全 文 ：第４４卷　第５期 陕西师范大学学报（自然科学版） Ｖｏｌ．４４　Ｎｏ．５
　２０１６年９月 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｈａａｎｘｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｓｅｐ．，２０１６　
文章编号：１６７２－４２９１（２０１６）０５－００８９－０５　 ｄｏｉ：１０．１５９８３／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｓｎｕ．２０１６．０５．３５５
收稿日期：２０１６－０１－０６
基金项目：国家自然科学基金（８１２０２９５７）；陕西省自然科学基金（２０１４ＪＱ４１４４）
　＊通信作者：王筱冰，女，副教授，博士。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｘｉａｏｂｉｎｇ＠ｓｎｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
大金发藓乙酸乙酯提取物对Ｋ５６２细胞
膜的损伤效应
郭　玲１，雷成康２，袁文娟１，汤　薇３，
王　攀１，刘怡琳１，王筱冰１＊
（１陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安７１０１１９；２西安市食品药品检验所，陕西 西安７１００５４；
３陕西师范大学 化学化工学院，陕西 西安７１０１１９）
摘　要：为了探讨大金发藓乙酸乙酯提取物（ＰＣ－ＥＥＦ）对Ｋ５６２细胞的膜损伤效应，应用 ＭＴＴ法检测
ＰＣ－ＥＥＦ对多种肿瘤细胞的细胞毒活性，台盼蓝拒染实验检测细胞存活力，相差显微镜观察Ｋ５６２细
胞形态的变化，ＦＤＡ－ＰＩ双染检测细胞膜通透性变化，ＤｉＢＡＣ４（３）染色检测细胞膜电位变化，Ｈｏｅｃｈｓｔ
３３３４２－ＰＩ双染进一步验证细胞死亡的发生。研究结果显示：ＰＣ－ＥＥＦ能显著地杀伤多种肿瘤细胞，其
中对Ｋ５６２细胞最为敏感，ＰＣ－ＥＥＦ以时间和剂量依赖性的方式降低Ｋ５６２细胞存活力。ＰＣ－ＥＥＦ可诱
导Ｋ５６２细胞发生显著膜损伤效应，表现为膜形态改变、膜通透性增加和膜电位下降。
关键词：大金发藓；乙酸乙酯组分；Ｋ５６２细胞；细胞毒活性；膜损伤效应
中图分类号：Ｒ２８５．５；Ｒ７３－３　文献标志码：Ａ
Ｄａｍａｇｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｔｈｙｌ　ａｃｅｔａｔｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｔｒｉｃｈｕｍ　ｃｏｍｍｕｎｅ
ｏｎ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｋ５６２ｃｅｌ
ＧＵＯ　Ｌｉｎｇ１，ＬＥＩ　Ｃｈｅｎｇｋａｎｇ２，ＹＵＡＮ　Ｗｅｎｊｕａｎ１，ＴＡＮＧ　Ｗｅｉ　３，
ＷＡＮＧ　Ｐａｎ１，ＬＩＵ　Ｙｉｌｉｎ１，ＷＡＮＧ　Ｘｉａｏｂｉｎｇ１＊
（１Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａａｎｘｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ′ａｎ　７１０１１９，Ｓｈａａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ；
２Ｘｉ′ａｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｘｉ′ａｎ　７１００５４，Ｓｈａａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ；
３Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｘｉ′ａｎ　７１０１１９，Ｓｈａａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｔｈｙｌ　ａｃｃｔａｔｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｔｒｉｃｈｕｍ　ｃｏｍｍｕｎｅ　Ｌ．ｅｘ　Ｈｅｄｗ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｏｆ
ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｋ５６２ｃｅｌ　ｗａｓ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．ＭＴＴ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ＰＣ－ＥＥＦ
