全 文 ：＊国家自然科学基金重点资助项目(No.39130010)
　　收稿日期:1998-05-25 ,修回日期:1998-10-12
分离自鸡眼草和木蓝的根瘤菌分类研究＊
韦革宏1 　陈文新2 　朱铭莪1
(1西北农业大学资环系　杨凌　712100)　(2中国农业大学生物学院　北京　100094)
提　要　采用数值分类方法对分离自鸡眼草(Kummerow ia)和木蓝(I ndigofera)的根瘤菌及
已知参比菌株进行聚类分析 ,发现在 83%的相似性水平上形成 2 个不同与已知菌种的新类
群。以 SDS 全细胞蛋白电泳技术快速聚类分群扩大菌株数 ,在 86%的相似性水平上 ,分离自
鸡眼草的 24 株菌形成第 1 类群 , 分离自木蓝的 20 株菌形成第 2 类群。 DNA 同源性测定结
果表明 ,这 2 个类群中心菌株 SH713 和 SHL042 与13 个已知根瘤菌种的 DNA 同源性均小于
61%。因此 , 分离自鸡眼草和木蓝的根瘤菌分别构成 2 个独立的根瘤菌新种群。
关键词　鸡眼草 , 木蓝 , 根瘤菌 , 数值分类 , 全细胞蛋白电泳 , DNA同源性
分类号　Q939.09　　文献标识码　A　　文章编号　0001-6209(1999)05-0387 -95
近年来 ,随着豆科植物根瘤菌资源的不断开发和现代分类技术的应用 ,使根瘤菌的分
类研究得到了迅速的发展 ,同时 ,各种方法的应用又从多角度 、多方位揭示了根瘤菌丰富
多样的特征。数值分类是采用大量生理生化性状的测定 ,借助计算机进行聚类分群 ,并可
得到菌群间的鉴别特征和表型特征的描述[ 1] 。蛋白质是基因表达的产物 ,关系密切的根
瘤菌在蛋白质组成上有一定的相似性 ,这是蛋白质电泳分析用于根瘤菌分类的理论基础 。
根瘤菌细胞中可溶性蛋白种类较多 ,通过SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,可将细胞中的各种
蛋白组分进行分离 ,并对电泳图谱进行聚类分析[ 2] 。DNA G+C mol%及 DNA同源性的
测定已成为分类鉴定中的基本方法 ,是一个能反映属 、种间亲缘关系的遗传型特征。在根
瘤菌分类中 ,其被公认为是建立新种的必要标准之一[ 1] 。
本试验在陕甘宁地区野生豆科植物根瘤菌资源调查的基础上 ,对国内外未曾作过分
类研究的分离自鸡眼草和木蓝的根瘤菌 ,应用数值分类方法进行分析 ,然后再进一步采
样 ,以 SDS —全细胞蛋白电泳技术快速聚类分群扩大菌株数 ,并进行 DNA 分析 ,初步确
定其分类地位。
1　材料和方法
1.1　菌株来源
未知菌株分离自黄土高原 —陕西及甘肃的豆科植物鸡眼草属和木蓝属的根瘤 , YMA
平板纯化 、回接原寄主后 ,保存备用 。
参比菌株是目前 Int J Syst Bacteriol上正式发表的13个快生根瘤菌 ,各菌株种名 、宿
主及来源见表 1[ 3] 。
39 卷　5 期
1999 年 10月
微 生 物 学 报
Acta Microbiologica Sinica
Vol.39　No.5
October　1999
DOI :10.13343/j.cnki.wsxb.1999.05.001
表 1　参比菌株一览表
Table 1　List of the reference st rains
种　名
Species
菌　株
S tains
　　宿　主　　Hosts 来　源Origins
R .leg uminosarum USDA2370 T
127K17
Medicago sat iva
Phaseolus sp. 美国美国
R .t rop ici CIAT899T
BR853
Phaseolus vulgaris
Leucaena leucocepha la
CNPBS
CNPBS
R .hainanesis I66 T
H14
Desmodium sinuatum
D .heterophyl lun 海南海南
R .et li CFN42T Phaseolus vulgaris CNPBS
R .galegae HAMBI540 T
HAMBI1185
Galega orien tal is
Galega sp. 芬兰美国
R .cicer i USDA3383 Ciceri ariet inum 美国
S .f redi i USD205T
USDA194
Glycine soja
Glycine soja
河南河南
S .meli lot i USDA1002 T
102F28
Medicago sat iva
Medicago sat iva
美国美国
S .saheli USDA4102 T S esbania cannabine 美国
S .teranga USDA4101 T Acacia laeta 塞内加尔
M.huakuii CCBAU2609 T
A106
Astragalus sinicus
A .sin icus 南京湖北
M.loti NZP2213T
NZP2227
Lotus coniculatus
lotus sp. 新西兰新西兰
M.t iansha nese AIBS T
6
Glycyrriaa pal lid if lora
G.uralensis 新疆新疆
　　T:Type strains　CNPBS;Centro National de Pesquisa em Biologia do solo.
