全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2014，26:1733-1738
文章编号:1001-6880(2014)11-1733-06
收稿日期:2014-05-19 接受日期:2014-11-06
基金项目:国家自然科学青年基金项目(81202957) ;陕西省自然
科学基金项目(2014JQ4144)
* 通讯作者 Tel:86-29-8531027;E-mail:yapingxiao@ snnu． edu． cn
大金发藓化学成分预试及其肿瘤细胞毒活性研究
成晓霞1，2，张志琪1，2，汤 薇2，王亚芹1，袁文娟1，肖娅萍1，3*
1药用植物资源与天然药物化学教育部重点实验室;2 陕西师范大学化学化工学院，西安 710062;
3陕西国际商贸学院医药学院，西安 712046
摘 要:运用经典试管反应法结合纸色谱法对大金发藓的化学成分进行初步测定，其中含有挥发油、油脂、糖
类、皂苷、生物碱、黄酮、香豆素及其萜类化合物。采用 MTT法对大金发藓醇提物进行体外细胞毒活性检测，其
对多种肿瘤细胞的生长均产生一定影响，并可显著抑制 L1210 白血病细胞的增殖(IC50 77． 22 μg /mL)。以三种
不同类型的白血病细胞(L1210 小鼠淋巴白血病细胞，K562 人慢性髓系白血病细胞和 U937 人急性单核白血病
细胞)为实验模型，比较了大金发藓孢子体和配子体细胞毒活性的差异。在相同条件下，孢子体对白血病细胞
的杀伤能力远优于配子体。本文首次比较研究了大金发藓孢子体和配子体的抗癌活性，该结果不仅为大金发
藓的传统用药提供了科学依据，同时也为大金发藓抗肿瘤新药研发方向提供了新思路。
关键词:大金发藓;化学成分预试;体外抗肿瘤;孢子体;配子体
中图分类号:Ｒ284． 1;Ｒ73-3 文献标识码:A
Chemical Components and Cytotoxic Activity of
Polytrichum commune L． ex Hedw
CHENG Xiao-xia1，2，ZHANG Zhi-qi1，2，TANG Wei2，WANG Ya-qin1，YUAN Wen-juan1，XIAO Ya-ping1，3*
1Key Laboratory of Medicinal Plant Ｒesources and Natural Pharmaceutical Chemistry;
2College of Chemistry and Chemical Engineering，Shaanxi Normal University，Xian 710062，China;
3Shaanxi Institute of International Trade ＆ Commerce，Xian 712046，China
Abstract:Polytrichum commune L． ex Hedw is a traditional Chinese herb for treatment of fever，hemostatic，uterine pro-
lapse and especially for lymphocytic leukemia． The aim of present study was to investigate the chemical components and
the possible anti-proliferative activity of P． commune ethanol extract． The systematic pre-test method was used to prelimi-
narily analyze the chemical components of P． commune． The obtained results showed that there were essential oils，lipid，
saccharide，glycosides，saponin，alkaloid，flavonoid，coumarin and terpene lactone in P． commune． The cytotoxic activity
was measured by MTT assay． Ｒesults showed that the cell viability of L1210 cells was reduced by P． commune ethanol
extract in a concentration-dependent manner，and the IC50 value was about 77． 22 μg /mL at 24 h post treatment． In addi-
