全 文 ：收稿日期:2003-10-27
＊国家自然科学基金项目(30070027)资助
＊＊通讯作者
邵继海 ,男 , 1979年生 ,华中农业大学生命科学与技术学院硕士研究生 ,武汉 430070
用 gfp 报告基因检测土壤中 Cu2+对饭豆
根瘤菌生物毒性的研究＊
邵继海　何绍江＊＊　王　平　冯新梅
(华中农业大学农业微生物教育部重点实验室 ,武汉 430070)
摘要　利用绿色荧光蛋白基因 gfp 标记研究了土壤中 Cu2+胁迫对饭豆(Vigna umbellate L.)根瘤菌
JMC1402G 腐生存活和共生固氮能力的影响。研究结果表明:在液体培养条件下 , 向培养基加入 1 μg/ mL 的
Cu2+时 , JMC1402G 的生长受到轻微抑制;当 Cu2+浓度达到 5 μg/ mL 和 7 μg/ mL 时 , JMC1402G 的生长受到严
重抑制;当 Cu2+浓度达到 10 μg/ mL 时 , JMC1402G已不能生长。在灭菌土壤中Cu2+添加量小于 200 mg/ kg 时 ,
JMC1402G 数量在 37 d 内能保持在 1.74×105cfu/g 以上 ,当土壤中 Cu2+添加量达到 500 mg/kg 时 ,在接种后第
2 天其数量已降至 102cfu/g 以下。在未灭菌土壤中 ,当 Cu2+添加量在 0 ～ 80 mg/kg范围内时 , JMC1402G的数
量在接种后23 d 已由108cfu/ g 降至104 ～ 105cfu/ g , 随着Cu2+添加量的进一步增大 ,其菌数迅速下降到104cfu/ g
以下。饭豆盆栽试验结果表明:Cu2+添加量在0 ～ 80 mg/ kg范围内对 JMC1402G共生固氮的影响并不大 ,当土
壤中 Cu2+添加量达到 120 mg/kg 时 ,对 JMC1402G 产生较明显的生理毒性 , 当 Cu2+添加量达到 300 mg/kg 时 ,
JMC1402G 失去结瘤能力。
关键词　饭豆;根瘤菌;铜;生物毒性;土壤
中图法分类号　S 154.38+1
　　Cu2+是生物生长必需的微量元素 ,但是过量的
Cu2+又对生物体有毒[ 1] 。土壤中 Cu2+的背景值大
约在 10 ～ 40 mg/kg 之间 ,平均为 22 mg/kg[ 2] 。据
国内统计 ,我国铜资源居世界第 3位[ 3] 。随着铜矿
的开采 ,矿山地区土壤中 Cu2+的含量远远大于其平
均背景值 ,如 1993年 ,在大冶铜绿山尾矿库周围的
5个采样点中 ,4个点的各层土壤中重金属含量均高
于湖北省土壤环境背景值[ 4] 。这对于矿山复垦是
一个严重的障碍 ,并可能危及人民的生命健康 。饭
豆(Vigna umbel late L.)是一种耐高温 、耐贫瘠 、较
抗旱 ,多种植于热带和亚热带低海拔地区的豆科植
物 ,对矿山环境有较强的适应性 ,有希望应用于矿区
污染土壤的生态修复 。我们以 gf p 基因标记的饭
豆根瘤菌为材料 ,研究了在黄棕壤中添加 Cu2+对饭
豆根瘤菌腐生存活及共生固氮能力的影响 ,旨在为
铜矿地区的生态修复提供理论依据 。
1　材料与方法
1.1　材　料
带绿色荧光蛋白基因 gfp 标记的饭豆根瘤菌
JMC1402G , 具卡拉霉素抗性(Kmr),在 390 nm 的
近紫外光激发下其菌落发出绿色荧光 ,华中农业大
学农业微生物国家重点实验室提供。Cu2+为 Cu-
SO4·5H2O(分析纯)。饭豆种子来自于湖北长阳 。
供试土壤为黄棕壤 ,取自华中农业大学实验农场 ,其
基本理化性质如下:碱解氮 38.06 mg/kg ,有效磷
18.32 mg/kg , 有 效钾 42.90 mg/kg , 有机 质
1.85%,pH 值 6.43 ,总 Cu2+ 20.5 mg/kg 。
1.2　培养基
YMA培养基配方见参考文献[ 5] , SM 培养基
配方见参考文献[ 6] 。
1.3　供试土壤处理
土壤风干过 2 mm 筛后装入棉布袋中 ,装入量
分别为600 g/袋(分灭菌组和不灭菌组 ,用于腐生存
活试验)和 1 650g/袋(灭菌组 ,用于盆栽试验)2种 ,
将灭菌组土壤以 121 ℃1 h湿热间歇灭菌 2次 。灭
菌后装入经表面灭菌的 2.5 L 的塑料小桶中 ,于超
净工作台上加入 20 、40 、80 、120 、200 、300 、400 、500 、
700 、900 mg/kg 的CuSO4溶液(以 Cu2+量为准),对
第 23 卷 第 3 期
2004年　6 月
华　中　农　业　大　学　学　报
Journal of Huazhong Agricultural University
Vol.23　No.3
June 2004 , 307 ～ 310
DOI :10.13300/j.cnki.hnlkxb.2004.03.007
照处理则加入等量的无菌水 ,混合均匀 ,盖上桶盖 ,
28 ℃温育 10 d ,使添加的Cu2+与土壤充分作用 。
1.4　Cu2+对饭豆根瘤菌生长抑制程度的测定
在YMA液体培养基中 Cu2+浓度分别设置为
0 、1 、3 、5 、7 、10μg/mL ,接种后于 28 ℃摇床上以 225
r/min培养 , 每 12 h 取样 1次 , Techcomp7501型紫