1.2　性状测定
性状测定项目及方法按文献[ 4]进行 ,共测定了包括唯一 C ,N 源试验 ,抗生素敏感性
及对染料和化学药物的耐受性等共 133个项目。每个试验均设三个重复及阳性和阴性对
照。
1.3　全细胞蛋白电泳
1.3.1　SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备:浓缩胶浓度为 3%,分离胶浓度为 12.5%。以熔化
的琼脂密封胶板的边缘和底部 ,胶厚 0.4mm 。
1.3.2　蛋白质样品的制备;采用改进的方法 ,供试菌株经 YMA 斜面活化后 ,接地 5mL
TY液体培养基内 , 28℃振荡培养至对数期 , 12000r/min 离心 3min ,转入 1.5mL Eppen-
do rf管中 ,用 10mmol/L T ris-HCl缓冲液洗涤后 ,加入 0.5mL 的上样缓冲液(SDS 500mg ,
β-巯基乙醇 1mL ,甘油 3mL ,溴酚蓝 4mg ,1mol/L Tris-HCl(pH6.8)2mL , 加水至 10mL),
煮沸 10min , -20℃反复冻融 3 次 ,临上样前 ,沸水浴 2min ,12000 r/min离心 3min ,上清
液点样。
1.3.3　电泳:电泳缓冲液为 Tris-甘氨酸(pH8.3)。点样后 80V 电压电泳 ,待溴酚蓝指示
剂到达分离胶前沿 ,电压增至 300V ,将电泳槽放入 4℃的冰箱。由于每块胶只能点 20个
388 微　　生　　物　　学　　报 39 卷　
样品 ,先选取已作过数值分类的菌株与新采集株进行电泳 ,初步确定各菌株归群 ,再放在
同一块胶上电泳 ,以便于比较 。
1.3.4　染色:采用银染法 ,具体步骤见文献[ 5] 。
1.4　聚类分析
数值分类是根据供试菌株的生长情况 ,形成典型菌落者 ,记为“1 ,否则记为“0”。蛋白
电泳是根据条带的有无 ,将数据分别转换成“1”和“0 ,不同胶上的条带 ,以同一参比菌株各
条带的 Rf值为标准进行比较 。以平均连锁法(UPGMA)聚类 ,系统自动生成树状谱 。
1.5　DNA G+C mol%及 DNA同源性测定
菌体培养与收集 ,DNA的提取按文献[ 6] 。DNA G+C mol%采用热变性法 ,DNA同
源性测定采用初始复性速率法[ 7] 。
2　结果和讨论
2.1　数值分类
图1中 ,全部供试菌株在 66%的相似性水平上聚在一起 。在 83%的相似性水平上 ,
已知参比菌不同种之间能彼此很好的分开 ,它们依次为弗氏中华根瘤菌(Sinorhizobium
fredi i)、萨赫尔中华根瘤菌(S .sahel i)、百脉根根瘤菌(Rhizobium lot i)、天山根瘤菌(R .
