全 文 ：ChineseAgriculturalScienceBuletinVol.22No.112006November
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在生物进化过程中，脊椎动物逐渐失去了附属器
官的再生能力。然而鹿茸角作为雄性鹿科动物的一个
附属器官却完全保留了再生能力，雄鹿的茸角一般在
每年春天开始生长，到秋天长成骨化的鹿角，然后自然
脱落或人工割除，第二年春天又长出鹿茸，周而复始。
近几年来，关于鹿茸的再生及生长发育的机理引起了
人们的高度关注。各种哺乳动物骨组织的生长是一个
非常缓慢的过程，而鹿茸组织在快速生长期增殖分化
非常迅速，鹿茸角的生长最快可达每天2cm，超过任何
哺乳动物骨组织的生长速度[1]。因此将鹿茸作为模拟
人和动物软骨内成骨过程的实验模型具有非常重要的
意义。
随着对组织内各型胶原的研究不断深化，型胶原
（colagenX，typeXcolagen，colX）作为一种与钙化有
梅花鹿鹿茸软骨细胞的培养及X型
胶原的克隆和序列分析
冯海华,邓旭明,岳占碰,宋 宇,李乾学,韩学敏,范君文,姜 峰
（吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春130062）
摘 要:型胶原是肥大软骨细胞的标志物,据GenBank中收录的人、鼠、牛、猪型胶原基因的序列,进行
同源性分析,在同源性高的相对保守区域设计了1对特异性引物。建立梅花鹿鹿茸软骨细胞的分离培
养方法,培养鹿茸软骨细胞。提取细胞的总RNA,以总RNA为模板,用RT-PCR方法克隆了梅花鹿的
型胶原基因序列为877的片段,此片段全部位于编码区,与已报道的牛的型胶原基因的序列比较,同源
性达到96%。共有 35个碱基发生变异。DNAStar软件分析表明,二者推导的氨基酸序列同源性为
95.5%。
关键词:梅花鹿;软骨细胞;X型胶原;克隆;序列分析
中图分类号:Q78;S852.65 文献标识码:A
TheCultureofSikaDeerAntlerCartilageCelsandCloningofthecolagenX
fromAntlerCartilage
FengHaihua,DengXuming,YueZhanpeng,SongYu,LiQianxue,HanXuemin,FanJunwen,JiangFeng
(ColegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,JilinUniversity,Changchun130062)
Abstract:ThecolagenXproteinistheclassicalmarkerofhypertrophicchondrocytes.Thehomologywas
analyzedbasedonthereportedcolagenXsequenceofhuman,mouse,cowandpiginGenBank.Apairof
specificprimerswasdesignedintheconservativerelativelysectors.Themethodsofisolationandculture
sikadeerantlerchondrocyteswereestablished.Sikadeerantlerchondrocyteswerecultured,totalRNAwas
extractedfromtheculturedcels.ThesequenceencodingdeerantlercolagenXwasclonedfromthe
cartilagecelsofsikadeerantlerbymeansofthespecificprimerswiththemethodsofRT-PCR.Thecloned
was877bpwithanORF.Thissequenceencoded292aminoacids.Thehomologyofthenucleotide
sequenceofsikadeercolagenXwithcowwas96%,andthehomologyofdeducedaminoacidsbetween
themwas95.5%.