ｏｎ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｓ．Ｔｒｙｐａｎ　ｂｌｕｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ｔｅｓｔ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ａｄｏｐｔｅｄ　ｔｏ　ａｓｓｅｓｓ　ｔｈｅ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ．
Ｃｅｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｗｅｒｅ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｕｎｄｅｒ　ｐｈａｓｅ－ｃｏｎｔｒａｓｔ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｎ　ｐｌａｓｍａ
ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ　ａｎｄ　ｃｅｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ＦＤＡ－ＰＩ　ｄｏｕｂｌｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｄｙｅ
ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　ＤｉＢＡＣ４（３）ｓｔａｉｎｉｎｇ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２－ＰＩ　ｄｏｕｂｌｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｔｈｅ
ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｃｅｌ　ｄｅａｔｈ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＰＣ－ＥＥＦ　ｃｏｕｌｄ　ｅｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｄａｍａｇｅ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｓ　ａｎｄ
Ｋ５６２ｃｅｌ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ａｆｅｃｔｅｄ　ｏｎｅ．ＰＣ－ＥＥＦ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　Ｋ５６２ｃｅｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ａ　ｄｏｓｅ－ａｎｄ　ｔｉｍｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ｍａｎｎｅｒ．ＰＣ－ＥＥＦ　ｅｘｅｒｔｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｃｅｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｄａｍａｇｅ　ｅｆｅｃｔｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｃｅｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ
ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ　ｌｏｓｓ　ａｎｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｏｌｙｔｒｉｃｈｕｍ　ｃｏｍｍｕｎｅ　Ｌ．ｅｘ　Ｈｅｄｗ；ｅｔｈｙｌ　ａｃｅｔａｔｅ　ｅｘｔｒａｃｔ；Ｋ５６２ｃｅｌ；ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ
ａｃｔｉｖｉｔｙ；ｃｅｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｄａｍａｇｅ　ｅｆｆｅｃｔ
９０　 陕西师范大学学报（自然科学版） 第４４卷
　　大金发藓（Ｐｏｌｙｔｒｉｃｈｕｍ　ｃｏｍｍｕｎｅ　Ｌ．ｅｘ　Ｈｅｄｗ）
又名独根草、土马鬃、小松柏等，多生于林下湿地［１］，
为藓纲（Ｍｕｓｃｉ）金发藓科（Ｐｏｌｙｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）金发藓属
（Ｐｏｌｙｔｒｉｃｈｕｍ）植物。全草入药，味甘，性凉，主治久
热不退、肺病咳嗽、跌打损伤等［２］，其对高夫克氏球
菌、金色葡萄菌、肺炎球菌、结核杆菌具有抗性，且对
淋巴细胞白血病等癌症有一定抑制作用［３－４］。近年
来，有研究表明大金发藓有一定的抗癌活性［５－７］，其
