 周海云2* , 蓝崇钰1
( 1.中山大学生命科学院 生物防治重点实验室,广东 广州 510275; 21中山大学 测试中心,广东广州 510275)
摘要: 以斜生栅藻细胞的生长状况、色素(叶绿素 a、叶绿素 b、类胡萝卜素) 及蛋白质含量的变化作为指标,研究了不同质量浓度的五氯酚( 0, 0102,
0105, 0110, 0150, 1100 mgPL)对斜生栅藻( Scenedesmus obliquus)的毒性效应。24, 48, 72, 96和 120 h五氯酚对斜生栅藻的 EC50分别为 01883, 01283, 01225,
01168和 01192 mgPL。斜生栅藻生长受抑制程度随五氯酚质量浓度增加而加强,当五氯酚的质量浓度超过 0150 mgPL 时,斜生栅藻的生长几乎完全受
到抑制。染毒 96 h的斜生栅藻色素(叶绿素 a、叶绿素 b、类胡萝卜素)含量以及蛋白质含量随着五氯酚质量浓度的增加呈下降趋势,色素比例失调,
色素对五氯酚的敏感程度为:类胡萝卜素 > 叶绿素 a > 叶绿素 b;可溶性蛋白质含量与色素含量的减少呈明显线性相关( r= 01793, n= 6)。
关键词: 五氯酚; 斜生栅藻; 生长抑制; 色素; 可溶性蛋白质
中图分类号: X17115 文献标识码: A 文章编号: 1001 - 6929( 2003)06- 0023 - 03
Toxicity Effects of Pentachlorophenol on the Growth, the Contents of
Pigments and Soluble Protein of S cenedesmus obliquus
HONG Hua-chang
1
, ZHOU Hai-yun
2
, LAN Chong-yu
1
( 11School of Life Science, Sun Yat-sen University ,Guangzhou 510275, China;
21 Instrumental Analysis and Research Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China)
Abstract: Toxicity effects of pentachlorophenol( PCP) under different mass concentrations( 0, 0102, 0105, 0110, 0150, 11 00 mgPL) on the growth, the
contents of pigments and soluble protein of Scenedesmus obliquus decreased with the increase of PCP mass concentration. EC50 value for 24, 48, 72, 96
and 120 h was 01883, 01283, 01225, 01 168 and 01192 mgPL respectively. The growth of algae was almost completely inhibited when PCP mass con-
centration was higher than 0150 mgPL.Meanwhile, the mass concentrations of pigments and soluble protein in 96 h-culture algae solution were also de-
termined. The total levels of pigments, soluble protein and the ratio between chlorophyll a and b declined as PCP mass concentration increased. The
susceptibility of pigments to PCP followed the order of carotenoid > chlorophyll a> chlorophyll b. There was an obvious linear relationship between the
contents of pigments and soluble protein ( r= 01793, n= 6)。
Key words: Pentachlorophenol; Scenedesmus obliquus ; growth inhibition; pigments; soluble protein
长期以来, 五氯酚( PCP)及其钠盐作为木材防腐
剂和杀菌、杀虫剂被广泛生产和应用,诸多文献已经确
证PCP 对水生生物和哺乳动物、细菌、植物细胞有基
因毒性、细胞毒性 [1 -2 ] ,甚至免疫毒性 [3 ]。五氯酚对环
境造成的种种危害已引起人们的高度重视, 对其环境
毒理的研究也日益增多。作为水生生态系统中的初级
生产者,藻类对于维持生态系统的平衡和稳定起着极