Keywords:TypeXcolagen,Sikadeer,Chondrocyte,Cloning,Sequentialanalysis
基金项目:国家自然科学基金两个基地项目“茸角再生过程中软骨内成骨的分子调控机制”（30270999）；国家自然科学基金项目“IGF-1及其受体在梅花
鹿茸角内的表达及与茸角再生的关系”（30571340）。
第一作者简介:冯海华，女，1970年出生，内蒙古赤峰人，博士研究生，主要从事兽医药理学研究。通信地址：130062吉林省长春市5333号吉林大学畜牧兽
医学院。Tel：0431-7836162，E-mail：fhh70@163.com。
通讯作者:邓旭明，E-mail：xumingdeng@yahoo.com。
收稿日期:2006-06-07，修回日期：2006-09-07。
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中国农学通报 第22卷 第 11期 2006年 11月
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关的因子，越来越引起人们的注意。对X型胶原的研
究可以揭示软骨内成骨的过程。最早在鸡胚胸骨中发
现的X型胶原，是由基质细胞产生的一种分子量为
59kD的糖蛋白。随后的研究证实，不同动物的X型胶
原在结构和功能上具有相似性。随着对X型胶原结构
和生物学功能研究的深入，发现colX在软骨内成骨
过程中起着重要的作用[2~4]。鹿的colX基因序列在国
内外没有报道，笔者研究通过培养梅花鹿鹿茸软骨细
胞，提取总RNA，用RT-PCR方法克隆了编码鹿的col
X的部分序列，为进一步研究其生物学功能奠定了一
定的基础。
1材料与方法
1.1试验动物
两岁龄梅花鹿由农科院吉林省左家特产研究所提
供。
1.2试剂
IMDM(GIBCO)；透明质酸酶，胰蛋白酶，胶原酶
Ⅱ(Sigma)；胎牛血清(四季青)；Trizol（Invitrogen）；反转
录酶（AMV）（Takara）；EXTaq（大连宝生物工程有限
公司）；小量质粒制备试剂盒和DNA胶回收试剂盒
（Omega）；PMD18-T载体（TaKaRa）。
1.3引物
根据已报道的人、鼠、牛、猪colX基因的序列，通
过 NCBI（htp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）的
BLAST进行同源性分析，在同源性高的相对保守区域
设计了1对特异性引物，引物由上海生工生物工程技
术服务有限公司合成。
上游引物:5′-GGGCTTTCCTGGAGAAAAGG-3′
下游引物:5′-GAATCCTGGAATGCCTGGTG-3′
1.4鹿茸软骨细胞的培养
原代培养：采集样品方法参照文献[5]，梅花鹿麻
醉后，切取其顶部的鹿茸角，浸泡于 75%的酒精溶液
20min，取下软骨，移入小瓶中，用d-Hanks液洗3次，
将软骨剪成1~3mm3的小块，依次用 0.1%透明质酸
酶，0.25%胰蛋白酶，0.1%的型胶原酶消化，100μm滤
网过滤，D-Hanks液洗3次，收集细胞，计算细胞总数。
以1×106ml接种培养。
传代培养：原代培养细胞汇合成单层后，用无血清
IMDM洗涤，0.25%的胰蛋白酶消化细胞。收集消化所
得的细胞离心，弃上清液，加完全培养液将细胞重新悬
浮，接种到培养瓶及有盖玻片的6孔培养板。长有细胞
的盖玻片做HE染色，观察细胞的形态。
1.5鹿茸软骨细胞总RNA的提取
取培养瓶中生长良好的单层传代软骨细胞，用
Trizol试剂提总RNA。加入1mlTrizol，移入1.5ml离
心管；再分别用氯仿和异丙醇抽提，最后用75%乙醇
洗涤，真空干燥5~10min；最后将提取的RNA溶于经
0.05%DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的重蒸水，-70℃保
存。
1.6鹿茸软骨细胞colX基因的RT-PCR扩增
以所提取的鹿茸软骨细胞总 RNA为模板，用
AMV合成cDNA第一链 (42℃90min)→第二链合成
(94℃3min)→30个循环(94℃变性30s→62℃退火45s
→72℃延伸1min)→72℃延伸10min→4℃。取5μl反
应产物，以10g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
1.7PCR产物的克隆
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒
回收纯化目的片段，并将纯化产物与载体PMD18-T
连接，转化E.coliDH5α。过夜培养后挑取4个典型的
白色菌落分别接种于 10mlLB培养基中 (含
