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黄顶菊中除草活性成份Ⅱ作用机制的初步研究



全 文 :第35卷第6期
2 0 1 2年11月
河 北 农 业 大 学 学 报
JOURNAL OF AGRICULTURAL UNIVERSITY OF HEBEI
Vol.35No.6
Nov.2 0 1 2
   
文章编号:1000-1573(2012)06-0069-06
黄顶菊中除草活性成份Ⅱ作用机制的初步研究
李建强, 霍静倩, 龚占虎, 张 静, 任承才, 康占海, 张金林
(河北农业大学 植物保护学院,河北 保定071001)
摘要:为了控制和利用外来入侵杂草黄顶菊,并发现新的除草作用机制,本试验通过水蒸气蒸馏的方法从黄顶
菊花中提取并分离出一种除草活性很强的成份Ⅱ。在此基础上测定了成份Ⅱ对马唐叶片膜透性、叶绿素含量、
β-胡萝卜素、丙二醛、超氧自由基、含水量、根系活力的变化,以明确其除草作用机制。结果表明:成份Ⅱ在光照
条件下对马唐叶片膜透性、叶绿素含量、β-胡萝卜素、丙二醛、超氧自由基的影响均高于其在黑暗条件下对这些
物质的影响。成份Ⅱ是一种光活化物质,其对杂草的除草活性主要是影响了杂草的光合作用。本试验为发现新
的除草剂作用靶标奠定了基础。
关 键 词:黄顶菊;除草活性;作用机制
中图分类号:S451 文献标志码:A
A preliminary study on action of herbicidal mechanism of
the ingredientⅡfromFlaveria bidentis(L.)Kuntze
LI Jian-qiang,HUO Jing-qian,GONG Zhan-hu,ZHANG Jing,
REN Cheng-cai,KANG Zhan-hai,ZHANG Jin-lin
(Colege of Plant Protection,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China)
Abstract:In order to control and utilize the exotic weed Flaveria bidentis(L.)Kuntze,and
find its new herbicidal mechanism,this study got a strong herbicidal activity ingredient II
which was extracted and isolated from the F.bidentis(L.)Kuntze by using the steam distil-
lation method.To defining the herbicidal mechanism of ingredientⅡ,we measured the change
of leaf membrane permeability of crab grass,content of chlorophyl,beta-carotene,malondial-
dehyde,superoxide radical,moisture content,root activity.The results showed that ingredi-
entⅡhad higher effects on the change of leaf membrane permeability of crab grass,content of
chlorophyl,beta-carotene,malondialdehyde,superoxide radical,moisture content,root activ-
ity under the light condition than under the dark condition.IngredientⅡ was a light-activated
material.The reason for its herbicidal activity on weeds was that it affected the photosynthesis
of weeds.This study laid a foundation for the discovery of new herbicides targets.
Key words:Flaveria bidentis(L.)Kuntze;herbicidal;mechanism of action
           
收稿日期:2012-08-26
基金项目:国家自然科学基金(31171877).
作者简介:李建强(1988-),男,河北省宁晋人,在读硕士生,研究方向为天然产物除草剂.
通讯作者:张金林(1968-),男,教授,博士,主要从事农药学的教学和科研工作.E-mail:zhangjinlin@hebau.edu.cn.