外可见分光光度计于 625 nm 波长处测定其 OD值。
1.5　土壤中不同浓度 Cu2+对饭豆根瘤菌腐生存活
的影响
　　菌株的活化 、收集及土壤接种见参考文献[ 7] 。
分别在接种后 2 、5 、9 、16 、23 、30 、37 d进行活菌
检测 ,于超净工作台上按无菌操作规程取样作稀释
平板测数 ,所用培养基为 SM 培养基 ,纳入记数的菌
落以在 390 nm 的近紫外光激发下发绿色荧光者为
准。
1.6　土壤中不同浓度 Cu2+对饭豆根瘤菌结瘤 、固
氮能力的影响
　　按照参考文献[ 8]进行种子催芽 ,选取芽长一致
的种子种于经上述处理的含土量为 1 650 g 的塑料
小桶中 ,同时在种子表面接入 1 mL 活化好了的饭
豆根瘤菌菌液(含菌数约 108/mL),置于灯光栽培室
中培养。栽培室温度白天为 27 ～ 29 ℃,夜间为 24
～ 26 ℃,每日光照 14 h。保持 30%的含水量 , 60 d
后取样分析。
1.7　饭豆根瘤菌固氮酶活的测定
利用日立 163型气相色谱仪进行固氮酶活测
定 ,氢火焰检测 ,担体为 GDX-502 ,柱温 55 ℃,检测
室温度 90 ℃,N2和H2流速 分别为50 、30 mL/min ,
空气流速为 400 mL/min。固氮酶活的计算见参考
文献[ 8] 。
2　结果与分析
2.1　液体培养条件下 Cu2+对 JMC1402G生长的影
响
　　液体培养条件下 Cu2+对 JMC1402G 生长的影
响结果见图 1。从图 1可以看出当液体培养基中的
Cu2+浓度为 1 μg/mL时 , JMC1402G 的生长便受到
轻微抑制;当 Cu2+浓度为 3 μg/mL 时 ,培养 48 h ,
菌悬液的 OD625 nm值在 0.986以上;当培养基中的
Cu2+浓度达到 5 μg/mL 和 7 μg/mL 时 , JMC1402G
的生长受到严重的抑制 ,培养 48 h , Cu2+浓度为
5μg/mL的处理其 OD625nm值仅为 0.103 ,而 Cu2+浓
度为 7 μg/mL 的处理其 OD625nm值此时不能检出;
当 Cu2+浓度达到 10 μg/mL 时 , 饭豆根瘤菌
JMC1402G 已不能生长。
图 1　Cu2+对饭豆根瘤菌 JMC1402G生长的影响
Fig.1　Effect of Cu2+ on the growth of rhizobium
JMC1402G in YMA l iquid culture media
2.2 　土壤中不同浓度 Cu2+对饭豆 根瘤菌
JMC1402G腐生存活的影响
　　在灭菌土壤中添加不同浓度的 Cu2+后对饭豆
根瘤菌 JMC1402G 腐生存活的影响见图 2-A 。可
见 ,当Cu2+添加量在 0 ～ 40 mg/kg 范围时 ,土壤中
JMC1402G 的活菌数在接种后 0 ～ 9 d略呈下降趋
势 ,9 d后其数量开始回升 ,在第 30 ～ 37 天内 ,菌数
保持平稳 。土壤中 Cu2+添加量达 80 mg/kg 时 ,
JMC1402G 的数量在接种后的第 23 天与对照处理
相比下降了近 1 个数量级。当 Cu2+添加量达 200
mg/kg 时 , JMC1402G的数量在早期大幅度下降 ,但
到了 16 d后其活菌数有较大的回升趋势 。当土壤
中Cu2+添加量达到 500 mg/kg 时 ,在接种后第 2天
其数量已降至 102cfu/g以下。
饭豆根瘤菌 JMC1402G 在未灭菌土壤中的存
活情况如图 2-B 所示。从图 2-B可以看出当 Cu2+
添加量为 0 、20 、40 mg/kg 的 3组处理中 ,在接种后
的第 23 天 , JMC1402G 的数量已由 108 cfu/g 降至
105 cfu/g 。当 Cu2+ 添 加 量 达 80 mg/kg 时 ,
JMC1402G 的数量在接种后的第 37 天与对照处理
相比 ,下降了近 1个数量级。随着 Cu2+添加量的增
大 , JMC1402G在土壤中的数量迅速下降 。Cu2+添
加量为 200 mg/kg 的处理 ,在接种后的第 9天其活
菌数已降至 104cfu/g 以下 。Cu2+添加量为 300 、400
mg/kg 的处理组 ,都于接种后第 5天降至 104 cfu/g
以下 。
2.3　土壤中添加 Cu2+对饭豆根瘤菌 JMC1402G共
生固氮能力的影响
　　土壤中不同 Cu2+添加量对 JMC1402G 的结瘤
及固氮酶活的影响的检测和新复极差分析结果见表
308 　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 23 卷　
1所示。通过新复极差分析(LSR)发现 0 、20 、40 、
80 mg/kg 4 组处理的结瘤数 、单株瘤重 、根瘤固氮
酶活均无显著差异 ,但接种 JMC1402G 80 mg/kg 与
20 mg/kg处理相比 ,植株的地上部分干重有显著差
异(P<0.05)。随着 Cu2+添加量的进一步增大 ,各
项检测指标与对照处理相比在 5%及 1%水平上都
表现出了显著差异 。但在没有接种 JMC1402G 的
不同 Cu2+添加量的处理组中 ,只有 Cu2+添加量为
