全 文 ：20 8 年第 2期 植物检疫 PL AN T QUA RN AI r FN EV o l.22N o .2
毒麦及其近似种D r N AI TS 一L R P F初步分析
张 姐 ` 康 林 , *
( 1
. 湖南农业大学生物安全科技学院长沙 41 01 28
高必达 ` 陈冬美,
2
. 深圳出人境检验检疫局动植物检疫技术中心 )
T he per l i而 n a叮 a n al y is of f s 一 R F L P in L刃左“ m et m u le n扭 m L .
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一 R F廿 a n al y s i s i n s i x s p e e ie s of 肠 l i u m r D NA I TS er ig o n , th e m o l e e u lar le v e l w e er if sr t i -
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fo r P CR 一 R F廿 a n a ly s i s . F o u r 肠 l i u m s p e e i e s e a n b e d i s d i即 i s h e d b a s e d o n th e t h er e er s t ir e t io n m a v s a s s a y e d .
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,
t h i s P CR 一 RF廿 m e ht e d e s t ab l i s h e d i n ht i s s tu dy e a n b e u s e d a s th e b a s i s fo r id e n t讯 e a ti o n b e wt e e n
肠 l i u m et m u le n t u m L . a n d i t s s im i l a r s P e e i e s .
eK y wo dr 肠 l i u m et m u le n r u m L , i n t e rn al tarn s e ir b e d s p a e e r , er s t ir e t io n fr ag m e n t l e n gt h p o ly m o Ph is m , D N A
er s itr c t l o n e n z y m e s
摘要 本研究对毒麦属 6 个种的核糖体 IST 进行 PC R 一 RF廿 分析 , 首次从分子水平上鉴定区分了毒
麦属 4 个种 (毒麦 、 亚麻毒麦 、 多花黑麦草 、 瑞士黑麦草 ) 。 根据这 4 个种 IT S 的测序结果 ,选取 3 种内切酶
( B s SI
、
ifT l
、
Nhe l) 应用于 P CR 一 R F廿 分析 。 根据酶切图谱可将 4 个近似种鉴别 区分 。 为建立 P CR -
RF廿 分子鉴定方法而有效地区分毒麦及近似种提供依据 。
关键词 毒麦 IST 区 RFLP D NA 限制酶
中图分类号 54 51 , Qs o 3 ,斜 l 一 30
毒麦属 (肠 il u m ) 又称黑麦草属 , 隶属禾本科 及其近似种的分子生物学鉴定方法 。 为了能准确
( Gar m in ea
e
)
, 具有重要的经济意义。 其原产欧洲 区分和快速鉴定毒麦及其近似种 ,适应口岸对毒麦
的毒麦 (肠il u m et m “ le 瓜“ m )及其变种田毒麦和长芒 的快速检疫和毒麦疫情普查及防治 , 本文在毒麦及
毒麦 、亚麻毒麦 、 多花黑麦草 、瑞士黑麦草等都是我 其近似种的 rD NA 内转录间隔区 ( int e n lal t r al 玛 c ir be d
国政府规定禁止进境的危险性有害植物或政府关 sP ac er , irS )序列测定和限制性内切酶位点分析的基
注的有害植物 。 础上 ,对其 rD N A 邢 区 代R 扩增产物进行了限制性
毒麦及其变种不但能引起人畜中毒 , 同时也降 片段长度多态性 ( rD NA 邢 一班 ,廿 )分析 。
低了麦类作物的产量和质量 。 近年来 ,我国每年从 1 材料和方法
国外进口麦类产品约 10 0 万 t 。 经常从进 口的粮 1 . 1 材料及试剂
食 、种子 、饲料粮中检出毒麦属种子 , 因为毒麦与其 材料 :毒麦 、 田毒麦 、 长芒毒麦来自于中国检科
近似种难在种子级别上用形态学的方法区分 , 且由 院动植物检疫所和福建检验检疫局 ;亚麻毒麦 、 多
于进 口的农产品在出口国需进行脱粒干燥 ,贮运 、 花黑麦草 、瑞士黑麦草来自于中科院和中国检科
装卸等原因 ,作为鉴定的主要外观形态特征往往被 院 。
破坏或不明显 。 因此 ,本研究建立了一种区分毒麦 试剂 :用于 IT S 一 PC R 扩增的试剂均购自大连
* 基金项目 :国家质检总局项 目 ( 20 7I 2K 34 ) 。
收稿 日期 : 20 7 一 08 一 24
一 7 0 一
2 0 8年第 2期 植物检疫P LA N TQUAA R N T IN E Vo l.2 2 No .2
宝生物公司 , 限制性内切酶 sB sS L ifT l 、 Nhe l 购自
N e w E n gl
a n d B i o l五五s 公司。
1
.
