全 文 ：月腺大戟及狼毒大戟体外抗肿瘤药理活性对比研究
何华红，刘 肃，李 薇，严小红，江英桥
(广州市药品检验所，广东 广州 510160)
摘要 目的:通过对比研究月腺大戟和狼毒大戟体外抗肿瘤药理活性，为狼毒质量标准制订提供准确的实验
依据。方法:乙醇超声提取月腺大戟和狼毒大戟，取其浸膏配制成合适浓度为受试物，选取人肝癌细胞株 BEL-
7402，通过观察给药后肿瘤细胞外观改变、MTT法定量检测其 IC50及细胞计数检测药物作用对肿瘤细胞生长曲线
的影响，综合评价月腺大戟和狼毒大戟体外抗肿瘤药理活性。结果:月腺大戟作用于 BEL-7402 细胞 48 h 后，对
BEL-7402 细胞的 IC50为 90. 0 μg /mL;狼毒大戟对 BEL-7402 细胞有显著的增殖抑制作用，作用呈明显量效关系，在
作用 48 h后，对 BEL-7402 细胞的 IC50为 24. 8 μg /mL;月腺大戟和狼毒大戟同一浓度 75 μg /mL对 BEL-7402 细胞杀
伤率分别为 34. 4%和 50%，观测时间 96 h计算其倍增时间(TD 值)分别为 18. 0 h(空白对照为 16. 7 h)及 26. 6 h
(空白对照为 16. 3 h)。结论:月腺大戟和狼毒大戟对 BEL-7402 细胞体外抗肿瘤活性相差甚远，月腺大戟对 BEL-
7402 细胞无明显体外细胞毒作用，狼毒大戟对 BEL-7402 细胞生长有明显抑制作用，作用呈明显剂量依赖性，是一
类很有开发价值的抗肿瘤中药。
关键词 狼毒;月腺大戟;狼毒大戟;抗肿瘤;MTT;生长曲线
中图分类号:R285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2011)06-0950-03
收稿日期:2010-05-31
基金项目:国家科技支撑计划药品安全关键技术研究资助课题(2006BAI14B01)
作者简介:何华红(1975-) ，硕士，主管药师，主要从事药理学、医疗器械及药品包装材料安全性评价研究;E-mail:hhh9690@ 163. com。
狼毒历代以来都有记载和应用，并且临床应用
效果良好，是一类很有研究价值的中药，但一直以来
都有瑞香科狼毒和大戟科狼毒混淆不清，使用较混
乱等问题。1977 年版《中国药典》对狼毒有收载，后
较近几版的《中国药典》都未予以收载，2005 版《中
国药典》一部增补本对其重新收载，定义狼毒为大
戟科植物月腺大戟或狼毒大戟的干燥根。其性味
辛、平、有毒;有散结、逐水、杀虫的功效;外用于淋巴
结结核、皮癣、灭蛆〔1〕。关于月腺大戟和狼毒大戟
的毒理及药理药效方面报道的文献颇多，但文献报
道多有不太一致的地方，据文献查询和笔者课题研
究的实验结果看，月腺大戟和狼毒大戟在其毒理及
药理药效方面颇多不同，2005 版《中国药典》笼统将
其收录定义为同一药材似有不妥，以现代药理方法
对其进行毒理及药理药效对比研究可以为标准制订
提供准确实验依据，达到正本清源目的。据 2005 版
《中国药典》记载，狼毒有散结的功效。结在中医泛
指一切有形的肿块或是气象不畅等症，有形的肿块
有恶性肿瘤、良性肿瘤、囊肿、淋巴结肿大、皮下结
节，皮疹等。本文主要介绍笔者对月腺大戟和狼毒
大戟体外抗肿瘤药理活性对比研究的部分工作。
1 材料与仪器
1. 1 细胞株 人肝癌细胞株 BEL-7402(购于中科
院上海生命科学研究所细胞库)。
1. 2 药物与试剂 月腺大戟购买于安徽省亳州药
材市场，狼毒大戟由康臣药业提供，经广州市药品检
验所中药室刘柏英主任药师鉴定;RPMI-1640 细胞
培养基(GIBCO公司产品) ，加入终浓度为 10%的小
牛血清(杭州四季青)及 100 IU /mL 的青霉素和链
霉素;噻唑蓝(MTT) (Sigma公司产品) ;台盼蓝染色
剂(SIGMA公司产品) ;胰蛋白酶及其他细胞培养所
需耗材(广州标迈生物有限公司) ;丝裂霉素(浙江
海正药业股份有限公司，批号:081013，规格:2 mg /
瓶) ;所用试剂均为分析纯。
1. 3 主要仪器 倒置显微镜(德国蔡氏公司，型
号:Axiovert 40 CFI) ;生物安全柜(美国 Nuaire 公
司，型号:Nu-425-400E) ，二氧化碳培养箱(美国 Nu-
aire公司，型号:Nu-4750E) ;连续波长酶标仪(美国
Molecular Devices公司，型号:Versa Max)。
2 方法
2. 1 药材样品处理 药材粉碎，37 ℃烘干，称取
适量药粉，乙醇超声提取(30 min /次，2 次至滤液无
色) ，定性滤纸过滤，滤液收集再经 0. 45 μm 滤膜过
滤，收集滤液，经旋转蒸发仪除去残留溶剂得浸膏，
称取适量浸膏，DMSO 溶解制成母液(240 mg /mL)