300 mg/kg 有显著性差异(P <0.05)。由此可见 ,
当土壤中 Cu2+添加量达到 120 mg/kg 时 , 对
JMC1402G 已产生了较明显的生理毒性 。随着
Cu2+添加量的增大 ,其结瘤率下降 ,瘤重减轻 。当
Cu2+添加量达到 300 mg/kg 时 , JMC1402G 失去结
瘤能力。
图 2　土壤中 Cu2+添加量对饭豆根瘤菌 JMC1402G腐生存活的影响
Fig.2　Effect of external Cu2+ amendment on survival of rhizobium JMC1402G in soil
A.灭菌土 Sterile soil;B.未灭菌土 Unsterile soil
表 1　土壤中 Cu2+添加量对饭豆根瘤菌 JMC1402G结瘤及固氮酶活的影响1)
Table 1　Effect of external Cu2+amendment on nodulation and nitrogen fixation of rhizobium JMC1402G in soil
Cu2+添加量
C u2+amendmen t
/mg·kg -1
单株根瘤数
Nodules number
of single plant
单株根瘤重
Nodule w eights
of single plant /g
固氮酶活
N-f ixat ion enzyme
act ivi ty/μmol·g -1·h -1
+Rh2)单株地上部分
干重 Shoots dry w eighs
of single plan t / g
-Rh3)单株地上部分
干重 Shoots dry w eighs
of single plant / g
0 55.75 ab A 0.42 a AB 4.65 a AB 0.45 abc AB 0.32 a A
20 60.75 a A 0.46 a A 5.15 a A 0.52 a A 0.33 a A
40 53.25 ab A 0.43 a A 4.91 a AB 0.48 ab AB 0.34 a A
80 52.00 ab A 0.39 a AB 4.39 ab AB 0.44 bc AB 0.30 ab A
120 42.25 b AB 0.29 b B 3.68 b B 0.40 c B 0.28 ab A
200 23.74 c B 0.15 c C 1.47 c C 0.26 d C 0.26 ab A
　　1)表中每个数据为 4个重复的平均值;不同小写字母表示 5%水平上有显著差异 ,不同大写字母表示 1%水平上有极显著差异
Data in the table is the average of 4 repet itions.Dif ferent li tt le let ters af ter data means significant di fference(P<0.05)(LSR), Dif ferent capi-
t al let ters af ter data means greatly significant diff erence(P<0.01)(LSR)
2)+Rh表示接种饭豆根瘤菌 JMC1402G处理 +Rh means inoculating rhizobium strain JMC1402G
3)-Rh 表示不接种饭豆根瘤菌 JMC 1402G 处理 -Rh means no rhizobium strain JMC1402G noculat ing
3　讨　论
由于 JMC1402G的抗性筛选标记太少 ,且其生
长速度与土壤中的土著菌相比相对较慢 ,在未灭菌
组进行平板稀释测数时 ,低稀释度的平板往往被其
它菌覆盖 ,使得我们难以检测到 104 cfu/g 以下的菌
数 ,所以 ,利用多个抗性筛选标记对于不灭菌土壤样
品的平板稀释测数是十分必要的。
从 JMC1402G 在土壤中的腐生存活情况来看 ,
当土壤中 Cu2+添加量达 80 mg/kg 时 ,不管土壤灭
菌与否 ,其数量与 0 mg/kg 处理相比 ,差异最大时
可达到 1个数量级 ,且经 t 值检验此时其差异均达
到极显著水平(P <0.01),说明土壤中 Cu2+添加量
达 80 mg/kg 时 ,已对 JMC1402G产生了生理毒性 。
但从饭豆盆栽结果来看 ,当土壤中 Cu2+添加量达
80 mg/kg时 ,其共生固氮能力与对照处理相比无显
著差异 ,只有当 Cu2+添加量达 120 mg/kg 时 ,与对
照处理相比才产生了显著差异 。分析其原因可能是
盆栽试验过程中 ,饭豆本身对饭豆根瘤菌有一定的
保护作用 。
不同学者在研究土壤中重金属对土壤微生物的
生物毒性时 ,其结果相差甚远。如 Baath 发现不同
309　第 3 期 邵继海等:用 gfp 报告基因检测土壤中 Cu2+对饭豆根瘤菌生物毒性的研究 　
作者通过各自的试验所得出的重金属对微生物的最
高无影响浓度(HNOEC)及最低有影响浓度
(LOEC)相差 100 ～ 1 000 倍之多 ,即使在相同的试
验中使用单一生物学指标 ,其结果的差异也会达到
10 ～ 100倍[ 9] 。Giller 将造成这种现象的原因归结