tion，the anti-tumor effects of ethanol extract of sporophyte and gametophyte from P． commune were comparatively stud-
ied． MTT assay results showed that both of them can inhibit proliferation of leukemia cells (L1210 cells，K562 cells，
U937 cells)． However，the anti-tumor activity of sporophyte was found to be higher than that of gametophyte． This was
the first report on comparative research of anti-tumor effect of sporophyte and gametophyte from P． commune in cultured
leukemia cells，which provided scientific basis for its usefulness as traditional medicine． Further studies are needed to
confirm the precise mechanism not only the crude extract but as well the monomeric chemical substances of P． commune．
Key words:Polytrichum commune L． ex Hedw;preliminary chemical test;anti-tumor effect in vitro;sporophyte;gameto-
phyte
大金发藓 Polytrichum commune L． ex Hedw． 为
金发藓科 Polytrichaceae、金发藓属 Polytrichum植物，
又名独根草、土马鬃、岩上小草等，生于林下湿地，常
形成大片群落覆盖地面，广泛分布于我国南北各
地［1，2］。大金发藓作为药用苔藓最早出现在宋代的
《嘉祐补注本草》中，《本草纲目》及《中华本草》对
其药性描述为全草入药，味甘，性凉。能滋阴清热，
凉血止汗，气味甘浚，无毒。对高夫克氏球菌、金色
葡萄菌、肺炎球菌、结核杆菌有抗性，并对淋巴细胞
白血病等癌症有一定抑制作用［3，4］。近年来陆续有
报道称从桧叶金发藓 Polytrichum juniperum，多形金
发藓 Polytrichum ohioense Ｒen＆Card 和变形金发藓
Polytrichum pallidisetum Funck中分离得到一系列新
化合物并初步验证其具有抗癌活性［5-7］。因此，本文
对大金发藓的化学成分和抗肿瘤作用进行初步探
究，以期为金发藓属植物药用价值的开发应用提供
一定参考。
1 材料与方法
1． 1 植物样品
大金发藓地上全草于 2009 年 8 月采自陕西秦
岭南麓平河梁(海拔 2305 m，33°27 N，108°30 E) ，
经陕西师范大学肖娅萍教授鉴定为金发藓属大金发
藓 Polytrichum commune L． ex Hedw。
1． 2 供试肿瘤细胞
L1210 小鼠淋巴白血病细胞，人乳腺癌 MDA-
MB-231、MCF-7 细胞，人食管癌 Eca-109 细胞，人结
直肠癌 SW-480、SW-620 细胞，人胚肾细胞 HEK-
293，均由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源
中心引进，本室传代保种。K562 人慢性髓系白血病
细胞和 U937人急性单核白血病细胞由中国北京协和
医科大学引进，本室传代保种。以上肿瘤细胞均按照
美国模式菌种收集中心(ATCC)提供方法进行培养。
1． 3 主要试剂
DMEM、PＲMI1640、L-15 和马血清均购自 Gibco
公司，胎牛血清(Hyclone 公司) ，谷氨酰胺(Amresco
公司) ，超纯水(Millipore 公司) ，二甲基亚砜(DM-
SO)和噻唑蓝(MTT)均购自 Sigma 公司，化学成分
预试所用试剂均为国产分析纯，自配。
1． 4 主要仪器
万分之一电子天平(塞多利斯科学仪器北京有
限公司) ，KQ-300DE 型数控超声波清洗器(昆山市