备用。
2. 2 细胞培养 细胞常规传代培养 3 d 至对数生
长期，0. 25%胰酶消化处理，按 1 × 104 /mL 浓度分
别接种于 96 孔培养板及 24 孔培养板，其中 96 孔板
中每孔加入 100 μL 细胞悬液，24 孔板中每孔加入
500 μL细胞悬液，置于 CO2 培养箱培养
〔2〕。
2. 3 MTT检测 试验分空白对照组、给药组及阳
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性对照组，空白对照组直接用含 10%小牛血清的
RPMI-1640 培养液(以下简称培养液)孵育，给药组
用不同浓度梯度含药培养液孵育，阳性对照组用不
同浓度梯度含药(丝裂霉素)培养液孵育。取药样
母液(240 mg /mL) ，根据预试结果，月腺大戟用培养
液配制成下列浓度梯度:600、300、150、75、37. 5 μg /
mL;狼毒大戟用培养液配制成下列浓度梯度:600、
300、150、75、37. 5、18. 75、9. 38、4. 69 μg /mL;阳性药
选用经典抗肿瘤药丝裂霉素，用培养液制成下列浓
度梯度溶液:1 × 10 －4、1 × 10 －5、1 × 10 －6、1 × 10 －7、1
×10 －8 mol /L(丝裂霉素分子量 M = 334. 33，该系列
摩尔浓度相当于 33. 4、3. 34、0. 334、0. 0334、0. 00334
μg /mL系列浓度) ;测试 pH 值，空白培养液和含药
的梯度溶液无明显改变。细胞常规制成 1 × 104 /mL
悬液，100 μL /孔接种于 96 孔培养板，每组平行复种
4 孔，96 孔板边缘孔全部加入无菌 PBS 填充，第 1
列中留下空白孔调零(只加培养液不加细胞，其他
操作全部平行操作) ，5% CO2、37 ℃、饱和湿度环境
培养过夜，弃去原培养液，空白组用新鲜培养液交
换，给药组及阳性组用相应的浓度梯度含药培养液
交换，置于培养箱中继续培养，48 h 后每孔加入 5
mg /mL MTT溶液 20 μL，继续培养 5 h，弃去孔内液
体，每孔加入 200 μL 二甲基亚砜(DMSO) ，慢速振
荡 10 min，酶标仪 570 nm 波长处检测光密度 D(λ)
值，取四孔平均值。根据下式计算细胞生长抑制率
(IR)。Bliss法计算半抑制浓度(IC50)
〔2〕。
IR(%)=［1 －
D(λ)实验组
D(λ)空白对照组
］× 100%
2. 4 生长曲线测定 试验分空白对照组、给药组
及阳性对照组，空白组直接用含 10%小牛血清的
RPMI-1640 培养液(以下简称培养液)孵育，给药组
用不同浓度含药培养液孵育。月腺大戟取 3 个给药
终浓度:150、75、37. 5 μg /mL;狼毒大戟取 5 个给药
终浓度:75、37. 5、18. 75、9. 38、4. 69 μg /mL。细胞常
规制成 1 × 104 /mL细胞悬液(空白对照组用培养液
制悬，给药组用相应含药培养液制成细胞悬液) ，
500 μL /孔接种于 24 孔培养板，每组平行复种 4 孔，
接种当天及接种后第 1、2、3、4 天分别用 0. 4%台盼
蓝液染色，计数其拒染活细胞数，以其对数与时间作
图，根据所得图计算药物对增殖细胞的杀伤率及细
胞倍增时(TD)的影响。
杀伤率(%)=
N0 － N

0
N0
× 100%
式中:N0 及 N

O 分别指空白对照组和给药组生长曲线的
线性部分延伸至 Y 轴的截距;TD = 0. 301t / logNt － logN0(N0
及 Nt代表接种后及培养 t小时后的细胞数) ，TD 的延长表明
药物使细胞增殖能力减弱〔3〕。
2. 5 统计学处理 应用 SPSS 10. 0 统计软件，数
据以 珋x ± s表示，采用方差分析进行统计学分析，P ＜
0. 05 为差异有显著性。
3 结果
3. 1 月腺大戟及狼毒大戟药材的乙醇超声提取
结果如表 1 所示。
表 1 两种药材乙醇超声提取结果
药材 药材质量 /g 所得浸膏 /g 提取率 /%
月腺大戟 56. 73 1. 371 2. 42
狼毒大戟 30. 95 2. 407 7. 78
3. 2 细胞增殖活力检测 月腺大戟对 BEL-7402
细胞生长抑制作用不显著，较高浓度才显示出生长
抑制作用，在作用 48 h 后，对 BEL-7402 细胞的 IC50
为 90. 0 μg /mL;狼毒大戟对 BEL-7402 细胞有显著
的生长抑制作用，作用呈剂量依赖关系，在作用 48 h
后，对 BEL-7402 细胞的 IC50为 24. 8 μg /mL。见表
2。
表 2 48 h后给药组与空白对照组 IR值(珔x ± s，n =4)