为两方面:其一 ,土壤中各种复杂因素影响了重金属
的生物毒性 ,其二 ,试验材料对重金属的敏感性不
同[ 10] 。我们在整个试验过程中 ,都是通过向土壤中
添加 Cu2+来营造一个被 Cu2+污染的土壤环境 ,这
样既避免了选用已污染的土壤为试验材料时 ,找不
到除污染因素外 ,其它理化性状与已污染的土壤相
似的未污染对照土壤的难题 ,同时也将非 Cu2+污染
的其它影响因素降到了最低 ,使得我们能够直接得
出土壤中 Cu2+污染对饭豆根瘤菌腐生存活 、共生固
氮的影响 。但这种方法也忽视了自然界中污染是一
个慢慢积累的过程 ,并不能完全代表自然的污染情
况。如何解决好有代表性与易于研究特定污染因素
效应之间的矛盾 ,仍然是污染生态研究者的一大挑
战。
参　考　文　献
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Biotoxicity Analysis of Cu2+ Stress on Rhizobia Rice Bean(Vigna umbellateL.)
in Soil by Using gfp as Report Gene
Shao Jihai　He Shaojiang 　Wang Ping　Feng Xinmei
(State Key Laboratory of Agricultural Microbiology , Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070 , China)
Abstract　The g row th of rice bean(Vigna umbel late L .)rhizobium strain JMC1402G was slightly in-
hibited w hen the concentration of Cu2+ reached 1 g/mL in YMA liquid medium , and it w as seriously inhibited
w hen the concentration reached 5 g/mL and 7 g/mL , and no g row th of JMC1402G was observed when the
concentration of Cu2+ reached 10 g/mL .The numbers of JMC1402G was at high level on 37 d af ter it w as
inoculated into the sterile soil w hen the amount of Cu2+ addition w as less than 200 mg/kg soil.No
JMC1402G could be recovered through the plate count ing method while the concentration of Cu
2+
addition
w as 500 mg/kg soil.In the non-sterile soil , the number of JMC1402G decreased from 108 cfu/g soil to 104 ～
105cfu/g soil respectively on 23 d af ter inoculation w hen the concentration of Cu2+ addition was less than 80
mg/kg soil , and the numbers stayed at this level on 37 d.The number of JM C1402G declined to the level of
under 10
4
cfu/g soil with the increment of concentration of amended Cu2+.The results of po t experiment
showed that there w as no serious inhibi tive effect of ex ternal amendment of Cu2+on nodulation and nit rogen
fixation in soil w hen the ex ternal Cu2+addition is less than 80 mg/kg soil , while bio toxicity can be found ob-
viously w hen the concentration of amended Cu2+ was 120 mg/kg soil , and no nodule w as found when the con-
centration reached 300 mg/kg.
Key words　 rice bean(Vigna umbellate L.);rhizobium;Cu2+;bio toxicity;soil
(责任编辑:张志钰)
310 　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 23 卷