tianshanese)、华癸根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、苜蓿根瘤菌(S .meliloti)、豌豆根瘤
菌(R .leguminosarum)、多寄主中华根瘤菌(S .teranga)、热带根瘤菌(R .t ropici)、海南
根瘤菌(R .hainanesis)、菜豆根瘤菌(R .etl i)、山羊豆根瘤菌(R .galegae)和鹰嘴豆根瘤
菌(R .ciceri)。此标准符合Sneath[ 8]的建议 ,其中 R .tropici与 R.hainanesis相似性达到
86%,说明二者的表型性状相似程度高 ,这与谭志远等[ 9] 和王素英等[ 3]的研究结果相吻
合。以上这些参比菌株的分类结果与现行的分类体系一致 ,从而证明本次数值分类结果
的可靠性 。
根据参比菌株的聚类情况 ,在 83%的相似性水平上新分离菌聚为 2个类群。第 1类
群有 5株菌 ,寄主均为木蓝属 ,其中 SH364和 SHL042来自陕西的多花木蓝(I .amblyan-
tha),SH260来自甘肃的多花木蓝 ,另外两株菌 SH385和SHL064分别来自陕西的苏木蓝
(I .crlesii)和波氏木蓝(I .potanini)。中心菌株为 SHL042。第 2 类群有 5株菌 ,寄主为
鸡眼草 ,地理来源均为陕西。中心菌株为SH713。同时从树状图上可以看出 ,寄主与地理
来源相同的个别菌株 ,也并未聚在第 1和第 2类群中 ,如 SH369分离自陕西的多花木蓝 ,
在表型上与第 1类群其它菌株相似性比较低。SH712 、SH269和SH150寄主均为鸡眼草 ,
却与第 2类群其它菌株的相似性不高。说明 ,根瘤菌的表型特征不仅受到寄主的影响 ,同
时 ,也受到地理来源 、生态环境条件的影响。
2.2　各类群之间的鉴别特征
从表 2各类群的鉴别特征统计结果中可以看出 ,第 1 ,2类群的菌株不能在柠檬酸钠 、
海藻糖作为唯一 C 源的培养基上生长 ,而绝大多数已知菌却能生长 。第 2类群的菌株及
M .loti 、S .saheli 不能利用木糖 、苹果酸钠和蔗糖作为唯一 C 源 ,而第 1 类群的菌株及
R .galegae 、R .hainanesis 、M .t ianshanense 能利用 。第 1 类群的菌株对氨苄青霉素
(50mg/L)很敏感 ,而其它菌不敏感 ,当氨苄青霉素浓度增至 300mg/L 时 ,第 2 类群的菌
389　5 期 韦革宏等:分离自鸡眼草和木蓝的根瘤菌分类研究
图 1　数值分类树状图
Fig.1　Dendrogram of numerical taxonomy of rhizobial st rains
株及 S .f redi 、M .huakui i不能耐受。第 1 , 2类群的菌株及 M .huakuii 、R .tropici 、R .