乙酸乙酯组分（ＰＣ－ＥＥＦ）抗癌效果最为显著［６－７］，但
是具体的作用机制尚不明确。因此，本文深入研究
了ＰＣ－ＥＥＦ的抗肿瘤作用及其相关机制，以期为金
发藓属植物药用价值的开发应用提供一定理论
依据。
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　细胞培养　人慢性髓系白血病 Ｋ５６２细胞
和人急性单核白血病Ｕ９３７细胞由中国北京协和医
科大学引进；人急性髓系白血病 ＨＬ－６０细胞、人食
管癌ＥＣＡ１０９细胞、人结直肠癌ＳＷ４８０细胞、人结
直肠癌ＳＷ６２０细胞和人乳腺癌 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细
胞均由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中
心引进，本室传代保种。
Ｋ５６２、Ｕ９３７、ＨＬ－６０、ＥＣＡ１０９和ＳＷ４８０培养
于含１０％新生牛血清、１００Ｕ／ｍＬ青霉素、１００μｇ／
ｍＬ链霉素、１ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｌ－谷氨酰胺的 ＲＰＭＩ　１６４０
完全培养基中；ＭＤＡ－ＭＢ－２３１培养于ＤＭＥＭ 培养
基中；ＳＷ６２０培养于Ｌ－１５培养基中。上述细胞均
在５％的ＣＯ２、３７℃培养箱及饱和水蒸气条件下常
规培养及传代，实验用细胞为对数生长期细胞。
１．１．２　大金发藓乙酸乙酯组分制备　大金发藓新
鲜植株采自陕西秦岭南麓平河梁（海拔２　３０５ｍ，
３°２７′Ｎ，１０８°３０′Ｅ），经陕西师范大学肖亚萍教授鉴
定。大金发藓醇提物采用传统的溶剂浸提法结合超
声促提技术提取，然后依次采用石油醚、氯仿、乙酸
乙酯溶剂对醇提物进行分级萃取。将获得的ＰＣ－
ＥＥＦ溶解在７０％的乙醇中，上清液经０．２２μｍ滤膜
过滤后用于后续研究。
１．１．３　试剂与仪器　ＲＰＭＩ－１６４０和Ｌ－谷氨酰胺购
自Ｓｉｇｍａ公司；ＤＭＥＭ 和Ｌ－１５购自Ｇｉｂｃｏ公司；新
生牛血清（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司），青、链霉素
（Ｈｙｃｌｏｎｅ公司），二甲基亚砜 （ＤＭＳＯ）、噻唑蓝
（ＭＴＴ）、碘化丙啶（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ）、二乙酸
荧光素（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉａｃｅｔａｔｅ，ＦＤＡ）、Ｂｉｓ－（１，３－
ｄｉｂｕｔｙｌｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ　ａｃｉｄ）ｔｒｉｍｅｔｈｉｎｅ　ｏｘｏｎｏｌ［ＤｉＢＡＣ４
（３）］和 Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２均为Ｓｉｇｍａ公司产品。
１．２　实验方法
１．２．１　细胞毒性分析　ＰＣ－ＥＥＦ作用于肿瘤细胞
的细胞毒效应采用 ＭＴＴ法进行分析［８］。取对数生
长期细胞以１×１０５个／ｍＬ（ＥＣＡ１０９和 ＭＤＡ－ＭＢ－
２３１细胞密度为５×１０４个／ｍＬ）接种于９６孔板中，
加入不同剂量的ＰＣ－ＥＥＦ或７０％乙醇（ＥｔＯＨ）药物
处理。将接种后的培养板置于３７°Ｃ、５％ ＣＯ２饱和
湿度孵箱内培养不同时间，避光条件下每孔加入２０
μＬ　ＭＴＴ母液（２．５ｍｇ／ｍＬ），继续培养４ｈ后，每孔
加入１００μＬ三联液，３７℃孵育１７ｈ，酶标仪检测
５７０ｎｍ处光吸收值（ＯＤ值），计算各组细胞存活
率：细胞存活率（％）＝实验组 ＯＤ／对照组 ＯＤ×
１００％。半数抑制浓度（ＩＣ５０）为细胞存活率降为
５０％时的药物浓度，釆用Ｌｏｇｉｔ法计算。
１．２．２　细胞存活力检测　Ｋ５６２细胞以１×１０５个／
ｍＬ接种于２４孔板中，给予不同剂量的ＰＣ－ＥＥＦ（０、
６、１２和１８μｇ／ｍＬ）分别处理２４、４８和７２ｈ。细胞
存活力由台盼蓝拒染实验决定，死、活细胞数在光学
显微镜下统计。细胞存活率（％）＝未染色细胞数／
总细胞数×１００％。
１．２．３　细胞形态观察　Ｋ５６２细胞以１×１０５个／
ｍＬ的密度接种于２４孔板中，给予不同剂量的ＰＣ－
ＥＥＦ（０、６、１２和１８μｇ／ｍＬ）分别孵育２、４和２４ｈ，
置于相差显微镜下观察细胞形态的变化。
１．２．４　细胞膜通透性分析　ＰＩ是一种膜非透性荧
光染料，可对ＤＮＡ染色，在嵌入双链ＤＮＡ后发出
红色荧光。ＰＩ可以穿过破损的细胞膜而对核染色，
因此ＰＩ常用来检测细胞膜通透性［９］。ＦＤＡ自身没
有荧光，可进入活细胞被非特异性酯酶水解而产生
绿色荧光，当细胞完整性破坏时，ＦＤＡ荧光会下降。
在本研究中，通过应用这两种荧光染料结合流式细
胞仪检测ＰＣ－ＥＥＦ诱导的Ｋ５６２膜完整性变化。各
实验组细胞在处理后分别加入４μｇ／ｍＬ　ＰＩ和２
