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〔2012-12-21 修回〕
(编辑 安冉冉 /曹梦园)
九里香含药血清抗软骨细胞凋亡的机制
吴龙火 温慧玲 李加林 郭小华 (赣南医学院药学院，江西 赣州 341000)
〔摘 要〕 目的 对九里香血清药物化学抗软骨细胞凋亡进行初步研究。方法 建立大鼠骨关节炎(OA)模型，含药血清培养软骨细胞，利用
流式细胞仪检测其凋亡，建立中药九里香的指纹图谱、血清指纹图谱等方法，利用柱层析从原药材中分离鉴定主要成分。结果 分离培养软骨细胞，
九里香含药血清可显著抑制 OA软骨细胞的凋亡情况。在大鼠血清中存在 16 个入血成分，其中 6 个为九里香的原型成分，10 个可能为原型成分的
代谢产物。分离鉴定两个主要成分九里香酮和 phebalosin，分别与血清中色谱峰 9 和 11 的相对保留时间基本一致。结论 九里香含药血清具有抗
OA软骨细胞凋亡作用，入血成分或移行成分可能成为九里香在体内的直接作用物质。
〔关键词〕 九里香;骨关节炎;软骨细胞
〔中图分类号〕 Ｒ28 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202(2014)17-4869-03;doi:10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2014. 17. 073
Anti-chondrocyte apoptosis of serum pharmacochemistry of Murraya exotica
WU Long-Huo，WEN Hui-Ling，LI Jia-Lin，et al．
Pharmacy College in Gannan Medical University，Ganzhou 341000，Jiangxi，China
【Abstract】 Objective To study anti-chondrocyte apoptosis of the serum pharmacochemistry of Murraya exotica．Methods Ｒat OA
models were eatablished，chondrocyte cells were separated and cultured，the apoptotic rate of chondrocyte was tested by flow cytometer． Tra-
ditional Chinese Medicine fingerprint and serum fingerprint of M． Exotica were established，main constituents of M． Exotica was isolated and
identified． Ｒesults The serum pharmacochemistry significantly decreased the apoptotic rate of OA chondrocyte． 16 constituents were found
in the rat serum，of which，6 compounds were original from M． exotica，10 might be the metabolites of the original constituents． Murrayone
and phebalosin were identified as the two major compounds of M． exotica，which exhibited the same relative retention time as those in the se-
rum． Conclusions The serum pharmacochemistry of M． exotica exhibits the activity of anti-chondrocyte apoptosis． The original constituents
