全 文 ：福建农业学报 2 1( l ) : 3 2 ~3 4, 2 0 0 6
F咐 ia n oJ u r n a l of A g r i` u lt u ar l S e i e n c e s 文章编号
:
1 0 0 8一 0 3 8 4 ( 2 0 0 6 ) 0 1一 0 0 3 2一 0 3
基于 r D N A I T S 分析的假高粱鉴定方法
郭晾 霞 ’ , 黄可 辉 ` , 虞 协 ` , 吴珍泉 2
l(
. 福建出入境检验检疫局 , 福建 福州 3 5 0 0 0 1 ; 2 . 福建农林大学 , 福建 福州 3 5。。。2)
摘 要 : 通过对供试的假高粱和同属近似种拟高粱 、 明福 l 号的 r D N A I T S 区进行 P C R 扩增和 R F L P 分析 , 结果
表明 , 明福 1 号 、 拟高粱和假高粱三者均有 850 b p 左右条带 , 而且假高粱在 65 0 b p 和 20 b p 附近均有两条谱带 ,
而明福 l 号 、 拟高粱在 “ 0 bp 和 20 b p 附近只有一条清楚谱带 . 与测序比对结果一致 。
关键词 : 假高粱 ; I T S 区 ; R F L P
中图分类号 : 5 4 1 一 3 0 文献标识码 : A
A P P l i e a t i o n o f r i b o s o r a l D N A i n t e r n a l t r a n s e r i b e d s P a e e r t o i d e n t i f i e a t i o n o f
S o gr h u m h a leP e n s e
G U ( ) Q i
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a o E n t即一 E x i t I n sP e c t i o n a n d Q u a r a n r i n e B u r e a u , F u z h o u · F iuj a n 3 5 0 0 0 1 , C h i n a ;
2
·
F `勺 i a n A g r ic u l t u r e a n d F o er s t即 U n i v e r s i t夕 . F u z h o u , F uj ia n 3 5 0 0 0 2 , C h i n a )
A b s t r a e t
:
T h e P C R a m p l if ie d I T S fr a g m e n t s w e r e a n a l y z e d b y r e s t r ie t io n e n d o n u e le a s e d ig e s t i o n (R F I
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) P e r s w h ie h y i e ld e d t w o b a n d s a r o u n d 6 5 0 b p a n d t w o b a n d s
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B u t s i g n i f ie a n t ly d i f fe r e n t fr o m t h e R F I
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T h e r e s u l t s w e r e e o n s i s t e n t w i t h t h e f a e t w h ie h
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P r o P i n g u u m
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0嗒 h : ` m h a l e P e n s e ( I J · ) p e r s ; in t e r n a l t r a n s e r ib e d s p a e e r ; r e s t r i e t io n f r a g m e n t le n g t h p o ly m o r p h is m
假高粱仁S o r g 人u m 人。 l e p e n s 。 ( L . ) P e r s 〕系高粱
属 (S or g h u m )草本植物 ,为世界十大恶性杂草之一 ,
也是我国禁止输入的危险性杂草 。 当前 ,我国已加入
W T O
,植物及其产品的进 出口批次在不断增加 , 假
高梁的检出机率也在不断增大 。因此 , 在植物及其产
品进出口时 , 如何对其进行快速检测已成为我国检
验检疫部门的一项重要课题 。 虽然目前在假高粱的
形态学 l[] 、 细胞学图等方面有了较深入的研究 ,但由
于高粱属植物是异花授粉植物 ,假高粱与其近似种
形态特征非常相似 。因此 ,本研究利用分子生物学技
术对假高粱进行 D N A 分子鉴别 ,通过对高粱属假高
粱 及 其 近 似种 明福 1 号 ( 5 . sP . ) 、 拟 高粱 [ .S
P r op i
, ,
g u u m ( K u n t h
.
) H i t e h e 〕的 核 糖 体 D N A
( r D N A )的内转录间隔区 (I T S )进行 P CR 扩增 ,对其
扩 增产 物进 行 限制 性 片段 长 度 多态 性 分析
( R F L P )
,寻找出可鉴别假高粱 D N A 的限制性内切
酶 , 旨在建立一种快速鉴定假高粱 D N A 的分子标记
收稿日期 : 2 0 0 5一 0 1一 17 初稿 ; 20 0 5一 0 5一 18 修改稿
作者简介 : 郭琼霞 ( 1 95 4一 ) , 女 , 研究员 . 从事植物检疫工作 。
基金项目 : 国家质量检验检疫监督总局科技项 目 (I K Z 。。 20 5 9 ) .
方法 。 ’ :
1 材料与方法
1
.