100μg/ml氨苄青霉素)，37℃振摇过夜培养。以培养物
为模板，用PCR方法对转化克隆进行初步鉴定。
1.8colX序列分析
经PCR鉴定为阳性的克隆，送上海生工生物工程
技术服务有限公司测序。通过NCBI的BLAST对核苷
酸进行同源性分析，再用DNAStar软件对克隆的col
X基因所编码的氨基酸进行序列分析。
2结果
2.1软骨细胞培养
软骨细胞体外接种8~10h，细胞开始贴壁生长，多
呈圆形，随培养时间的延长，悬浮细胞逐渐坏死破碎，
随换液次数增多而被清除。传代细胞与原代相比生长
较慢，传代后，贴壁细胞呈三角形、多边形等多种形态，
常伴有凸起。
2.2colX的克隆
琼脂糖凝胶电泳分析表明，采用RT-PCR及质粒
PCR鉴定均获得大于750bp的目的产物(见图1)。用
XbalI和HindII对重组质粒进行双酶切鉴定，与预期
的PCR产物大小(877bp)相近(见图2)
2.3colX的测序及序列分析
对阳性克隆的 colX序列经测序，该片段长
877bp，位于该基因的阅读框（ORF）内，共编码292个
氨基酸。将其与GenBank中收录的牛的colX序列进
行比较，二者之间有35个位置的核苷酸存在变异，核
苷酸序列的同源性为96% (842/877)。再分别与Gen
Bank中收录猪、人、鼠的colX序列进行比较，核苷酸
序列的同源性依次为87% (767/877)、86%(762/877)、
81%(717/877)。DNAssis软件分析表明，与牛的氨基酸
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序列同源性为95.5%(208/220)。
3讨论
目前有关colX的研究有大量的报道，colX是
一种短链的网状结构的胶原，在胎儿、幼年动物的长骨
的生长板、肋骨及椎骨软骨内成骨过程中，colX可以
在肥大软骨细胞中短暂表达[6]。colX只存在于生长期
软骨的肥大软骨细胞内，由处于有丝分裂后期的肥大
软骨细胞合成并分泌到细胞外，成为该区域细胞外基
质的重要组成部分，通常把X型胶原蛋白作为肥大软
骨细胞的标志物。如果直接从软骨组织提取总RNA，
软骨组织经过液氮作用后很难研磨，笔者实验通过培
养软骨细胞，提取细胞总RNA，RT-PCR扩增出colX
的部分片段，克服了这一困难，同时表明分离培养鹿茸
软骨细胞取材定位合理。
近年来，软骨内成骨的机理研究取得很大进展，
软骨内成骨是骨骼生长过程中的重要步骤。首先间质
层内层细胞快速分裂增殖，并开始分化成前成软骨细
胞。前成软骨细胞然后进一步分化成软骨细胞。早期分
化的软骨细胞发育到一定程度后开始变肥大。肥大后
的软骨细胞向细胞间质分泌colX。X型胶原蛋白分子
的每一条α1（X）链上有15个Ca2+结合位点，他们可
直接与Ca2+结合，促进钙盐沉积。ColX还与基质小泡
协同作用，启动骨化晶核的形成，基质小泡是在软骨的
钙化过程中出现的，是位于细胞外基质内的一种亚细
胞结构。基质小泡上有一些结合蛋白，现已证实的有
aggrecan、annexin、annexin及碱性磷酸酶。这些结合蛋
白可直接结合到colX分子的特异性结合位点，从而
介导胶原分子与基质小泡的吸附反应。colX分子既可
与Ca2+结合，又可被基质小泡吸附，从而介导Ca2+向
基质小泡内快速流入，启动小泡内Ca2+骨化晶核的形
成，从而启动软骨内成骨[7,8]。迄今为止，国内外已经对
多种动物ColX测序，但鹿的colX序列未见报道。笔
者研究利用其它动物的colX序列，做同源性比较，选
择高度保守序列区域，根据这些保守序列设计引物，通
过RT-PCR方法，得到梅花鹿的colX部分序列。将其
与GenBank中收录的牛的colX（X53556）序列进行
比较，该片段位于牛的658~1534位置，同源性达到
96%，共有34个碱基发生变异。再分别与GenBank中
收录的猪、人、鼠的colX序列进行比较，核苷酸序列
的同源性均在80%以上。DNAssis软件分析表明，与牛
的氨基酸序列同源性达到95.5%。因此可利用该序列
片段进行后续实验，为进一步研究colX的生物学功
能奠定了基础。
参考文献
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20103~20109.
（责任编辑：杜 宏）
图2重组质粒酶切鉴定
注：1.2.3.4.重组质粒XbalI&HindII酶切；5.DNA分子质量标准.
图1colXcDNA质粒PCR鉴定
注：1.DNA分子质量标准；2.3.4.5.colXcDNA质粒PCR产物
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
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