or the metabolites might be the compounds that are responsible for the biological activity of M． exotica directly． Further isolation and identifi-
cation of the active compounds could better explain the therapeutic basis matters of M． exotica．
【Key words】 Murraya exotica;Osteoarthritis;Chondrocyte
基金项目:国家自然科学青年基金(No. 81102797);江西省教育厅科技
项目 (GJJ13669);赣 南 医 学 院 人 才 引 进 启 动 基 金
(No. 201102)
第一作者:吴龙火(1980-)，男，博士，副教授，主要从事天然产物活性成
分研究。
软骨细胞发生过度凋亡是骨关节炎(OA)发病机制之一，
但关于其分子调控机制还不是很清楚。九里香为芸香科植物
九里香的干燥叶和带叶嫩枝，具有行气止痛、活血散瘀、祛风除
湿、麻醉镇惊等功效〔1，2〕。现代药理学研究表明，九里香具有抗
生育和终止妊娠、抗菌、抗甲状腺肿大、降血糖、麻醉镇静及增
强免疫功能等作用〔3〕。近年来有关九里香的实验研究较多，但
大多集中在化学成分等研究方面〔4 ～ 6〕。中药发挥药效学活性
的物质基础，可能是中药提取物中的原型成分，也可能是代谢
产物，而只有被吸收入血的化学成分才可能是真正发挥药效的
活性物质。
本课题组前期研究表明，九里香叶醇提物具有显著的抗炎
镇痛活性，具有防治 OA作用〔7〕。在中国药典 2010 年版中，只
记载有九里香的显微鉴别和理化鉴别〔8〕。目前，九里香药材的
特征图谱尚未见报道，九里香中发挥抗炎镇痛活性的主要物质
基础研究也较少。因此，本课题利用含药血清培养 OA 软骨细
胞，分析其抗凋亡情况。
1 材料与方法
1. 1 材料 Agilent1100 高效液相色谱仪(DAD 检测器，美国
Agilent公司);Sartorius BS214-D(北京赛多利斯系统有限公
司);AE240 天平(十万分之一);XW-80A 漩涡混合器(上海医
科大学仪器厂);TGL-16G高速离心机(上海手术器械厂)。
乙腈为色谱纯(TEDIA);水为娃哈哈纯净水;其他试剂均
为分析纯试剂。九里香药材采自福建漳州，经赣南医学院药学
院李加林老师鉴定为九里香的干燥叶和带叶嫩枝。Wistar 大
鼠，雌雄各半，(200 ± 20)g，均由赣州市实验动物中心提供，合
·9684·吴龙火等 九里香含药血清抗软骨细胞凋亡的机制 第 17 期
格证号:SCXK(赣)2008-0002。
1. 2 方法
1. 2. 1 样品的制备
1. 2. 1. 1 九里香浸膏样品的制备 精密称取九里香(粉碎，过
100 目筛)粉末约 500 g，放入锥形瓶中，加入 75% 乙醇
5 000 ml，回流提取 2 h，浓缩至浸膏 85. 3 g。取浸膏 8. 5 g，加
甲醇溶解定容至 100 ml，过 0. 45 μm 微孔滤膜过滤即得，以备
建立指纹图谱所用。
1. 2. 1. 2 含药血清样品的制备 称取九里香浸膏，溶于 2%
吐温-80 溶液，配制成剂量 100 mg /kg给予大鼠灌胃。取 Wistar
大鼠(20 只)，禁食 12 h(自由饮水)，按照 100 mg /kg 剂量(中
国药典 2010 版推荐剂量)灌胃 7 d，第八天灌胃后 1 h，经腹主
动脉取血 5 ml，静置分离血清，以备培养软骨细胞所用。取新
鲜含药血清 5 ml，加入乙酸乙酯 30 ml 萃取 3 次，合并萃取液，
蒸干，甲醇定容至 200 μl，0. 45 μm 微孔滤膜滤过，以备 HPLC
检测。
1. 2. 1. 3 空白血清样品的制备 取 Wistar大鼠(20 只)，禁食
12 h(自由饮水)，按照 1. 2. 1. 2 项给予等体积的 2%吐温-80 溶
液灌胃 7 d，第 8 天灌胃后 1 h，经腹主动脉取血 5 ml，静置分离
血清，以备培养软骨细胞所用。取新鲜含药血清 5 ml，加入乙
酸乙酯 30 ml萃取三次，合并萃取液，蒸干，甲醇定容至 200 μl，