超声仪器有限公司) ，ＲE-52AA旋转蒸发器(上海亚
荣生化仪器厂) ，HH-6B 数显恒温水浴锅(国华电器
有限公司) ，生物材料粉碎机，超净工作台(苏州安
泰空气技术有限公司) ，CO2 培养箱(Thermo 公司) ，
倒置显微镜(IMT-2，Olympus 公司) ，台式高速离心
机(Eppendorf公司) ，高压灭菌锅(上海申安医疗器
械厂) ，酶标仪(型号 BIO-TEK-ELX800，Tecan公
司) ，96 孔培养板(Costar公司)。
1． 5 大金发藓化学成分预试验
按照植物化学成分系统预试的常规方法［8］进
行大金发藓石油醚提取液、水提取液及乙醇提取液
的制备，通过传统试管预试方法结合纸色谱法进行
挥发油、油脂、蛋白质、氨基酸、糖类、皂苷、生物碱、
黄酮、蒽醌、香豆素、木质素等化学成分的检测。
1． 6 大金发藓提取物制备
收集大金发藓全株，制备成粉末，用乙醇结合超
声提取，30 min /次，共计 3 次，收集合并提取液，减
压浓缩后通过真空冷冻干燥得大金发藓乙醇提取物
(Ethanol extract from Polytrichum commune L． ex
Hedw，EPCLH)。将 EPCLH溶解于 70% 乙醇，室温
条件下 3 000 rpm 离心 15 min，取上清液用 0． 22 μm
滤膜过滤后进行抗癌活性检测［9］。
1． 7 大金发藓肿瘤细胞毒活性检测
细胞存活率采用 MTT 法进行检测［9］。收集对
数生长期细胞，以 1 × 105 个 /mL 接种于 96 孔板中
培养。实验分为空白对照组、阴性对照组(70%乙
醇)、阳性对照组(0． 5 μg /mL 紫杉醇)和给药组
(EPCLH) ，细胞加药后连续培养 24、48、72 h 后，每
孔加入 5 g /L 的无菌 MTT 溶液 10 μL，继续培养 4
h。弃去各孔培养液，加入 150 μL DMSO，200 rpm
摇床震荡 10 min，待完全溶解后用酶标仪测定 570
nm吸光度(A) ，校正波长为 630 nm。每组设 6 个复
孔，实验重复 3 次。细胞存活率 = A加药组 / A对照组 ×
100%。结合药物的作用剂量，推算出药物对肿瘤细
胞的半数抑制浓度 IC50，以此衡量药物的抗癌活性。
1． 8 数据分析
实验数据均以 Mean ± SD 进行表示。采用
SPSS 13． 0 软件进行统计分析。药物浓度与细胞生
长抑制率的关系用线性回归与相关分析，组间比较
使用 T-test。
2 结果与分析
2． 1 大金发藓化学成分预试验结果
大金发藓石油醚提取液、水提取液及乙醇提取
液的化学成分预试结果(表 1)表明，大金发藓中含
有挥发油或油脂、糖类、皂苷、生物碱、黄酮、香豆素
及其萜类内酯化合物，无法确定是否存在蛋白质、氨
基酸、蒽醌及木质素类化合物。
4371 天然产物研究与开发 Vol. 26
表 1 大金发藓化学成分系统预试验结果
Table 1 Systematic pre-test results on chemical composition of P． commune
序号
No．
检测物质
Detected substance
试验方法
Method
现象
Phenomena
结果
Ｒesult
1 挥发油和油脂Essential oils and lipin
* 挥发性检验
Evaporability test 有油斑 Obvious +
2 蛋白质、氨基酸和多肽Proteins，amino acids and polypeptides 茚三酮(Ninhydrin)反应 不明显 Not obvious －
双缩脲(Biuret)反应 不明显 Not obvious －
3 糖及苷Saccharide and glycosides ɑ-萘酚(Molish)反应
紫红色环
Purple– ring in interface
+
菲林(Fehling)反应 棕红色沉淀Brownish red sediment +
4 皂甙 Saponin 泡沫反应 Foam test 持久泡沫Continuous foam +
溶血(Hemolysis)反应 明显 Obvious +
醋酐-浓硫酸试剂反应
Acetic anhydride concentrated oil of vitriol test
紫红色环
Purple– ring in interface
+
5 生物碱 Alkaloid 碘化铋钾(Dragendorff)试剂反应 橘黄色沉淀Saffron yellow sediment +
碘化汞钾(Mayer)试剂反应 黄白色沉淀 Yellowish-white sediment +