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  自20世纪中期以来,化学除草剂代替了其他杂
草治理的方法,大大降低了成本,提高了杂草控制效
率[1]。但随着人们对环境安全性的要求越来越高,
从天然产物中挖掘和发现具有生物活性的物质,已
成为新农药创制研究的前沿与热点领域,同时也是
获得绿色农药的有效途径之一[2]。从天然除草活性
物质中发现作用机理独特的化合物不仅与现有农药
品种无交互抗性,而且往往具有优异的活性,更适宜
于有害生物综合治理策略和持续农业发展的要求,
对环境安全。黄顶菊是一种侵入中国的外来植物,
已对侵入地的农业生产造成了严重的威胁,外来入
侵生物已受到来自美国、欧盟成员国、中国等国家的
高度重视[3-4],各个国家都开始着手研究如何控制与
利用外来入侵生物。国外,对黄顶菊的研究多集中
于光合生理特性与C4 途径演化等方面,而关于黄顶
菊提取物的研究相对较少,已有报道,黄顶菊的提取
物具有杀虫[5-6]、杀菌和抗病毒活性[7];本实验室前
期的研究发现,黄顶菊的不同有机溶剂提取物具有
除草活性[8]。本研究对从黄顶菊花中提取的除草活
性物质进行了分离,明确了其中的一个活性成份Ⅱ
具有很强的除草活性,在此基础上,以马唐为试材,
测定了活性成份Ⅱ对叶片膜透性、叶绿素含量、β-胡
萝卜素、丙二醛、超氧自由基、含水量、根系活力的变
化,明确了其除草作用机理,以及为活性成份Ⅱ作用
靶标的确定以及除草剂的开发奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试植物 黄顶菊[FLaveria bident(L.)
Kuntze](采自保定市清苑县);马唐(Digitaria san-
guinaLis L.)(来自河北农业大学西校区标本园)。
1.1.2 供试药剂 石油醚、乙醇、三氯乙酸、硫代巴
比妥酸(分析纯,天津市天大化工实验厂);乙酸乙
酯、丙酮、(分析纯,天津市新通精细化工有限公司);
甲醇(分析纯,天津市标准科技有限公司)。
1.1.3 供试仪器 超声波(SB-5220,上海新芝生物
技术研究所);微波萃取仪(MAS-1,上海新仪微波
化学科技有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 黄顶菊花中挥发性物质的提取及分离[9] 
将黄顶菊花风干后进行粉碎,取50g花粉用300
mL蒸馏水浸提4~5h后用微波处理2次(每次50
s),超声波处理10min后用电热套进行加热蒸馏,
并用冷凝管冷凝接收馏分。将蒸馏出的液体用等量
的石油醚萃取,静置12h后分液。取萃取液100mL
浓缩至2mL后加样至硅胶柱,用石油醚∶乙酸乙
酯=3∶1的展开液淋洗。在345nm紫外光灯下观
察收集不同组分并进行除草活性测定,筛选出活性
强的组份。
1.2.2 除草活性成份的制备—高效液相色谱法
将1.2.1方法分离得到的具有除草活性的组分,利
用Agilent 1200LC高效液相色谱仪进行检测。色
谱分析条件为:色谱柱:Zorbax Eclipse XDB-C18,柱
长125mm×4.0mm,内径5μm。流速:1mL/min;
检测波长:348nm,变换不同条件确定适宜的检测流
动相,并观察检测条件下的组分分离情况。待分离
条件确定后用半制备柱进行制备,半制备柱为:
Nave-pak-C18,柱长300mm×7.8mm,内径6μm
(美国 Waters公司),收集保留时间相同的各组分洗
脱液,在40℃条件下减压浓缩,取各组份洗脱液的
浓缩物用甲醇稀释后对马唐的生长抑制作用进行测
定。对所得到洗脱液浓缩物,再次变换不同的色谱
分析条件进行检测,经检测确认只有一单峰后,用氮
吹仪吹干后测定其熔点,检验是否为纯化合物。
1.2.3 除草活性成份对光合作用的影响
(1)马唐的处理方法。将活性成份用甲醇配制
成浓度为20,40,80μg/mL,用微量注射器分别均
匀的点到60片长约2~3cm马唐叶片上,其中30
片杂草叶片放到光照下培养,另外30片杂草叶片放到
黑暗条件下培养,均以甲醇为对照,处理时间为6h。
(2)除草活性成份对马唐叶片细胞膜透性的影
响。分别取浓度为40μg/mL活性成份的石油醚定
容液0.5,1.0,2.0mL加入到10mL离心管中,待
溶剂挥发干后,加入3mL去离子水摇匀,分别加入
0.05g马唐叶片,另取3mL去离子水做同样处理,
每个处理设3个重复,将以上处理分别置于25℃、
光照(光照强度为3 800lx)和黑暗条件下培养24h