其重要的作用。在水生生态毒理研究中, 单细胞绿藻
往往因其周期短,易于分离、培养和可以直接观察细胞
水平上的中毒症状等优点,是较为理想的实验材料,所
以常被用作毒性测定 [ 4]。笔者拟研究五氯酚对极常见
的淡水 单 细 胞 绿 藻 ) ) ) 斜 生 栅 藻 ( Scenedesmus
obliquus)的毒性效应, 以了解五氯酚对藻类群落的危
害,进而认识五氯酚对水生生态系统的潜在危害, 同时
为水质评价提供重要参考。
1 实验部分
111 试剂、仪器及实验材料
五氯酚(化学纯) ,丙酮(分析纯) ,卡马斯亮蓝G -
250,光照培养箱,紫外分光光度计, 显微镜, 血球计数
板,斜生栅藻藻种 (由中国科学院水生生物研究所
提供)。
112 实验条件
实验设置 6个浓度组,它们的五氯酚含量分别为
第 16 卷 第 6期
环 境 科 学 研 究
Research of Environmental Sciences
Vol. 16, No. 6, 2003
DOI：10.13198/j.res.2003.06.25.honghch.007
0(对照组) , 0102, 0105, 0110, 0150, 1100 mgPL, 每组设 3
个平行样, 实验容器为 500 mL 锥形瓶, 培养体积 200
mL,培养基采用 Boldps Medium (即 1 L 培养液中含有
NaNO3 0125 g, MgSO4 01050 1 g, K2HPO4 01100 3 g,
KH2PO4 0115 g, CaCl2 01025 4 g, NaCl 01025 3 g, EDTA
01051 5 g, KOH 01031 2 g, FeSO4 #7H2O 01004 986 g,
H3BO3 01011 43 g, ZnSO4 , 01008 83 g,MoO3 01000 71 g,
Co( NO3 ) 2#6H2O 01000 49 g, MnCl2 01001 44 g, CuSO 4#
5H2O 01001 57 g) ;温度( 23 ? 1) e ,光照强度 3 000 lx,
光照周期 16 hB8 h(昼B夜) ,初始接种光密度(波长为
650 nm) 为 01008, 初始藻细胞浓度约为 1177 @ 105
个PmL,光照培养箱静止培养, 每天震荡 3次, 每次 5
min。
113 生物量测定
通过在显微镜下用血球计数板进行藻细胞计数,
以及在波长650 nm下测定藻液光密度, 建立不同藻细
胞浓度和光密度之间的线性关系, 实验中以测定的光
密度和根据线性方程计算出的藻细胞浓度表示生
物量。
114 叶绿素含量的测定 [5 ]
用 80%的丙酮提取叶绿素, 分别在波长为 663,
646, 470 nm下测定其光密度( D ) ,然后根据如下公式
进行 色素 含 量计 算: 叶绿 素 a, C a = 12121 @
D ( 663 nm) - 2181 @ D (646 nm) ;叶绿素b, Cb= 20113 @
D ( 646 nm) - 5103 @ D ( 663 nm) ; 类胡萝卜素, CX. C=
( 1000 @ D ( 470 nm) - 3127 Ca - 104 Cb )P229。
115 蛋白质含量测定
用卡马斯亮蓝 G - 250 染色法进行蛋白质含量
测定 [5 ]。
116 数据处理
EC50的计算、X 2检验参照文献[6 - 7 ]进行。
2 结果与讨论
211 五氯酚对斜生栅藻生长的影响
21111 斜生栅藻细胞浓度与光密度的线性关系
如图 1所示,不同藻细胞浓度下,通过记数得到的
藻细胞浓度( y)与在波长 650 nm 下测定的光密度( x)
之间的线性回归方程为: y = 296144 x - 015991 ( r =
01998) ,根据该方程计算出的藻细胞浓度和实测浓度
之间的平均相对偏差为 3126%。
21112 五氯酚对斜生栅藻生长的毒性评价
随着五氯酚质量浓度的增加, 斜生栅藻生长逐渐
受到抑制,当五氯酚的质量浓度超过 0150 mgPL 时,斜
生栅藻的生长几乎完全受到抑制; 在 1100 mgPL 时,藻
细胞生长出现负增长效应(图 2)。在低浓度处理组
中,随着时间延长,藻细胞数量增长使得单个细胞对五
氯酚的负荷相对降低, 同时也有可能是部分五氯酚发
生降解,因此藻细胞在24 h后表现出对五氯酚逐渐适
应,生长速度虽不及对照组但还是稳步增长; 高浓度处
理组可能是因为五氯酚质量浓度超过了藻细胞负荷的
极限,以至藻细胞功能无法完全恢复,所以藻细胞处于
零增长或负增长。从显微镜中观察到的藻细胞坏死残
骸数量随五氯酚质量浓度增加而逐渐增多, 即使是完
整的细胞其颜色也是逐渐变淡的。
图 1 斜生栅藻细胞浓度与光密度的关系
Fig. 1 Relationship between cell density of
Scenedesmus obliquus and OD - 650 nm
五氯酚质量浓度P( mg#L- 1) : 1 ) 0; 2 ) 0102;
3 ) 0105; 4 ) 0110; 5 ) 0150; 6) 1100
图 2 五氯酚对斜生栅藻生长的抑制效应