μｇ／ｍＬ　ＦＤＡ，室温反应５ｍｉｎ，然后用流式细胞仪检
测实验结果。
１．２．５　细胞膜电位测定　ＤｉＢＡＣ４（３）是一种细胞
膜电位敏感的亲脂性荧光染料，它本身没有荧光，当
进入细胞与胞浆内蛋白质结合后才发出荧光。细胞
去极化时会导致ＤｉＢＡＣ４（３）进入细胞量增多，从而
使细胞内荧光强度随之增加；反之，细胞超极化即膜
电位绝对值增加会引起胞内荧光强度降低［１０］。ＰＣ－
ＥＥＦ处理后２４ｈ，收集各组细胞，加入终浓度为５
μｍｏｌ／Ｌ的ＤｉＢＡＣ４（３），然后用流式细胞仪检测实
验结果。
１．２．６　Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２－ＰＩ双染实验　细胞核凝集
和核片段化与细胞死亡相关，可通过 Ｈｏｅｃｈｓｔ
３３３４２染色反映，而ＰＩ可进入膜损伤细胞而不被活
细胞摄取。因此 Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２－ＰＩ双染实验可进
一步证明细胞死亡的发生［１１］。ＰＣ－ＥＥＦ处理２４ｈ
后，收集各组细胞，ＰＢＳ清洗，分别加入５μｍｏｌ／Ｌ
　　第５期 　　郭玲 等：大金发藓乙酸乙酯提取物对Ｋ５６２细胞膜的损伤效应 ９１　
Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２和５μｇ／ｍＬ　ＰＩ，３７℃避光染色１５
ｍｉｎ，然后在荧光显微镜下观察、拍照。
１．２．７　数据分析　实验结果均表示为平均值±标
准差，利用ＳＰＳＳ软件对实验数据进行统计学分析，
采用单因素方差分析进行显著性检验，多重比较采
用ＬＳＤ法。
２　结果与分析
２．１　ＰＣ－ＥＥＦ对多种肿瘤细胞的细胞毒效应
图１为 ＭＴＴ检测ＰＣ－ＥＥＦ对多种肿瘤细胞毒作
用的实验结果，以４８ｈ的ＩＣ５０值表征。从图中可以看
出，ＰＣ－ＥＥＦ可以选择性地杀伤多种肿瘤细胞，其中以
Ｋ５６２细胞最为敏感，其ＩＣ５０值为８．５０７±０．０５μｇ／ｍＬ，
因此选择Ｋ５６２细胞用于后续实验研究。
图１　ＰＣ－ＥＥＦ对多种肿瘤细胞的细胞毒效应
Ｆｉｇ．１　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＰＣ－ＥＥＦ　ｏｎ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｓ．
注：相同作用条件下，不同细胞系间相比＊＊Ｐ＜
０．０１；ｎ＝４。
为进一步研究ＰＣ－ＥＥＦ对Ｋ５６２细胞的损伤效
应，用台盼蓝拒染实验检测了ＰＣ－ＥＥＦ处理２４、４８
和７２ｈ后Ｋ５６２细胞存活力的变化。从图２可以看
出，ＰＣ－ＥＥＦ抑制Ｋ５６２细胞存活依赖于ＰＣ－ＥＥＦ浓
度及作用时间。
２．２　相差显微镜观察Ｋ５６２细胞形态
相差显微镜观察不同剂量ＰＣ－ＥＥＦ处理 Ｋ５６２
细胞２４ｈ后细胞形态的变化情况，从图３可以看
出，对照组细胞大多数呈圆形或椭圆形，胞质分布均
匀；低剂量处理组与对照组细胞相比，差异不明显；
１２μｇ／ｍＬ　ＰＣ－ＥＥＦ处理后，细胞出现明显地形变，
且随着孵育时间的延长，膜损伤效应也随之增强。
当剂量增加到１８μｇ／ｍＬ后，损伤效应更为显著。
此外，ＰＣ－ＥＥＦ处理后，细胞数目也出现时间和剂量
依赖性的减少。
图２　ＰＣ－ＥＥＦ对Ｋ５６２细胞存活力的影响
Ｆｉｇ．２　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＰＣ－ＥＥＦ　ｏｎ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ
注：相同作用时间下，与对照组相比＊＊Ｐ＜０．０１；
ｎ＝６。
图３　ＰＣ－ＥＥＦ对Ｋ５６２细胞形态的影响
Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＰＣ－ＥＥＦ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｋ５６２ｃｅｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ
２．３　ＰＣ－ＥＥＦ诱导Ｋ５６２细胞膜完整性下降
不同剂量ＰＣ－ＥＥＦ与 Ｋ５６２细胞共孵育２４ｈ
后，采用ＦＤＡ－ＰＩ双染检测细胞膜完整性。从图４
可以看出ＰＣ－ＥＥＦ以剂量依赖的方式诱导Ｋ５６２膜
完整性下降。与对照组（２．４５％±０．０２％）相比，６
μｇ／ｍＬ　ＰＣ－ＥＥＦ处理组与对照组细胞相比，无显著
性差异（２．２０％±０．０２％）。当ＰＣ－ＥＥＦ剂量达到
１２和１８μｇ／ｍＬ时，膜损伤细胞所占比例分别为
２４．３０％±０．１８％和７５．７５％±０．５３％。
图４　ＰＣ－ＥＥＦ对Ｋ５６２细胞膜完整性的影响
Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＰＣ－ＥＥＦ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃｅｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ　ｏｆ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ
９２　 陕西师范大学学报（自然科学版） 第４４卷
２．４　ＰＣ－ＥＥＦ诱导Ｋ５６２细胞膜去极化
不同剂量ＰＣ－ＥＥＦ处理２４ｈ后，Ｋ５６２细胞膜呈现
剂量依赖性的膜去极化现象。从图５可以看出，与对
照组（６．５３％±０．０５％）相比，随着药物剂量的升高（６～
１８μｇ／ｍＬ），膜去极化细胞所占百分比增加到２２．３７％
±０．１８％、３１．５３％±０．２６％和４０．３８％±０．３３％。
图５　ＰＣ－ＥＥＦ对Ｋ５６２细胞膜电位的影响
Ｆｉｇ．５　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＰＣ－ＥＥＦ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃｅｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ　ｏｆ　Ｋ５６２ｃｅｌｓ
２．５　ＰＣ－ＥＥＦ诱导Ｋ５６２细胞死亡
为进一步探讨 ＰＣ－ＥＥＦ对 Ｋ５６２细胞的损
伤效应，采用 Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２－ＰＩ双染实验研究
细胞死亡的发生。从图６可以看出，对照组和
低剂量处理组细胞发出微弱的 Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２
蓝色荧光，基本无 ＰＩ红色荧光。当 ＰＣ－ＥＥＦ剂
量增加到１２μｇ／ｍＬ时，部分细胞出现核凝集现
象，表现为核亮染，个别细胞出现红色荧光。当
ＰＣ－ＥＥＦ浓度增加到１８μｇ／ｍＬ时，细胞同时表
现出 Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２和 ＰＩ亮染现象，说明 ＰＣ－
ＥＥＦ对 Ｋ５６２细胞杀伤作用随 ＰＣ－ＥＥＦ浓度增
加而进一步加强。
图６　ＰＣ－ＥＥＦ处理２４ｈ后诱导Ｋ５６２细胞死亡的发生
Ｆｉｇ．６　ＰＣ－ＥＥＦ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｄｅａｔｈ　ｏｆ　Ｋ５６２ｃｅｌ　ａｆｔｅｒ　２４ｈａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ
３　讨论
大金发藓作为典型的药用苔藓植物，被历代药
典所收录。近代研究表明大金发藓含有多种生物活
性物质，具有良好的抗癌功效［３，５－７］，且其乙酸乙酯
组分抗癌活性最为显著，但其抗癌的生物学机制仍
不清楚。因此，本研究以大金发藓乙酸乙酯组分
（ＰＣ－ＥＥＦ）为实验材料，研究其抗癌活性并探讨其
抗癌的作用机制。
研究发现，ＰＣ－ＥＥＦ能显著地杀伤多种肿瘤细
胞，表现出抗癌的广谱性，其中对白血病Ｋ５６２细胞
最为明显。进一步的研究结果显示ＰＣ－ＥＥＦ能以时
间和剂量依赖地方式诱导 Ｋ５６２细胞存活力下降。
同时，相差显微镜观察到 Ｋ５６２细胞在ＰＣ－ＥＥＦ处
理后细胞形态发生明显改变、细胞数量减少。
细胞膜作为细胞与外界发生物质交换的重要场
所，其在抵御外界刺激防止细胞损伤方面发挥重要
的作用；同时，细胞膜也是药物杀伤肿瘤细胞的关键
靶点之一［１２］。细胞膜的完整性是细胞执行正常功
能的基础，药物的细胞毒效应与膜结构的改变密切
相关［１３］。研究中利用ＦＤＡ－ＰＩ双染实验检测了ＰＣ－
ＥＥＦ处理后细胞膜的完整性，结果证明随着 ＰＣ－
ＥＥＦ浓度的增加，Ｋ５６２细胞膜完整性逐渐下降，其
变化趋势与台盼蓝拒染结果一致。
细胞膜电位的维持依赖于膜的完整性，任何膜
分子结构的改变都会影响细胞膜电位，进而调节细
　　第５期 　　郭玲 等：大金发藓乙酸乙酯提取物对Ｋ５６２细胞膜的损伤效应 ９３　
胞内相关蛋白分子表达变化，影响细胞功能的发挥。
细胞膜电位的扰乱也是诱发细胞死亡的重要信号之
一［１４］。因此，研究应用ＤｉＢＡＣ４（３）染色结合流式细
胞仪评估了ＰＣ－ＥＥＦ作用于Ｋ５６２细胞后细胞膜电
位水平变化。结果发现，ＰＣ－ＥＥＦ能够显著增强胞
内ＤｉＢＡＣ４（３）荧光强度，且随着药物浓度的增加，
细胞膜去极化水平有所提高，表明 Ｋ５６２细胞膜电
位发生药物剂量依赖的去极化。
细胞膜系统的损伤会引起膜去极化、扰乱膜脂
对称性、诱导膜上酶活性的抑制以及质膜完整性的
破坏［１５］，这些细胞功能的紊乱最终可能会引起细胞
凋亡的发生［１６］。本研究的 Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２－ＰＩ双染
实验也证实了ＰＣ－ＥＥＦ处理可以引起Ｋ５６２细胞发
生凋亡，但其具体的分子生物学机制还有待进一步
研究。
４　结论
ＰＣ－ＥＥＦ对肿瘤细胞杀伤作用具有广谱性，且
对白血病细胞杀伤作用最为明显。ＰＣ－ＥＥＦ通过诱