后,用DDS-11A型电导仪测定电导率,以不加叶片
的活性成份水溶液以及纯水作对照。并按下列公式
计算相对电导率[10]。
相对电导率(μS/cm)=D1 -D2 -(D3 -D4)
D1:除草活性成份处理后的电导率;
D2:除草活性成份对照的电导率;
D3:水处理后的电导率;
D4:水对照的电导率。
(3)除草活性成份对马唐叶绿素含量的影
响[11]。将处理得到的不同马唐叶片分别加入5mL
丙酮∶乙醇∶水=4.5∶4.5∶1浸提液中,黑暗条
件下浸提24h,取上清液,以浸提液为空白对照,在
645nm 和663nm 测吸光度,叶绿素含量采用
第6期 李建强等:黄顶菊中除草活性成份Ⅱ作用机制的初步研究 71    
Arnon公式进行计算,并计算叶绿素相对破坏率。
C(μg/mL)=8.02×OD663+20.20×OD645
(4)除草活性组份对马唐叶片β-胡萝卜素的影
响[12]。将处理得到的不同马唐叶片中分别加入
5mL 90%丙酮中,黑暗条件下浸提24h取上清
液,以浸提液为空白对照,在450nm测吸光度。测
定对β-胡萝卜素的影响。
(5)除草活性组份对丙二醛含量的影响[13]。用
自来水将处理得到的马唐叶片冲洗干净,再用纯水
冲洗两遍,吸干水分。放入研钵中,加入预冷的
10%三氯乙酸2mL和少量石英砂,在冰浴中研磨
至匀浆,将匀浆转移到离心管中,再用3mL 10%三
氯乙酸分2次冲洗研钵,合并匀浆,以4 000r/min
离心15min,上清液为样品提取液。吸取离心的上
清液2mL(对照加2mL纯水)加2mL 0.6%硫代
巴比妥酸液,混匀物于沸水浴上反应15min,取出
放入冷水浴迅速冷却后再离心,取上清液测定532、
600和450nm下的消光度值,并按公式计算植物样
品提取液中 MDA的浓度。
C(μmol/L)=6.45(A532-A600)-0.56A450,测
定丙二醛的含量。
(6)除草活性组份对超氧自由基含量的影响。
将处理得到的马唐用羟胺氧化法[14]测定超氧自由
基含量的变化。
(7)除草活性组份处理马唐后含水量的变化测
定[15]。将处理得到的马唐叶片,剪下迅速称重,然
后将叶片放到盛有蒸馏水的烧杯中,饱和12h后称
饱和重,之后置于通风烘箱中105℃烘干至恒重,称
干重,并按照以下公式计算水分亏损率。
水分亏损率(%)=1-
鲜得(g)-干重(g)
饱和重(g)-干重(g)×100
(8)除草活性成份处理马唐后吸水能力的变化
测定(测定根系活力)。分别用0.5,1.0,2.0mL的
活性成份的石油醚定容液(40μg/mL)处理大小均
匀一致的马唐叶子15片,每浓度重复3次,处理6h
后,剪取马唐的根,用TTC法进行处理,用721分光
光度计进行比色,以485nm吸光度值作为TTC还
原量的相对量以此作为根系活力评价指标[16]。
2 结果与分析
2.1 柱层析法分离及最佳活性组分的筛选
将萃取液进行硅胶柱层析分离后,在345nm
的紫外光灯下观察到4个不同颜色的条带,依次为:
红色、蓝紫色、淡黄色、绿色,依次编号为:组分Ⅰ、组
分Ⅱ、组分Ⅲ、组分Ⅳ,分别对各组分进行大量富集
后,进行生物除草活性的测定。
通过对各个组份进行除草活性测定发现,蓝紫
色的组份具有较高的除草活性,在用组份Ⅱ处理马
唐24h后表现出枯萎症状,其他组份对马唐抑制作
用均不明显(见图1)。
图1 组份Ⅱ的除草活性测定
Fig.1 The measurement of the herbicidal activity
for componentⅡ
2.2 除草活性成份的制备
通过筛选确定高效液相色谱检测的最适条
件:流动相为甲醇∶水=90∶10,检测波长为
348nm,温度25℃,流速为1.5mL/min。从谱
图(图2)得到2个主要的吸收峰,保留时间分别
为14.138,17.644min。对这2个主要的吸收峰
进行制备,在生物测定时发现成份Ⅱ具有很强的除
草活性,杂草死亡率可以达到90%以上,而成份Ⅰ
的除草效果仅为10%,除草活性差。
图2 组份Ⅱ的高效液相色谱图
Fig.2 The HPLC of componentⅡ
2.3 除草活性成份Ⅱ作用机制的测定
2.3.1 马唐在光照和黑暗条件下对除草活性成份
的反应及细胞膜透性的变化 马唐叶片经除草活性
物质处理24h后,光照条件下处理的马唐与对照相
比,表现出明显的白化症状,且随着除草活性物质浓
度的增加叶片白化症状越明显,黑暗条件下处理的
马唐叶片与对照组的差异不明显。
利用电导率法测定成份Ⅱ在不同光照条件下对