碘-碘化钾(Wangner)试剂反应 棕红色沉淀Brownish red sediment +
磷钼酸(Sconnenschein)试剂反应 棕黄色沉淀Claybank sediment +
6 黄酮 Flavonoid 盐酸
-镁粉试剂
Hydrochloric acid-magagent 棕红色 Brownish red +
醋酸铅(Lead acetate)沉淀反应 棕黄色沉淀 Yellowish-brown sediment +
* 喷洒 1% AlCl3 乙醇溶液棕色或藏蓝色斑点 Brown and dark blue blotch +
7 蒽醌 Anthraquinone 醋酸镁(Magnesium acetate)试剂反应 不明显 Not obvious －
碱性反应 Alkaline reaction 不明显 Not obvious －
8 香豆素与萜类内脂化合物Coumarin and Terpene lactone * 异羟肟酸铁(Emerson)试剂反应 蓝紫色斑点 Amethyst blotch +
荧光观察
Fluorescence observation 蓝紫色 Amethyst +
9 木质素 Lignan
* 喷洒 5 %磷钼酸乙醇液
Spray 5 % phosphomolybdic acid ethanol 不明显 Not obvious －
注:+表示检测结果呈阳性;－表示检测结果呈阴性。标有* 的反应表示在滤纸上进行，其余反应皆在试管中进行。
Note:+ means positive result;-means negative result;* means paper chromatography．
2． 2 大金发藓提取物制备结果
大金发藓 300 g 经乙醇提取后得浸膏 16． 7 g，
计算得率为 5． 57%。大金发藓孢子体(J-BZ)100 g
经乙醇提取后得浸膏 8． 73 g，计算得率为 8． 73%。
大金发藓配子体(J-PZ)300 g 经乙醇提取后得浸膏
9． 33 g，计算得率为 3． 11%。结果提示大金发藓孢子体
中化学物质种类和含量均有可能高于其配子体。
2． 3 大金发藓抗肿瘤活性分析
2． 3． 1 大金发藓乙醇提取物抑制肿瘤细胞增殖及
对正常细胞生长的影响
将大金发藓乙醇提取物(EPCLH)分别与表 2
所列的肿瘤细胞在实验条件下共孵育，结果显示，作
用 24 h 后，120 μg /mL 的 EPCLH 能将 L1210 细胞
的存活率降至 30%以下。相同剂量作用下，MDA-
MB-231 和 MCF-7 细胞的增殖能力也受到一定抑
制，但作用 48 h后仍未能使细胞存活率降至 50%以
下。EPCLH对食管癌细胞和结直肠癌细胞生长的
影响明显低于其对白血病细胞的毒性作用。以上结
果提示，L1210 白血病细胞对 EPCLH 的毒性作用较
为敏感。
5371Vol. 26 成晓霞等:大金发藓化学成分预试及其肿瘤细胞毒活性研究
表 2 大金发藓乙醇提取物抑制肿瘤细胞增殖活性(n = 6，x ± s)
Table 2 Anti-tumor activity of P． commune ethanol extract (n = 6，x ± s)
肿瘤细胞类型
Cancer cells
剂量
Dose(μg /mL)
时间
Time(h)
存活率
Cell viability(%)
小鼠白血病细胞 Leukemia L1210 cells 120 24 26． 99 ± 1． 07
人乳腺癌细胞 Human breast cancer MDA-MB-231 120 48 65． 29 ± 2． 02
人乳腺癌细胞 Human breast cancer MCF-7 120 48 64． 62 ± 1． 74
人食管癌细胞 Esophageal cancer Eca-109 150 48 69． 96 ± 1． 97
人结直肠癌细胞 Human colon cancer SW-480 150 48 74． 46 ± 0． 96
人结直肠癌细胞 Human colon cancer SW-620 150 48 89． 71 ± 1． 09
为进一步验证 EPCLH的细胞毒活性，本实验比
较了其对 L1210 细胞和 HEK 293 细胞生长的影响，
同时以紫杉醇(0． 5 μg /mL)作为阳性对照。结果如
图 1 所示，EPCLH 可明显抑制 L1210 细胞的增殖，
且具有剂量依赖效应。当药物作用 24 h 后，随着药
物剂量由 30 μg /mL增加到 120 μg /mL，细胞存活率
则由 82． 91%下降至 26． 99%，此时的半数抑制浓度