hainanesis不能在含0.1 %的甲基绿培养基上生长 ,而其它已知菌能生长。以上表观特征
的差异表明 ,2 个新类群之间以及新类群与已知根瘤菌各种在C ,N 源利用 ,抗生素抗性 ,
耐逆性等方面存在着多样性。
表 2　各类群之间的鉴别特征
Table 2　Distinctive features of the clusters
鉴别特征
Distinctive features
SF MH SM RL RT M L RG RH MT ST SS RE RC
cluster
1
cluster
2
D-阿拉伯糖
D-arabinose - - - - + - + + - + - + + ± -
丙二酸钙
Calcium malonate
- ± - ± + - - - - - + + - ± -
柠檬酸钠
Sodium cit rate
± + ± + + + + + - + + + + - -
D-山梨糖醇
D-sorbi tol + ± + ± + ± ± + + + + + + ± -
海藻糖
Trehalose
+ + + + + ± + + + + + + + - -
390 微　　生　　物　　学　　报 39 卷　
(续表 2)
鉴别特征
Distinctive features
SF MH SM RL RT M L RG RH MT ST SS RE RC
cluster
1
cluster
2
木　糖
Xylose
± + + ± + - + + ± + - + + + -
苹果酸钠
Maulate
- + + + + - + + + - - + + + -
蔗　糖
Sucrose
± - - - - - + + + + - + - + -
L(-)谷氨酸
L(-)Glutamic acid ± + ± - + - + + - - - - + ± +
氨苄青霉素(500mg/ L)
Ampicillin
+ + + + + + + + + + + + + - +
氨苄青霉素(300mg/ L) - - + + + + + + + + + + + - -
链霉素(50mg/ L)
St reptomycin
+ - ± + + - + + - + + + - + +
甲基绿(0.1%)
Methyi green
+ - + + - + + + - + + + + - -
石蕊牛奶胨化
Litmus milk peptonization
- + - + + + + + - - - - - + ±
　　+:Posi tive react ion;-:Negative reaction;±:Partially posit ive or negative.
SF=S .f redi i;MH=M.huakuii;SM=S.meli lot i;RL=R .legum inosarum;RT =R .t ropici;ML=M.lot i;
RG=R .ga legae;RH=R .hainanensis;MT =M.t ianshanense;ST=S.teranga;SS=S.saheli;RE=R .et li;RC=
R .ciceri.
2.3　全细胞蛋白电泳
在数值分类研究的基础上 ,对木蓝和鸡眼草的根瘤又做了进一步的采集 ,并进行根瘤
菌的分离 、纯化 、回接原寄主 ,然后应用 SDS-全细胞蛋白电泳技术进行聚类分析 ,以扩大
两个新类群的菌株数 。
图 2是 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,供试菌株电泳图谱的部分照片 。从图中可见 ,在
蛋白质组分上供试菌株显示出较大的遗传多样性 。同时 ,本次试验采用改进的蛋白质样
品制备方法及灵敏度较高的银染技术 ,获得了理想的电泳结果 ,图谱条带清晰可见。
根据每个菌株电泳图谱条带的差异 ,以平均连锁法聚类分析 ,聚类结果见图 3(进行
了两次聚类 ,删除未聚入两个新类群的菌株)。图 3 中 ,全部供试菌株在 66%的相似性水
平上聚在一起。在 86%的相似性水平上 ,已知参比菌不同种之间能彼此很好的分开 ,未
知菌聚为 2 个大类群 。第 1 类群有 24 株菌 ,寄主均为鸡眼草 。其中有 5 株菌(SH713 、
SH714 、SH715 、SH711和 SH327)已做过数值分类 ,结果表明它们代表一个新的根瘤菌类
群 ,全细胞蛋白电泳中 ,它们仍聚为同一类群 ,二者聚类结果一致 ,仅仅是蛋白电泳聚类中
相似性达 92%,而数值分类相似性 84%。第 2类群菌株扩大到 20株 ,大多数菌株寄主为
木蓝属中的多花木蓝(I .amblyantha),个别菌株寄主为苏木蓝(I .carlesii)和波氏木蓝
(I.potanini)。其中有 5株菌(SHL042 、SHL064 、SH260 、SH385和 SH364)做过数值分
类。全细胞蛋白电泳与数值分类聚类结果相同 ,表明它们属于一个新的根瘤菌类群 。
从 2个新类群的聚类结果看 ,分离自鸡眼草和木蓝的根瘤菌无论是在生理生化性状
上 ,还是在蛋白组分上与已知根瘤菌在表型特征上都表现出较大的差异性 。
2.4　DNA分析