1 材料及试剂
供试材料 : 假高粱 ( 从美国格尔夫波特口岸进
口大豆中截获 ) 、 拟高粱 (福建野生杂草 ) 及明福 1
号 (福建农林大学驯化培育的牧草 ) 。 使用试剂 : 用
于 I T S 一 P C R 扩增的试 剂均购 自 BI O A SI A 公司 ;
D N A M a r k o r l
,
W id
e 购 自上海华舜生物工程有限
公司 ; x o o b p D N A L a d d e r 购 自 F e r m e n t a s 公司 。
1
.
2 方法
1
.
2
.
1 模板 D N A 的提取 假高粱与其近似种拟高
粱 、 明福 1号 D N A 的提取方法均采用文献 「3」的
方法 。
1
.
2
.
2 IT S 一 P C R 扩增 采用 S u n 等 [` ]设计的用于
扩增 r D N A I T S 片段的引物 , 由 BI O A SI A 公司合
成 , 其序列为 : P l : 5`一 A C G A A T T C A T G G T C C
第 1 期 郭晾霞等 : 基于 r D N A I T S 分析的假 高粱鉴定方法
G G T G A A G T G T T C G 一 3 , ; P Z : 5`一 T A G A A T
T C C C C G G T T C G C T C G C C G T T A C 一 3` 。
扩增反应体系总体积为 50 闪 , 组成为 : 39 . 6 川
d d H ZO
,
5 拜1 1 0 X P C R b u f f e r , 1 拜1 d N T P ( 1 0
m m o l )
, 0
·
4 拼1 T a g 酶 ( S U · 拌l一 , ) , 1 拌1 P I ( 1 0
拌m o l ) , l 拼1 P Z ( 10 拼m o l ) , 2 拼1 D N A ( 约 5 0
n g
· 拼l一 1 ) 。
扩增反应 程序为 : 94 ℃预变性 3 m in , 94 ` C 、
1 m i n
,
6 0℃ 、 1 m i n , 7 2 ` C 、 2 m i n , 循环 3 5 次 , 最
后在 7 2亡下延伸 s m i n 。 扩增反应在B io m e t r a 公司生
产的梯度 P CR 扩增仪上进行 。
扩增产物电泳 : 取 6 闪 P C R 产物在 2%琼脂糖
凝胶进行电泳 (以 1 0 b p 分子量标准为参考 , 电压
3 V
· 。 m 一 ` ) , 经澳化 乙锭染色后于凝胶成像处理系
统 ( G I S 一 1 0 0 0 ) 上观察拍照 。
1
.
2
.
3 限制性 内切酶的确定 对假高粱 、 拟高粱 、
明福 1 号的 P C R 扩增产物进行 回收 、 纯化 、 克隆与
测序 (均由B IO A S I A 公司完成 ) 。 用D N A M A N V e r -
is on 5
.
0 软件对上述三者的 r D N A I T S 区进行序列
比对 , 其中部分序列 比对结果见图 1 。 根据序列之间
碱基差异和 已商品化的限制性内切酶的识别位点的
特异性 、 酶切反应后的酶切片段的大小 、 数量 , 以
及这些限制性内切酶在琼脂糖凝胶电泳上分离的程
度 ,筛选出限制性内切酶尸m a C l (识别位点为C A C
今G T G , 购 自M B I 公司 ) 。
乃 n a C I 的酶切位点
nU八tI一Q甘口二户匀.4内匕八ObG二“ e Ge、 e o GeGAT “ 、 Te G“ eAe Ac巨画啄TG、 撇 eAe
G二二GG二 e e GG“ 二 e GTe Te Ge c Ae A堰亘咏、 “ e o e Ae
GT GGGGo Ge e“ e eo eG、 TeGGe eAe AG应瑟二“ e Go e
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TAT GT GT CTCGGGT CAGCGCCCCGACACG竹 GCCGGCGCATCGGCCCT 700
TTAGT GT CTCGGGT CAGCGCCCCGACACGT GCCGGCGCATCGGCCCT 700
二 Ae二 e T e TeGGTGe AGe e e e e c e迈亘亚e e eGe Ge ^ Te GGe e c T 699
P , , , a C I的酶切位点
明福 1 号 ; 2 : 拟高梁 ; 3: 假 高粱
图 l 明福 1号 、 拟高粱和假高粱的 r D N A I T S 区部分 列比对
F ig
.
1 C o m P a
r is o n o r r D N A I竹 g e n e s e g m e n t s f r o m 5 . s p . , S ·
序
P r o P ,月 g 份 “ 优 a n d 5 . h a l e P e n s e
1
.
2
.