(IC50)为 77． 22 μg /mL。与对照组相比，30 μg /mL
的 EPCLH即可对 L1210 细胞的生长产生抑制作用
图 1 大金发藓乙醇提取物对 L1210 细胞和 HEK-293 细
胞的增殖抑制作用
Fig. 1 Cytotoxicity effect of EPCLH on L1210 cells and
HEK-293 cells
注:Control:正常对照组;(－) :阴性对照组(70%乙醇) ;(+) :阳
性对照组(0． 5 μg /mL紫杉醇)
与对照组相比* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01;与紫杉醇组相比#P ＜
0． 01;与 HEK-293 细胞相比▲P ＜ 0． 01
Note:Control:Normal group; (－ ) :Negative control group(EtOH
70%) ;(+) :Positive control group(Taxol 0． 5 μg /mL)
* P ＜ 0． 05 and ＊＊P ＜ 0． 01 versus the control，#P ＜ 0． 01 versus
the taxol，▲P ＜ 0． 01 versus the HEK-293 cells
(P ＜ 0． 05) ，当药物剂量由 60 μg /mL 增加至 120
μg /mL时，抑制作用愈发明显(P ＜ 0． 01)。而相同
实验条件下，紫杉醇对细胞的抑制率仅为 20%，与
90 μg /mL的 EPCLH 相比差异极显著(P ＜ 0． 01)。
此外，EPCLH对 L1210 细胞和 HEK-293 细胞的生长
影响差异极显著(P ＜ 0． 01) ，相同剂量的 EPCLH 能
够显著降低 L1210 白血病细胞存活率的同时对
HEK-293 人胚肾细胞的生长不产生明显影响。
2． 3． 2 大金发藓孢子体与配子体对白血病细胞毒
性的比较
植物在不同生长时期所含化学物质的种类及含
量也略有变化，以体外培养的白血病细胞为实验模
型，对大金发藓的孢子体(J-BZ)与配子体(J-PZ)的乙
醇提取物进行抗肿瘤活性检测。将相同剂量的 J-BZ
与 J-PZ分别加入 L1210细胞、K562细胞及 U937细胞，
共孵育 24、48、72 h，比较分析三种白血病细胞在两种提
取物的干预下相对存活率的变化，结果见图 2。
J-BZ能够在作用 24 h即对 K562 细胞的生长造
成影响，当作用剂量为 80 μg /mL 时，细胞生长被抑
制，细胞存活率降至 50%左右，当药物浓度增至 120
μg /mL，细胞存活率低于 20%(Fig． 2A)。相同条件
下，当 J-PZ的浓度为 160 μg /mL才能使细胞存活率
降至 20%以下(Fig． 2B)。整体看来，J-BZ 与 J-PZ
均能对 K562 细胞的增殖起到抑制作用，但处理相
同时间后(24 h) ，二者表现出的抗肿瘤能力大小却
明显不同，低剂量时差异极显著(P ＜ 0． 01) ，当细胞
存活率降至 20%以下，二者差异显著(P ＜ 0． 05)
(Fig． 2C)。
当等剂量的 J-BZ 与 J-PZ 作用于 L1210 细胞
时，结果如图 2D ～ F 所示，二者对细胞生长的影响
在 48 h 表现最明显。当药物浓度为 80 μg /mL 时，
J-BZ与 J-PZ 作用下的细胞存活率分别为 47% 和
70%;药物浓度增至 120 μg /mL，J-BZ可使细胞存活
率降至 20%以下，而 J-PZ 处理后的细胞存活率为
40%;160 μg /mL 的 J-BZ 已使得细胞几乎不再生
长，同剂量的 J-PZ此时将细胞存活率保持在 20%左
6371 天然产物研究与开发 Vol. 26
图 2 大金发藓孢子体与配子体对白血病细胞增殖的影响
Fig. 2 Cytotoxicity effect of sporophyte and gametophyte on leukemia cells
注:相同作用条件下，与同剂量组相比* P ＜ 0． 05;＊＊P ＜ 0． 01。
Note:Under the same condition，compared with same dose of J-BZ and J-PZ，* P ＜ 0． 05;＊＊P ＜ 0． 01．
右。当 J-BZ 与 J-PZ 的作用剂量大于 200 μg /mL
后，细胞几无存活。因此，就 200 μg /mL 以下的三
种药物浓度对 L1210小鼠白血病细胞的存活影响力而
言，大金发藓孢子体明显优于其配子体(P ＜0． 01)。