Fig. 2 Growth inhibition of pentachlorophenol on
Scenedesmus obliquus
根据图 2的生长结果, 以对照组的生长百分率
( K )为 100%,求出各处理组的生长百分率( r ) , 查百分
比与概率单位对照表得经验概率单位; 以浓度的对数
为横坐标,以经验概率单位为纵坐标制图,得出相应的
五氯酚浓度对数( x )与概率单位( y )的一元线性回归
方程见表 1,当概率单位为 5时计算出 EC50值。
当自由度为 3时,查表 X201 05为 7182, 则 24, 48, 72,
96和 120 h的 X 2 分别为 01733, 01362, 61386, 31479和
41984,因为 X20105 > X 2 ,所以按照上述 5个线性回归方
程计算出的 24 h EC50 ( 01883 mgPL) , 48 h EC50 ( 01283
24 环 境 科 学 研 究 第 16 卷
mgPL) , 72 h EC50 ( 01225 mgPL) , 96 h EC50 ( 01168 mgPL)
和120 h EC50 ( 01192 mgPL)值符合精度要求。纵观各个
时间段的 EC50值,其中 24 h时最不敏感, 其 EC50最大,
为 01883 mgPL; 96 h 最敏感, 其 EC50最小, 为 01168
mgPL;除了 24 h EC50值以外,其余的 EC50值均在 01168
~ 01283 mgPL范围内。这一结果较一般农药对栅藻的
EC50值都低, 如氯氰菊酯对斜生栅藻的96 h EC50值为
112145 mgPL, 林丹为 215 mgPL( 96 h) , 单甲脒为 615
mgPL( 96 h) ,甲基对硫磷为 15 mgPL( 72 h) [8] ;也比五氯
酚对蛋白核小球藻的 96 h IC50值( 3149 mgPL) [9 ]低, 说
明五氯酚对斜生栅藻有较高的毒性或斜生栅藻对五氯
酚具有较高的敏感性。
表 1 五氯酚质量浓度对数( x)与概率单位( y)的一元线
性回归方程, EC50和 X2 结果
Table 1 Linear relationship between log of pentachlorophenol concen-
trations and the probability unit, and the results of EC50 and of X
2
处理
时间Ph
浓度对数( x)与概率单位
( y )的一元线性回归方程
当概率单位为 5时计算
出的 EC50P(mg#L- 1 ) X
2
24
y= - 0. 6961 x+ 4. 9624
( r = 0. 993)
0. 883 0. 733
48
y= - 0. 9451 x+ 4. 4811
( r = 0. 998)
0. 283 0. 362
72
y= - 1. 2569 x+ 4. 1852
( r = 0. 982)
0. 225 6. 386
96
y= - 1. 7521 x+ 3. 6426
( r = 0. 995)
0. 168 3. 479
120
y= - 1. 6823 x+ 3. 7951
( r = 0. 988)
0. 192 4. 984
注: X2= E ( r - KP ) 2PKP( 1 - P ) ( r 为处理组生长百分率, % ; K 为
对照组的生长百分率 100% ; P 为根据线性方程得出的处理组的生长百
分率)。
212 染毒 96 h时不同质量浓度五氯酚对斜生栅藻各
种色素含量、比例以及可溶性蛋白质含量的影响
从表 2中可看出, 培养 96 h时, 对照组藻液中各
种色素含量为叶绿素 a> 叶绿素 b >> 类胡萝卜素, 而
且叶绿素 aP叶绿素 b的比值约为 11291;处理组中随着
五氯酚质量浓度的增加, 各种色素的绝对含量以及叶
绿素 aP叶绿素 b的比值呈下降趋势(在显微镜下也可
观察到,随着五氯酚质量浓度的增加,藻细胞的颜色逐
渐由翠绿色变成淡黄色甚至接近白色) ,当五氯酚质量
浓度为1 mgPL时,其比值降到 01700; 可溶性蛋白质和
3种色素的总含量虽在五氯酚质量浓度为 0105, 0110
mgPL时略有波动, 但总的也是随着五氯酚质量浓度的
增加呈下降趋势,且蛋白质含量与总色素含量之间呈
明显的线性相关( r= 01793, n = 6)。上述结果说明藻
细胞在五氯酚的作用下, 叶绿体结构受到损害,色素含
量的下降在一定程度上又影响了蛋白质的合成。
表 2 染毒 96 h不同五氯酚质量浓度处理组斜生
栅藻的色素、蛋白质含量
Table 2 Pigments and soluble protein levels of Scenedesmus obliquus
treated by pentachlorophenol for 96 h LgPmL
五氯酚质
量浓度P
(mg#L - 1)
叶绿
素 a
叶绿
素 b
类胡萝
卜素
叶绿素 aP
叶绿素 b
3种色
素之和
蛋白质
含量