4 I T S 区 P C R 产抽的限制性酶切分析 酶切
反应体系总体积 2 0 拜l , 包含 7 . 5 拌1 dd H ZO 、 2 拌1 1 0
只 P C R b u f f e : (含有0 . 1% T r i t o n X 一 1 0 0 ) 、 0 . 2 拼 l 限
制性内切酶 ( l o U · 拜l一 ` ) 、 1 0 拜1 P C R 扩增产物 ; 反
应在 3 7 ` C下进行 16 h ; 酶切产物经 3%琼脂糖凝胶 电
泳 , 嗅化乙锭染色后 于凝胶成像处理 系统 ( G IS -
1 0 0 0 ) 上观察拍照 。
拟高粱的 r D N A I T S 区进行 P C R 扩增 , 其产物电泳
结果显示 (图 2 ) , 三者均出现一条约为 850 b p 特异
性的扩增带 。
9X() bP
8X() b P
2 3 C K
2 结果与分析
.2 1 D N A 提取
本研究对假高粱及其近似种 D N A 的提取 ,获得
的 D N A 的 O D 2 6。 / O D 2 8。在 2 . 7 2 7 ~ 2 . 9 7 8 范围内 , 质
量浓度在 5 0 2 ~ 4 4 8 n g · “ l一 ’ 范围内 , 说明符合 p C R
扩增要求 。
2
.
2 r D N A I T S 区的 P C R 扩增
利用特异性引物 P l 、 P Z 对假高粱 、 明福 1 号 、
M
:
1 0 0 b P D N A L a d d e r ;
1
: 明福 1 号 ; 2 : 拟高粱 ; 3 : 假高粱 ; C K : 清水
图 2
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·
假高粱及其近似种的 r D N A IT s 的 P c R 扩增图谱
E l e e t r o P h o r e s is o f P C R P r o d u e t s w i t h 3 r e l a t e d
s P e e i e s o f S
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福建农业学报 第 1 2卷
2
.
3假高粱 r N DA I T S 区的 R F P L分析
利用限制性内切酶尸 , a C I 酶切明福 1号 、 拟高
粱和假高粱的 r D N A I T S 区 , 结果显示 (图 3 ) , 除
了均有 85 0 b p 左右条带外 , 假高粱在 6 50 b p 和 20
b p 附近分别有两条谱带 , 而明福 1号 、 拟高粱在 “ O
b p 和 20 0 b p 附近则只有一条清楚谱带 。 这与假高粱
在 r DN A I T S 区有两个尸m a C I 酶切位点 , 而明福 1
号 、 拟高粱在此区只有一个 尸m a C I 酶切位点的结
果一致 (图 1 ) , 且各酶切谱带的大小与测序的结果
一致 。 说明根据尸m a C l 酶切电泳结果可以将假高
粱与明福 1 号 、 拟高粱区分出来 。
效的鉴别 。 Zh a o 等 [`〕运用 r D N A I T s 序列鉴定了山
姜属红 豆范及其同属 相似种 。 丁 小余等图根据
r D N A IT S 区对束花石解及其相似种植物和药材进
行 D N A 分子鉴别 . 包颖等阁根据 r D N A I T S 序列的
R F L P 分析快速 、 可靠地将稻属 C D 染色体组物种区
别开来 。 本研究通过对供试的假高粱和同属近似种
拟高粱 、 明福 1 号的 r D N A IT S 区进行 P C R 扩增和
R F L P 分析 , 结果表明 ,此方法可以将假高粱与明福
1号 、 拟高粱区别开来 , 为我们提供了一种简便 、 快
速鉴定高粱属假高粱及其近似种的可行方法 , 也为
口岸杂草检疫鉴定提供快速 、 准确的检测方法和理
论的科学依据 。
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I T S R e g io n eS q
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n ia 即 l a n g a a n d T h e i r
A d u lt e r a n t , [ J〕. P la n t a me d i e : , 2 0 0 1 , 6 7 : 38 1 .
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( 责任编辑 : 林树文 )
2031
M
:
D N A M a r k e : l
,
w id e ; 一: 明福 1 号 . 2 : 拟高粱 . 3 : 假高粱
图 3 P m a C x 酶切图谱
F ig
.
3 R e s t r i e t io n r r a g m e n t P a tt e r n s o f P m a C
3 讨 论
由于 r D N A 中的 IT S 区的高度重复性和一致进
化性 , r D N A I T S 区已成为一种探求科内 、 属内 、 种
间的系统亲缘关系及其物种鉴别的重要分子标记 。
N ga n 等 s[J 成功地利用 R F L P 技术对人参属 6 种药用
植物和 2 种常见的人参伪品的 r D N A IT S 进行了有