在 U937 细胞的生长过程中加入等浓度的 J-BZ
与 J-PZ，二者均表现出明显的时间、剂量依赖性。
当 J-BZ与细胞共孵育 72 h，随着药物浓度由 80 μg /
mL增至 120、160 μg /mL 后，细胞存活率依次降为
65%、30%、15%(Fig． 2G)。相同的作用时间内，80
μg /mL的 J-PZ几乎未对细胞的生长造成影响，当药
物剂量为 160 μg /mL，细胞存活率保持在 60%左右，
直至药物浓度达到 240 μg /mL，细胞存活率才下降
至 20%(Fig． 2H)。比较分析二者对细胞增殖的影
响，结果显示在 80 ～ 240 μg /mL 的剂量范围内，大
金发藓孢子体对 U937 人急性粒细胞白血病的增殖
抑制能力远远优于其配子体(P ＜ 0． 01) (Fig． 2K)。
3 讨论
大金发藓因具有药用价值被历代药用典籍记
载，近代学者对其化学成分进行研究，指出其中主要
含二氧杂环己烷木质素，苯酚类化合物，甾醇酯类，
蜡酯类，植醇酯，叶绿素，花生四烯酸，单糖基二甘油
酯类，双糖基二甘油酯类和脂类等［10-12］。本文对采
自秦岭南麓的大金发藓化学成分进行初步研究，部
分结果与文献描述一致，同时确定大金发藓中还存
在生物碱、黄酮和皂苷类化合物。
对金发藓属的其他植物研究显示，桧叶金发藓
的乙醇及酸提取物能使小鼠 sarcoma 37 肉瘤坏
死［5］;多形金发藓和变形金发藓中分离得到的 8 种
新型苯并萘并呫吨酮类化合物(benzonaphthoxanthe-
nones)和 2 种新结构的联苄并苯乙烯醛基(cin-
namoyl bibenzyls)化合物对 9PS 小鼠白血病细胞和
多种人类肿瘤细胞(A-549 肺癌、MCF-7 乳腺癌、HT-
29 结肠癌、ＲPMI-7951 黑色素瘤和 U-251 胶质瘤)
均表现出细胞毒性，其中对白血病细胞的杀伤效应
最为显著［6，7］。此外，在 1977 年《本草纲目》(校点
本)中也记载大金发藓对淋巴细胞白血病具有一定
抑制作用［3］。根据同属植物化学成分种类相近的
规律推测，大金发藓中存在抗肿瘤化合物的可能性
极大。这一推论在 2009 年被傅芃等人的研究结果
证实，从大金发藓中分离得到的 2 种新化合物(S，
E)-5-苯乙烯基-7-羟基二氢黄酮(communin B)和苯
7371Vol. 26 成晓霞等:大金发藓化学成分预试及其肿瘤细胞毒活性研究
并萘并呫吨酮衍生物(ohioensin F)均能抑制 A-549
人肺癌肿瘤细胞株、LOVO人肠癌细胞株、MDA-MB-
435 人乳腺癌细胞株、HepG2 人肝癌细胞株和 6T-
CEM人 T细胞白血病细胞的增殖，其中，6T-CEM人
T细胞白血病细胞对药物处理最为敏感［12］。本文
结果同样证明大金发藓乙醇提取物能够对白血病细
胞、人乳腺癌细胞、人鼻咽癌细胞、人结直肠癌细胞
产生抗肿瘤活性，其中对白血病细胞的杀伤效应最
强，这与已有文献结果相符。同时，实验结果显示对
L1210 白血病细胞产生明显增殖抑制作用的药物剂
量却未对正常细胞的生长产生影响，以上研究结果
提示，大金发藓在抗肿瘤特别是白血病治疗中具有
潜在应用价值。
苔藓植物的生活史表现为配子体和孢子体的世
代交替，其中配子体为具有单倍数染色体的小型绿
色自养植物，而孢子体寄生于配子体上，通过基足摄
取配子体的营养供给，保证具有 2 倍数染色体的孢
子正常发育。在生长过程中为抵御外界环境带来的
侵害而保证自身发育的需要，植物常常会产生并积
累一些次生代谢产物，而这些次生代谢产物常具有
重要的生理活性［13］。本文对大金发藓进行有效成
分提取的过程中发现其孢子体提取物得率大于配子
体，推测孢子体中化学物质种类和含量均有可能高
于其配子体，从而导致二者具有不同的生理活性。
以体外培养的白血病细胞为考察对象的实验结果证
实了大金发藓孢子体的抗肿瘤活性远优于其配子
体。根据植物次生代谢物质生成规律结合苔藓植物
生活史推测，可能在大金发藓孢子体形成过程中产
生了一些特别的化学物质，并潴留于孢子体中，使得
大金发藓孢子体内化学物质的种类及含量与其配子
体内略有不同，导致二者表现出的生理活性差异显
著。对其他植物类似的研究结果也表明，同一植物
不同生长部位有效成分含量差异显著。此外，药典
收录同一种植物的不同部位记载为不同药物的依据
也是基于入药部位所含化学成分种类的不同。若要
明确大金发藓孢子体及配子体抗肿瘤活性的差异，
还有待于对其化学成分的进一步研究，用实验数据
来佐证推论。
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