2 方法
1
.
2
.
1 模板 DN A 的提取
取各样品种子 10 粒 , 用 Q认 q u i e k R D N A E x -
atr ict on 儿 t 试剂盒抽提植物总 DN A (方法见试剂盒
说明书) 。
1
.
2
.
2 IST
一 PC R 扩增
采用王氏川报道的璐 通用引物 Is4T ( 5 ’ -
T CCT CC G CT A竹C ATA T G C 一 3 ’ ) , n S S ( 5 ’ 一
G G AA GT A AA AGT CGT A A CA A GG
一 3 ’ )
, 由北京奥
科生物技术公司合成 ;扩增体系 50 卜L ( 10 X P c R
b u fe
r , 2
.
5 m m o l/ L M g C I:
,
0
.
2 n m o F L dN T P
s , T a q
酶 I U , 10林m o F L 引物 ,模板 DN A 为 l o n g ) :循环
参数为预变性 94 ℃ s m in , 变性 94 ℃ l m in , 退火
55℃ 30 5 ,延伸 7 2 ℃ 1m i n , 3 5 个循环 , 最后延伸
7 m i n 〔2〕 。
1
.
2
.
3 测序
PC R 产物经 Q认G EN P CR 纯化试剂盒纯化好
后 ,送上海基康生物技术公司进行克隆及测序。
1
.
2
.
4 邢 区 PCR 产物的限制性酶切分析
w e b e u t e己 . 0 程序 ( h t tP : / m a . l u n db e嗯 . 即 .
s
e/ cu t erZ / )被用于毒麦属 rD NA T】S 序列的限制性
内切酶酶切图谱分析 ,根据酶切图谱的差异选择合
适的限制性内切酶 sB sS (I 识别位点为 G 工A C -
G A )G
、
ifT (I 识别位点为 G 牛A双叮C ) 、 N he (I 识别位
点为 G 工CTA GC ) 。 本研究中所用的限制性内切酶
为 B s s S I 、 ifT l 和 Nhe l 。 20 林L 反应体系 ,含 10 x N EB
B u fe
r Z林L , 限制性内切酶 0 . 5 林L , CP R 纯化产物
8泌 , l X() x B SA B u fe r o . 2林L ( 如限制性内切酶
b诚 r 需要加 B SA 时 ) , dd H Z o 补足至 20林L , 37℃
( B
s s
S I 和 N e h l )或 65℃ ( ifT l )恒温水浴 16h ,取 5 -
8灿用 2% 琼脂糖凝胶电泳检查酶切结果 ,人工比
较分析 RF LP 带型图谱。
2 结果与分析
2
.
1 rD N A IST 区的 P CR 扩增
利用通用引物 1卫抖 / 5 对毒麦属 6 个近似种的
rD NA IST 区进行 P CR 扩增 ,其产物电泳结果均出
现一条约为 64 7 bp 特异性的扩增带。 6 个种 IST
区长度一致 , 因此不能作为它们的区分标准 。
2
.
2 rD N A IST 区的 RF LP 分析
对 6 种毒麦属种子 CP R 产物克隆测序后 , 其
IST 长度及所选 3 种内切酶的酶切图谱见表 l 。 从
酶切图谱中可以看出 , sB s SI 能将毒麦和亚麻毒麦
与其它 4个种区分 , ifT l能单独区分毒麦和瑞士黑
麦草 , N he l则能将多花黑麦草和瑞士黑麦草与其它
4 个种区别开 。
表 1 6 种毒麦属植物 IST 长度及预期的 3种限制性内切酶酶切位点表
种名 拉丁名 1仆 ( b p ) Bs8S I
毒麦
长芒毒麦
肠 il u m 切侧凌瓜姗 L
肠互“ m et 服凌耐“ m v ar .
肠林g姐们活绍翎 m Pam el
.
肠止i u 刃限 此爪以e时“ 爪 v ar .
a脱 sn e Bab .
肠 il “ m er 林旧扭 m cS hr ar 山 .