导Ｋ５６２细胞发生显著地细胞形态学变化、膜完整
性下降及膜去极化等膜损伤效应从而杀伤肿瘤细
胞，提示细胞膜可能是ＰＣ－ＥＥＦ作用 Ｋ５６２细胞的
主要靶点之一，这也为大金发藓抗肿瘤作用机制研
究提供了有价值的实验数据。
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ｔｕｍｏｒ　ａｎｄ　ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｅｔｈａｎｏｌｉｃ　ｅｘｔｒａｃｔ　ａｎｄ
ｉｔｓ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｐｏｌｙｔｒｉｃｈｕｍ　ｃｏｍｍｕｎｅ　Ｌ．ｅｘ
Ｈｅｄｗ　ｉｎ　Ｌ１２１０ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏ－
ｇｙ，２０１２，１４３（１）：４９－５６．
［７］ＣＨＥＮＧ　Ｘ　Ｘ，ＸＩＡＯ　Ｙ　Ｐ，ＷＡＮＧ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｅｔｈｙｌ　ａｃｅ－
ｔａｔｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｔｒｉｃｈｕｍ　ｃｏｍｍｕｎｅ　Ｌ．ｅｘ　Ｈｅｄｗ　ｉｎ－
ｄｕｃｅｄ　ｃｅｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｖｉａ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｎ　Ｌ１２１０
ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１３，１４８（３）：
９２６－９３３．
［８］ＷＡＮＧ　Ｈ　Ｐ，ＷＡＮＧ　Ｘ　Ｂ，ＷＡＮＧ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ．Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ
ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｔｈｅ　ｅｆｆｉｃａｃｙ　ｏｆ　ｃｈｌｏｒｉｎ　Ｅ６－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｐｈｏｔｏｄｙ－
ｎａｍｉｃ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｉｎ　ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ　ｉｎ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，３９（９）：１７１３－１７２４．
［９］ＷＡＮＧ　Ｐ，ＬＩ　Ｙ　Ｘ，ＷＡＮＧ　Ｘ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｄａｍａｇｅ
ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｗａｖｅ　ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ　ｏｎ　Ｋ５６２ｈｕｍａｎ
ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，
２０１２，３１（１２）：１９７７－１９８６．
［１０］ＭＡＲＧＩＮＡ　Ｄ，ＬＬＩＥ　Ｍ，ＧＲＡＤＩＮＡＲＵ　Ｄ．Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ
ａｎｄ　ｅｐｉｇａｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ　ｇａｌａｔｅ　ｉｎｄｕｃｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａ　ｄｏｓｅ－ｄｅ－
ｐｅｎｄｅｎｔ　ｓｔｉｆｆｅｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃｅｌ
ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｉｎ－
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２，１３（４）：
４８３９－４８５９．
［１１］ＧＲＵＳＣＨ　Ｍ，ＰＯＬＧＡＲ　Ｄ，ＧＦＡＴＴＥＲ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｍａｉｎｔｅ－