剂量 /
(μg /mL)
月腺大戟
D(λ)值 IR /%
狼毒大戟
D(λ)值 IR /%
剂量 /
(μg /mL)
丝裂霉素
D(λ)值 IR /%
空白对照 0. 446 ± 0. 066 － 0. 560 ± 0. 018 － 空白对照 0. 556 ± 0. 036 －
600 0 100 0 100 33. 4 0 100
300 0 100 0 100 3. 34 0. 051 ± 0. 016* 90. 8*
150 0. 120 ± 0. 023* 73. 0* 0 100 0. 334 0. 192 ± 0. 038* 65. 4*
75 0. 292 ± 0. 062* 34. 4* 0. 137 ± 0. 038* 75. 5* 0. 0334 0. 402 ± 0. 044* 27. 6*
37. 5 0. 386 ± 0. 014 13. 5 0. 266 ± 0. 044* 52. 4* 0. 00334 0. 465 ± 0. 053* 16. 4*
18. 75 － － 0. 354 ± 0. 031* 36. 9* － － －
9. 38 － － 0. 408 ± 0. 035* 27. 2* － － －
4. 69 － － 0. 482 ± 0. 038* 14. 1* － － －
注:与空白对照组比较，* P ＜ 0. 05
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3. 3 生长曲线测定 月腺大戟对 BEL-7402 细胞
生长抑制作用不显著，狼毒大戟对 BEL-7402 细胞
有显著的生长抵制作用。见图 1、2。根据所得图计
算药物对增殖细胞的杀伤率及细胞倍增时(TD)的影
响，取月腺大戟和狼毒大戟同一浓度 75 μg /mL 进行
计算比较其杀伤率;取同一浓度 75 μg /mL，观测最后
时间 96 h计算其倍增时间 TD 的值，结果见表 3。
图 1 不同浓度(取其对数值 －4)、不同时间下月
腺大戟对 BEL-7402 细胞生长曲线的影响
图 2 不同浓度(取其对数值 －4)、不同时间下狼
毒大戟对 BEL-7402 细胞生长曲线的影响
表 3 月腺大戟及狼毒大戟对 BEL-7402
细胞生长曲线的影响
空白对照组
(月腺大戟
试验同时)
月腺
大戟
空白对照组
(狼毒大戟
试验同时)
狼毒
大戟
杀伤率 /% － 34. 4 － 50
TD /h 16. 7 18. 0 16. 3 26. 6
4 讨论
两种药材对 BEL-7402 细胞 MTT试验及生长曲
线影响结果表明: (1)月腺大戟对细胞生长有抑制
作用(TD 延长) ，但其作用有限(作用 48 h 后，对
BEL-7402 细胞的 IC50为 90. 0 μg /mL) ，IC50值远大
于 20 μg /mL，对 BEL-7402 细胞无明显体外细胞毒
作用;(2)狼毒大戟对细胞生长有抑制作用(TD 延
长) ，且作用明显(呈明显剂量依赖关系，在作用 48
h后，对 BEL-7402 细胞的 IC50为 24. 8 μg /mL。) ，
IC50值接近于 20 μg /mL，对 BEL-7402 细胞有明显体
外细胞毒作用，是一类很有开发价值的抗肿瘤中药。
显微镜下观察，月腺大戟醇提物组加药后肿瘤
细胞形状改变不大，细胞数较对照组减少，推测其作
用主要是抑制肿瘤增殖活性;狼毒大戟醇提物组加
药后肿瘤细胞形状明显变圆，推测其作用主要是杀
伤肿瘤细胞，诱导其凋亡，其机制需要进一步研究以
证实。
体外抗肿瘤试验初步证实狼毒大戟对人肝癌细
胞株 BEL-7402 体外细胞毒作用远强于月腺大戟，
目前综合大多数文献报道，月腺大戟粗提物抗肿瘤
活性报道较少，但有报道表明其一些提取物如一些
二萜类化学成分有抗肿瘤活性〔4〕。狼毒大戟中一
些有抗肿瘤活性的提取物如二萜类化学成分岩大戟
内酯 B 在月腺大戟中也同样能提取获得，但其含量
在狼毒大戟中远高于月腺大戟〔5〕。这可能是狼毒
大戟对人肝癌细胞株 BEL-7402 体外细胞毒作用远
强于月腺大戟的原因。
体外细胞毒性试验结果只能初步证实其有无抗
肿瘤活性，两种药材是否有抗肿瘤作用需要整体动
物抗肿瘤试验进一步证实。体外无细胞毒作用的月
腺大戟整体有可能通过免疫调节作用来达到抗肿瘤
的效果，狼毒大戟体外细胞毒作用明显，但内有无活
性也需要试验进一步来证实。
参 考 文 献
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［5］刘文粢，何风雷，阮子镛，等 . 狼毒大戟二萜内酯对人癌
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