在全细胞蛋白电泳聚类的基础上 ,测定了 2个新类群菌株的 DNA G +C mol%含量
391　5 期 韦革宏等:分离自鸡眼草和木蓝的根瘤菌分类研究
图 2　部分菌株 SDS-全细胞蛋白电泳图谱
Fig.2　SDS-PAGE of w hole-cell protein electrophoresis pat terns of partial st rains
从左 ※右依次为:SH6848、USDA4101 、SH6864 、SH6863 、SHL042、 SH6843 、USDA4102 、
CFN42 、SH385 、SH6845 、SH6718 、 I66 、HAMBI540 、A106 、 SHL042 、SH260 、F28 、SH6840 、
AIBS 、6 、USDA3383 、USDA1002 、127K17 、SH713 、SH734 、SH7480 、SH726 、SH747 、SH727 、
SH725 、SH7401 、BR853 、SH715
和DNA同源性 ,以及中心菌株 SH713和 SHL042与 13个已知种模式菌株的 DNA 同源
性。其结果见表 3和表 4。
表 3　2个新类群菌株的 DNA分析结果
Table 3　DNA analysis of the st rains in the tw o new clusters
第 1类群 Cluster 1 第 2类群 Cluster 2
菌株
S t rains
G+C mol% 与 SH713的同源性/ %
Homology with SH713
菌株
S t rains
G+C mol% 与 SH L942的同源性/ %
Homology w ith SH L042
SH713 61.6 100 SH6864 59.8 92.1
SH738 59.8 83.7 SH6863 60.4 90.6
SH734 60.2 90.2 SH6846 59.7 86.5
SH7480 61.2 88.7 SH6843 60.4 88.6
SH7391 60.5 85.4 SH6860 59.2 84.5
SH711 60.4 87.6 SH6862 59.0 80.6
SH327 59.5 89.9 SH6861 59.9 85.4
SH7463 59.7 90.2 SHL064 59.0 86.7
SH7481 60.4 91.3 SH385 61.0 94.9
SH726 60.5 94.0 SH6710 59.1 90.4
SH723 61.2 90.4 SH6718 59.3 94.3
SH7400 61.3 89.9 SHL042 60.1 100
SH727 60.4 90.2 SH6845 60.1 82.5
SH725 61.2 87.6 SH260 60.3 90.3
SH715 61.8 89.6 SH364 60.3 88.6
SH714 59.1 93.2 SH6849 59.7 87.2
SH741 59.7 86.5 SH6841 60.4 84.1
SH735 60.3 84.3 SH6865 60.2 90.3
SH7321 60.4 91.0 SH6848 60.4 90.2
SH7390 59.8 90.5 SH6840 59.9 87.6
SH7381 61.2 87.7
SH743 60.3 86.8
SH747 60.4 90.2
SH7401 61.2 87.6
392 微　　生　　物　　学　　报 39 卷　
图 3　全细胞蛋白电泳聚类树状图
Fig.3　Dendrogram of w hole-cell protein electrophoresis of rhizobial strains
393　5 期 韦革宏等:分离自鸡眼草和木蓝的根瘤菌分类研究
表 4　新类群中心菌株与已知种模式菌株的 DNA同源性
Table 4　T he homologies of DNA between the central st rains of new clusters and type st rains of know n species
中心菌株
Cent rak st raubs模式菌株
Type st rains
SH713 SH L042
AIBS 42.9 53.9
NZP2213 24.8 44.8
USDA1002 57.9 55.3
CCBAU2609 28.7 40.7
HAM BI540 18.9 37.4
127K17 49.4 53.7
USDA205 49.3 39.8
CIAT899 58.9 3.08
USDA4101 37.8 55.2
USDA3383 54.2 53.8
CFN42 59.8 58.9
I66 60.2 59.5
USDA4102 56.6 57.0
第 1类群 ,各菌株的 G+C mol%含量为 59.5 ～ 61.8处于 Rhizobium 属范围(59.0 ～
66.5)。中心菌株SH713与群内其它菌株的DNA同源性在 83.7%～ 94%之间 ,按照国际
细菌学会分类委员会建议 , DNA 同源性 70%作为定种的界线[ 4] ,表明它们属于同一种