肠“ um m以忿沙~ 1刀 n .翻 i。 瘫侧咖 G a u .d
64 7
64 7 3 3 帅
5 6 b p
、
30 1 b p
3 0 1 b P
田毒麦
3 3 b P
亚麻毒麦
多花黑麦草
瑞士黑麦草
3 3 饰
33 b P
3 0 1 b P
3 0 1 b P
3 0 1 b P 18 5 b P
18 5 bP
647
注 : “ 一 ” 表示没有酶切位点 。
6 个毒麦属近似种 P CR 产物经 sB sS I 、 ifT l 和
N e M 酶切后结果与预期酶切结果相一致 。 sB sS I酶
切图谱中 (见图 1 ) ,毒麦和亚麻毒麦在 64 7 b p 有一
条带 ,而长芒毒麦 、 田毒麦 、 多花黑麦草和瑞士黑麦
草在 614 bp 和 10 b p 以下分别有两条谱带 。
在 ifT l 酶切图谱中 ( 见图 2 ) , 毒麦被切割成
34 6 b p
、
2 4 5 b p
、
56 b p 大小的 3 个片段 , 而长芒毒
麦 、 田毒麦 、 亚麻毒麦和多花黑麦草被切割成大小
为 3 0 1 b p 和 34 6 bp 的两条片段 , 由于两条带大小
图 1 每友 偶 6 个秤 l l b 犷 L lt 广 物拴 廿 s s b l
酶切后结果
1
. 毒麦 ; 2 . 长 芒毒麦 ; 3 . 田毒麦 ; 4 . 亚 麻毒麦 ; 5 . 多花黑麦草 ;
6
. 瑞士黑麦草 ;7 . 空白对照 ; M . D N A M akr er D L Z仪旧 ( T ak ax )
20 8 年第2 期 植物检疫 PA LNT Q A U RA N T INE V o l.2 2 N o.2
相近 ,在电泳图上只能看到一条重合的条带 ,瑞士黑
麦草没有酶切位点 ,则只有一条麟 7 b p 大小的带。
7 50 饰
50 饰
2 5 0 bP
10 印
图 2 毒麦属 6 个种 I件 P CR 产物经 ifT l
酶切后结果
1
. 毒麦 ;2 . 长芒毒麦 ;3 . 田毒麦 ; 4 . 亚麻毒麦 ;5 . 多花黑麦草 ;6 .
瑞士黑麦草 ; 7 . 空白对照 ; M . D NA M滋 e r D L 20 0 ( T ak ar )
在 Nhe l 酶切图谱中 (见图 3 ) , 只有多花黑麦
草和瑞士黑麦草被切割成两条 462 bP 和 185 bp 大
小的片段 。
7 5 0 b P
5 0 b P
:器::
图 3 毒麦属 6 个种 ITS P CR 产物经 Nhe l
酶切后结果
1
. 毒麦 ;2 . 长芒毒麦 ;3 . 田毒麦 ;4 . 亚麻毒麦 ; 5 . 多花黑麦草 ; 6 . 瑞
士黑麦草 ;7 . 空白对照 ; M . DN A Makr e r D L 2 0( 旧 ( Tak ar )
3 讨论
现今可应用于物种鉴定的分子生物学技术手
段有很多 , 如 R FL P 、 分子标记技术 ( AF廿 、 RA P D 、
S R 等 ) 、基因组原位杂交技术等。 但这些技术往
往由于操作复杂 、 成本高或其它一些因素 , 限制了
它们的应用范围 。 而 PC R 一 R F廿技术由于其简单
易行 、周期短 、费用低 ,成为实际应用中常选用的物
种鉴定分子生物学手段〔’ } 。
利用对 IST 序列的 PC R 一 RF印 分析进行物种
鉴定已有相关报道 。 Ng an 等冈成功地利用 R FL P
技术对人参属 6 种药用植物和 2 种常见的人参伪
品的 : D N A r s 进行了有效的鉴别。 20 6 年郭琼
霞 〔’ ]等对假高粱和同属近似种进行了 R F LP 分析 。
本实验筛选出的 3 种限制性内切酶为毒麦属物种
鉴定提供了重要依据。 ifT l 内切酶可以鉴定毒麦和
瑞士黑麦草 , sB sS I 和 ifT l 则可以鉴定出亚麻毒麦 ,
N he l 和 ifT l 可以鉴定多花黑麦草 , 而长芒毒麦和田
毒麦这两个毒麦变种 D N A 的 P CR 一 RF廿 分析 ,则
有待于进一步研究 。
参考文献
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中山口岸从法国木质包装上截获散大蜗牛
20 7 年 9 月 19 日 , 中山检验检疫局在从法国进口的蓝湿牛皮的木质包装中截获 1 头活体蜗牛 , 经中
山检验检疫技术中心植检实验室鉴定 ,并经广东检验检疫技术中心复核 , 确认为我国进境植物检疫有害生
物— 散大蜗牛 ( eH l瑞 a sP e sr 。 M u ll e : 一7 7 4 ) 。中山出入境检验检疫局 王章根 管维 陈定虎 张建威
一 7 2 一