马唐叶片细胞膜透性的影响,结果发现(见表1),成
份Ⅱ对马唐细胞膜透性具有明显的影响,随着活性
72  河 北 农 业 大 学 学 报     第35卷   
成份浓度的增高,其电导率也随之增加。在光照条
件下水处理和除草活性组分水溶液处理所测得的电
导率均高于黑暗处理,说明活性成份在光照条件下,
对马唐细胞膜透性的影响比在黑暗条件下明显。
表1 黄顶菊中除草活性成份对马唐细胞膜透性的影响
Table 1 The effect of herbicidal active ingredient fromF.bidentis(L.)Kuntze
on membrane permeability of crab grass
处理浓度/
(μg·mL
-1)
Concentration
电导率/(μS·cm
-1)
Conductivity
          
活性成份的电导率/(μS·cm
-1)
Conductivity
 of active ingredient 
光照Light 黑暗Dark 光照Light 黑暗Dark
水的电导率/
(μS·cm
-1)
Water conductivity
相对电导率/
(μS·cm
-1)
Relative conductivity
光照Light 黑暗Dark
0  30.27dD  24.62dD - - 9.75aA - -
20  76.82cC  70.26cC  11.25aA  10.62aA  9.75aA  45.05cC  38.77cC
40  136.05bB  115.7bB  11.25aA  10.62aA  9.75aA  104.28bB  90.21bB
80  153.63aA  126.9aA  11.25aA  10.62aA  9.75aA  121.89aA 101.77aA
 注:表中同列中不同小写字母表示P=0.05水平差异显著,不同大写字母表示P=0.01水平差异显著,下同。
2.3.2 活性成份对马唐叶绿素含量的影响 在光
照和黑暗条件下用成份Ⅱ处理马唐叶片后,用丙酮∶
乙醇=4.5∶1进行浸提叶绿素,测定结果发现(表
2),随着活性成份浓度的增加,马唐叶绿素含量随之
降低,且光照条件下,对叶绿素含量的影响远远大于
黑暗条件下。由此表明,光照促进了活性成份对叶
绿素的破坏作用。
表2 黄顶菊中除草活性成份对马唐叶绿素含量的影响
Table 2 The effect of herbicidal active ingredient fromF.bidentis(L.)Kuntze
on the content of chlorophyl in crab grass
处理浓度/
(μg·mL
-1)
Concentration
663nm吸光度
   OD663    
645nm吸光度
   OD645  
叶绿素含量/
(μg·mL
-1)Chlorophyl
相对破坏率/%
Relative damage rate
光照Light 黑暗Dark 光照Light 黑暗Dark 光照Light 黑暗Dark 光照Light 黑暗Dark
0  0.456aA  0.425aA  0.203aA  0.194aA  7.76aA  7.33aA - -
20  0.401bB  0.412bB  0.147bB  0.189bB  6.19bB  6.82bB  20.15cC  6.95cC
40  0.277cC  0.387bB  0.101cC  0.166cC  4.27cC  6.46cC  44.93bB  11.86bB
80  0.211cC  0.365cC  0.096cC  0.159cC  3.62cC  6.15cC  53.29aA  16.09aA
2.3.3 活性成份对马唐β-胡萝卜素的影响 光照
条件下,以水为对照处理的吸光度值为0.829,黑暗
条件下,以水为对照处理的吸光度值为0.869;在光
照条件下用浓度为20,40和80μg/mL的活性成份
处理的吸光度值依次为:0.092,0.050和0.039,而
黑暗条件下相同浓度处理的吸光度值依次为:
0.592,0.504和0.392。由此表明,在光照条件
下活性成份对马唐中β-胡萝卜素的破坏作用要强于
在黑暗条件下的处理(见表3)。
表3 黄顶菊中除草活性成份对马唐β-胡萝卜素含量的影响
Table 3 The effect of herbicidal active ingredient fromF.bidentis(L.)