群。表 2 可见 , 中心菌株 SH713 与 13 个已知种模式菌株的 DNA 同源性在 18.9%～
60.2%之间 ,小于 70%。因此 ,根据数值分类 、全细胞蛋白电泳及 DNA同源性分析 ,分离
自鸡眼草的根瘤菌构成了一个不同于已知种的新种群 。
第2类群 ,各菌株 G+C mol%含量为 59.0 ～ 61.0 ,中心菌株 SHL042与群内其它菌
株的 DNA 同源性在 80.6%～ 94.9%之间 ,与 13个已知种模式菌株的 DNA 同源性在
3.08%～ 59.5%。所以分离自木蓝的根瘤菌也应为一个新的根瘤菌种群。
以上结果可以看出 ,分离自豆科植物鸡眼草和木蓝的根瘤菌构成 2 个独立的表现群
和 DNA 同源群 ,它们应为 2个新的根瘤菌种群。通过对这 2个种群的 16S rDNA基因的
限制性酶切片段长度多态性(RFLP)的分析 ,也表明它们与已知种存在着很大的遗传多样
性(待发表)。
据估计全世界豆科植物有近 2万种 ,而详细对其根瘤进行过研究的不过 5%,其中本
试验选用的豆科植物鸡眼草和木蓝的根瘤菌 ,目前国内外从未对其作过分类研究工作 。
另一方面 ,鸡眼草和木蓝即是优良的饲料植物又可作为中药材 ,具有清热解毒 ,治疗腹泻
之功效。因此 ,鸡眼草和木蓝根瘤菌的进一步深入研究 ,将会对其根瘤菌剂的研制和应用
产生一定的理论和经济价值。
参 考 文 献
[ 1 ] 　Graham P H , Sadowsky M J , Keyser H H.In t J Syst Bacteria l , 1991 , 41:582～ 587.
[ 2 ] 　谭志远 ,陈文新.应用与环境生物学报, 1998 , 4(1):65～ 69
[ 3 ] 　王素英 ,陈文新.微生物学报 , 1997 , 37(5):335～ 343.
394 微　　生　　物　　学　　报 39 卷　
[ 4 ] 　Chen W X , Li G S , Qi L Y et a l.Int J Syst Bacterial , 1991 , 41:275～ 280.
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A STUDYON TAXONOMYOF RHIZOBIA ISOLATED FROM
KUMMERWIA SP.AND INDIGOFERA SP.
Wei Gehong
1　Chen Wenx in2　Zhu M inge1
(1 Dept Resource and Environment , Northwest Agr icu ltural Universi ty , yang ling　712100)
(2 Col lege of Biological Science , China Agricu ltural Un iversity , Beij ing　100094)
Abstract　The rhizobial st rains isolated f rom Kummerowia and Indigofera and the known
reference st rains were classified by performing numerical tax onomy.New isolated st rains
w ere divided into two new clusters at 83% similarity level.Based on the numerical tax ono-
my , additional isolates in each cluster w ere studied by using SDS-PAGE of w hole-cell pro-
tein.Tw enty -four st rains isolated from Kummerowia fell into cluster 1.Twenty st rains
isolated f rom Indigofera fell into cluster 2.The results of G+C mol% and DNA homology
analy sis show ed that the DNA homologies betw een the central st rain SH713 and SHL042 and
the 13 type st rains w ere less than 61%.Thus , the rhizobial st rains f rom K ummerowia and
Indigofera were tw o new individual species of Rhizobium .
Key words 　Kummerowia , Indigofera , Rhizobia , Numerical taxonomy , SDS-PAGE
whole-cell protein , DNA homology
Key Project of Chinese National Natural Science Fund(No.39130010)
395　5 期 韦革宏等:分离自鸡眼草和木蓝的根瘤菌分类研究