0 0. 244 0. 189 0. 051 1. 291 0. 484 2. 19
0. 02 0. 191 0. 169 0. 042 1. 130 0. 402 1. 77
0. 05 0. 115 0. 120 0. 015 0. 958 0. 250 2. 04
0. 10 0. 152 0. 141 0. 033 1. 078 0. 326 1. 97
0. 50 0. 047 0. 050 0. 006 0. 940 0. 103 1. 69
1. 00 0. 014 0. 020 0 0. 700 0. 034 1. 52
斜生栅藻( Scenedesmus obliquus)属于绿藻纲( Chlo-
rophyceae ) , 绿 球 藻 目 ( Chlorococcales ) , 栅 藻 科
( Scenedesmoideace ) , 栅藻属( Scenedesmus ) 的单细胞绿
藻 [9] ,其同化色素体全部和高等植物一样, 由叶绿素
a,叶绿素 b, A和 B- 胡萝卜素及叶黄素组成 [10] , 后 3
种色素总称类胡萝卜素。所有这些色素在光合作用当
中各自起着重要作用,其中少数不同状态的叶绿素 a
分子有将光能转换为电能的作用; 绝大部分叶绿素 a
分子和全部叶绿素 b分子具有收集光能的作用;类胡
萝卜素也有收集光能的作用, 除此之外,还有防护光照
伤害叶绿素的功能 [11 ]。在颜色上, 叶绿素 a 呈蓝绿
色,而叶绿素 b 呈黄绿色, 类胡萝卜素为橙黄色或黄
色,对于正常藻细胞来说, 各种色素应有其合适的含
量,且各种色素的含量之间有一个合适的比例。该实
验中斜生栅藻在五氯酚处理下色素绝对含量的下降、
比例的失调势必会影响光合作用的正常进行,进而影
响藻细胞体内其他有机物质(如各种蛋白质)的合成。
蛋白质是细胞中最重要的结构物质, 蛋白质虽然
不是细胞光合作用的直接产物, 但其合成的原料最终
还是靠光合作用来提供的,所以叶绿素含量的降低会
影响蛋白质的合成; 蛋白质在叶绿体中占其干重的
30%~ 45%,它在叶绿体中最重要的功能是作为代谢
过程中的催化剂,如酶本身就是由蛋白质组成的, 又如
电子传递作用的细胞色素、质体蓝素等都是与蛋白质
结合起来的 [11 ] , 因此蛋白质合成量的下降, 又会影响
叶绿素生理功能的正常发挥,一定程度上又影响了藻
细胞的生长与代谢。
以对照组藻液中的色素含量为 1, 染毒 96 h各五
氯酚处理组中藻液的相对色素含量的变化情况如图 3
所示,色素对五氯酚的敏感程度为:类胡萝卜素> 叶绿
素 a> 叶绿素 b。
(下转第 28页)
25第 6期 洪华嫦等: 五氯酚对斜生栅藻的毒性效应研究
Pb, As,Cr, Mn和Zn的地积累指数均为 1, 说明略有污
染。SC 的Pb的地积累指数为 2, 处于中级污染水平;
另外,As, Cr,Mn,Ni和 Zn的地积累指数均为 1,说明稍
有污染。总之, 3个采样点中, SA 的重金属污染较轻,
SB和 SC 的重金属污染相对严重; 地积累指数分级最
高均为2;重金属污染物为 Pb,Cu,Ni, Cr等。根据淮河
两岸的地理状况和经济发展情况分析, 重金属污染主
要来自于冶金厂、化工厂、焦化厂、电镀厂、皮革厂等排
放的含重金属废水, 以及固体废物的渗漏。
3 结论和建议
a. 淮河沉积物的重金属总体来说有一定的污染,
尤其是对人类健康有较大影响的 Pb, Cu, Ni, Cr的污染
指数偏高,需要引起有关方面的注意。
b. 采样点 SA 地处农业示范区, 该点的重金属污
染较轻;采样点 SB 和 SC 地处化工厂附近,有一定的重
金属污染。
c. 对于重金属污染水平较高的地区,应减少含重
金属污染物的排放, 建立相应的消除措施,避免污染的
加剧。
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(上接第 25页)
图 3 染毒 96 h斜生栅藻藻液中各色素相对含量的变化
Fig. 3 The change of relative pigment level of Scenedesmus
obliquus for 96 h treatment group
3 结论
a1 24, 48, 72, 96 和 120 h 五氯酚对斜生栅藻的
EC50分别为 01883, 01283, 01225, 01168和 01192 mgPL。
五氯酚对斜生栅藻生长的抑制程度随其浓度的增加而
加强,当五氯酚的浓度超过 0150 mgPL时,斜生栅藻的
生长几乎完全受到抑制。
b. 随着五氯酚质量浓度的增加, 各种色素的绝对
含量以及叶绿素 aP叶绿素 b的比值呈下降趋势,表明
藻细胞叶绿体中的色素结构受到损害, 色素对五氯酚
的敏感程度为: 类胡萝卜素> 叶绿素 a> 叶绿素 b。可
溶性蛋白质含量基本上也随着五氯酚质量浓度的增加
而下降, 并与色素含量的变化存在明显的线性相关
( r= 01793, n= 6)。
致谢:该文部分研究得到林里老师的帮助与指导,特此感谢!
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