ｎａｎｃｅ　ｏｆ　ＡＴＰ　ｆａｖｏｕｒｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｖｅｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ
ｂｙ　ｂｅｎｚａｍｉｄｅ　ｒｉｂｏｓｉｄｅ［Ｊ］．Ｃｅｌ　Ｄｅａｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ－
ｔｉｏｎ，２００２，９（２）：１６９－１７８．
［１２］ＭＩＬＬＥＲ　Ｄ　Ｌ，ＤＯＵ　Ｃ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｄａｍａｇｅ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ
ｆｏｒ　ｐｕｌｓｅｄ　ｏｒ　ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ　ｉｎ　ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ　ｃｅｌｓ
ｌｏａｄｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｔｒａｓｔ　ａｇｅｎｔ　ｇａｓ　ｂｏｄｉｅｓ［Ｊ］．Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ
ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，３０（３）：４０５－４１１．
［１３］ＨＡＯ　Ｑ，ＬＩＵ　Ｑ　Ｈ，ＷＡＮＧ　Ｘ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｄａｍ－
ａｇｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ　ｏｎ　Ｅｈｒｌｉｃｈ　ａｓｃｉｔｉｃ
ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ　ａｎｄ　Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａ－
ｃｅｕｔｉｃａｌｓ，２００９，２４（１）：４１－４８．
［１４］ＫＬＥＳＺＣＺＹＮ　ＳＫＩ　Ｋ，ＳＫＡＤＡＮＯＷＳＫＩ　Ａ　Ｃ．Ｍｅｃｈａ－
ｎｉｓｍ　ｏｆ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅｒｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ　ａｃｉｄｓ，Ｉ：ａｌ－
ｔｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐｌａｓｍａ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ａｎｄ　ｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒ
ｐＨ　ｌｅｖｅｌ［Ｊ］．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，
２００９，２３４（３）：３００－３０５．
［１５］ＳＡＮＣＨＥＺ　Ｍ，ＴＯＲＲＥＳ　Ｊ　Ｖ，ＴＯＲＭＯＳ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｍ－
ｐａｉｒｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｅｎｚｙｍｅｓ，ｌｉｐｉｄ　ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ
ａｎｄ　８－ｏｘｏ－２９－ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ　ｉｎ　ａｄｖａｎｃｅｄ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｏ－
ｖａｒｉａｎ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｏｆ　ａ　Ｓｐａｎｉｓｈ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ
Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００６，２３３（１）：２８－３５．
［１６］ＣＡＲＥＷ　Ｊ　Ｓ，ＧＩＬＥＳ　Ｆ　Ｊ，ＮＡＷＲＯＣＫＩ　Ｓ　Ｔ．Ｈｉｓｔｏｎｅ
ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｃｅｌ　ｄｅａｔｈ　ａｎｄ
ｐｒｏｍｉｓｅ　ｉｎ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔ－
ｔｅｒｓ，２００８，２６９（１）：７－１７．
〔责任编辑　王　勇〕