0. 45 μm微孔滤膜滤过，以备 HPLC检测。
1. 2. 2 大鼠 OA模型的建立及 OA 软骨细胞的培养 每组 6
只大鼠适应性饲养 1 w后，参照文献〔5〕复制大鼠实验性 OA 模
型。常规消毒，以 3%戊巴比妥 30 mg /kg 腹腔注射麻醉后，仰
卧于手术台上，在无菌条件下在右膝关节内侧纵行切开约
2 cm，逐层分离，将膑骨向后向外翻，最大限度屈曲膝关节，显
露膝关节腔。用显微器械切断前交叉韧带、内侧负韧带，完整
切除内侧半月板后，逐层缝合伤口，分笼饲养，允许自由活动。
术后给予青霉素 10 万 U肌肉注射抗炎，连续 5 d。
术后正常饲养 8 w，对其膝关节部分进行光学检查。利用
Ⅱ型胶原酶法配合胰蛋白酶进行消化分离，得到正常组及 OA
组大鼠膝关节软骨细胞后，分别用空白血清及含药血清进行培
养，利用流式细胞仪进行凋亡检测。
1. 2. 3 色谱条件 色谱柱为迪马 AgilentC18(150 mm ×
4. 6 mm，5 μm);流动相为乙腈和水梯度洗脱系统;检测波长为
337 nm;柱温为 25 ℃;流速为 1. 0 ml /min;进样量为 20 μl。考
察不同梯度下色谱峰的分离度以及峰的数目。最后确定梯度
洗脱程序为:0 ～ 5 min，5% 乙腈;5 ～ 7 min，18% 乙腈;
7 ～ 12 min，18%乙腈;12 ～22 min，24%乙腈;22 ～30 min，24%
乙腈;30 ～ 35 min，35% 乙腈;35 ～ 45 min，35% 乙腈;45 ～
50 min，50%乙腈;50 ～ 60 min，50%乙腈;60 ～ 80 min，100%
乙腈。
1. 2. 4 人血成分的初步研究 进一步从原药材中制备分离纯
化及进行结构鉴定，通过红外、紫外、质谱和1HNMＲ 和13 CNMＲ
进行表证。通过与血清学 HPLC进行相对保留时间的比较。
2 结 果
2. 1 九里香含药血清的抗凋亡试验 成功构建大鼠 OA 模
型。利用甲苯胺蓝试剂对软骨细胞进行鉴定(图 1)。流式细
胞仪检测发现，正常组的凋亡率为 9. 43%，OA模型未治疗组的
凋亡率为 37. 15%，九里香含药血清组的软骨细胞凋亡率为
15. 24%，说明九里香含药血清大大降低了软骨细胞的凋亡
情况。
2. 2 各供试样品的 HPLC 指纹图谱的建立 图 2 可见，通过
对 HPLC色谱峰的对比，发现九里香含药血清中有效成分达 16
种或以上，其中大多数为代谢成分;色谱峰 1、3、4、7、9、11 与九
里香供试液 HPLC对照图谱对应，为原型成分，色谱峰 2、5、6、
图 1 软骨细胞凋亡的流式细胞图
图 2 各供试样品的 HPLC指纹图谱
·0784· 中国老年学杂志 2014 年 9 月第 34 卷
8、10、12、13、14、15、16 在对照图谱中未出现，推测可能均为代
谢产物。
2. 3 主要成分的结构鉴定 分离得到的化合物 A:白色粉末
(乙醇-水)，mp:195℃ ～197℃，C19H18 O6，紫外线下显亮黄色荧
光，盐酸镁粉反应阳性，显淡紫红色。UV λmax(nm):212，337。
IＲ ν (cm-1):3 401，1 647，1 605，1 516。EI-MS m/z:343
〔M〕+。1H NMＲ(500 M Hz，CDCl3):δ7. 49(
1H，dd，J = 9. 0，1.
8Hz，6’-H)，7. 26(1H，d，J = 1. 8 Hz，2’-H)，6. 92(1H，d，J = 9. 0
Hz，5’-H)，6. 54(1H，s，3-H)，6. 56(1H，d，J = 2. 4 Hz，8-H)，
6. 34(1H，d，J = 2. 4 Hz，6-H)，3. 96(6H，brs，3’-OMe)，3. 95
(3H，s，4’-OMe)，3. 94(3H，s，5-OMe)，3. 90(3H，s，7-OMe)。13 C
NMＲ(100 mHz，CDCl3):δ177. 3(C-4)，164. 8(C-7)，161. 2(C-
2)，160. 8(C-5)，159. 9(C-9)，152. 4(C-4’)，148. 6(C-3’)，
125. 2(C-1’)，119. 7(C-6’)，112. 1(C-5’)，110. 3(C-10)，
108. 9(C-2’)，106. 7(C-3)，97. 3(C-6)，93. 4(C-8)，57. 1(OMe-
4’)，56. 8(OMe -5)，55. 9(OMe -3’)，55. 2(OMe -7)。结合以
上数据分析，与文献〔9〕基本一致，故确定该化合物为九里香酮。
分离得到的化合物 B:白色粉末(乙醇 － 水)，mp:118℃ ～
120℃，C15H14O4。异羟肟酸铁反应阳性，紫外灯(365 nm)下
呈蓝色荧光。UV λmax(nm):246，258，322。IＲ ν (cm-1):2
964，1 713，1 608，1 498。EI-MS m/z:258〔M〕+。1H NMＲ(500
mHz，CDCl3):δ7. 63(1H，d，J = 10 Hz，4-H)，7. 42(1H，d，J = 8. 5
Hz，5-H)，6. 89(1H，d，J = 8. 7 Hz，6-H)，6. 26(1H，d，J = 10 Hz，
3-H)，5. 2(1H，s，4’-H)，5. 08(1H，s，4’-H)，3. 99(1H，d，J =
2. 0 Hz，1’-H)，3. 97(3H，s，OMe)，3. 92(1H，d，J = 2. 0 Hz，2’-
H)，1. 87 (3H，s，5’-CH3)。13C NMＲ(100 mHz，CDCl3):
δ162. 2(C-2)，160. 6(C-7)，154. 1(C-10)，143. 6(C-3’)，141. 6
(C-4)，129. 2(C-5)，113. 7(C-8)，113. 1(C-3)，112. 8(C-9)，
107. 9(C-4’)，60. 9(C-2’)，56. 6(C-6’)，52. 1(C-1’)，17. 7
(C-5’)。结合以上数据分析，与文献〔10〕基本一致，故确定该化
合物为脱水长叶九里香内酯(Phebalosin)。
九里香叶中分离得到的主要成分九里香酮和 phebalosin的
HPLC色谱图分别对应九里香供试液 HPLC对照图谱中的色谱
峰 9 和 11，其保留时间分别为 40. 277 min 和 47. 585 min。见
图 2。
3 讨 论
本课题组的前期研究结果表明〔7〕，以 75%乙醇回流提取
2 h的方法最佳。对不同流动相系统及不同检测波长的考察结果
表明，本试验在 337 nm的检测波长下，以乙腈-水系统梯度洗脱，样
品的大部分色谱峰基本分离。同时，对各供试液的稳定性、仪器的
精密度和测定方法的重复性进行了考察，均符合相关要求。
中药血清药物化学这种方法是建立在“只有入血成分才可
能是药效成分”的假说基础之上的〔11〕，主要是通过分析给药后
存在于血清中的成分，确定中药在动物体内的直接作用物质基
础;但它们也存在一些局限性〔12〕，如很难确定血清中检测到的
所谓“成分”是非活性成分还是活性成分的代谢产物，这些为分
离带来困难，也为空间结构鉴定带来困难。小分子化合物在血
清中的存在方式可能是游离的，也可能是与转运蛋白结合。在
处理血清样品时，考虑到处理方法对色谱峰的干扰影响〔13〕，本
试验采用直接加入乙酸乙酯进行多次萃取，合并有机相，干燥、
蒸干、甲醇定容，以便获得更多的信息。
九里香叶中的主要有效成分为黄酮类和香豆素类化合物。
这两大类化学结构上的酚羟基大部分被醚化，总体极性属于适
中范围〔14〕，大部分化合物的保留时间在 20 ～ 60 min。
本实验发现九里香血清药物化学对 OA 软骨细胞有明显
的抗凋亡作用。为进一步研究血清药物化学的成分，我们利用
HPLC进行中药图谱和血清图谱的比对，分析血清中可能的化
学成分变化。利用硅胶柱层析及半制备 HPLC 进行跟踪导向
分离得到两个化合物，其相对保留时间与图谱中色谱峰 9 和 11
基本一致。但色谱峰 9 和 11 与中药中分离得到的化合物的相
对保留时间一致并不能直接说明就是同一个化合物，需要进一
步借用其他相关手段(如 LC-MS 等)进行鉴定。另外，对于其
中特征峰的研究也有待进一步系统化，从整体上把握中药内
“有效组分群”协同作用的特性〔15〕。
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(编辑 曲 莉)
·1784·吴龙火等 九里香含药血清抗软骨细胞凋亡的机制 第 17 期