Kuntze on the content of beta-carotene in crab grass
处理浓度/(μg·mL
-1)
Concentration
吸光度 OD
光照 Light 黑暗 Dark
水处理 0.829aA  0.869aA
20  0.092bB  0.592bB
40  0.050cC  0.504bB
80  0.039cC  0.392cC
2.3.4 活性成份对丙二醛和超氧自由基含量的影
响 用不同浓度的活性成份处理马唐后,用硫代巴
比妥酸显色法测定丙二醛含量,结果发现(见图3),
马唐中丙二醛含量随着活性成份浓度的增大而增
加,在相同的浓度下,光照处理丙二醛的含量要高于
黑暗处理。由此表明,活性成份在光照条件下,对膜
的氧化破坏作用要大于黑暗条件处理。
图3 活性成份对马唐丙二醛含量的影响
Fig.3 The effect of herbicidal active ingredient
第6期 李建强等:黄顶菊中除草活性成份Ⅱ作用机制的初步研究 73    
on the malondialdehyde in crab grass
通过测定光照和黑暗条件下,不同浓度的活性
成份处理马唐后的超氧阴离子自由基的含量发现
(见图4),在相同浓度处理下,光照条件下处理过的
马唐叶片超氧阴离子自由基的含量明显高于黑暗条
件下的处理。
图4 活性成份对马唐超氧自由基含量的影响
Fig.4 The effect of herbicidal active ingredient
on the superoxide radical in crab grass
2.3.5 除草活性成份处理马唐后含水量变化的测
定 用挥发物质处理后的马唐叶片,通过计算水分
亏损率,测定结果表明,对照为34.54%,用浓度
为40μg/mL的挥发物质0.5,1.0,2.0mL处理
马唐叶片,水分亏损率分别为42.91%,50.86%
和60.76%,可见水分亏损率随挥发物质量的增加
而增大。从而确定挥发物质处理确实影响马唐的水
分代谢,并且随着浓度的增大对水分代谢的影响也
越大。
2.3.6 除草活性成份处理马唐后吸水能力的变化
测定 通过 TTC法测定根系活力,结果发现,用
0.5,1.0,2.0mL挥发物质(40μg/mL)处理马唐
叶片后的吸光度值分别为0.102,0.082和0.028,
与对照(吸光度值0.185)相比,吸光度值越小,根系
受到的损伤越大,吸水能力越差,可以看出马唐的吸
水能力逐渐降低,而且随着挥发物质量增大吸水能
力越差。
3 讨论与结论
植物源农药的发展经历了一个很长的历史,古
代人民就开始利用植物或植物的某一组织来作为农
药使用[17],利用天然产物作为农药为农药的研发提
供新的先导结构或发现新的作用靶标。
从植物中获取具有生物活性物质的方法有很
多,其中利用水蒸气蒸馏是一种重要的方法。Ay-
inde Buniyamin Adesina等用水蒸气蒸馏的方法从
柠檬桉和红瓶刷树中得到了对乙酰胆碱有抑制作用
的挥发油[18];Abhay J等从生姜和土牛膝中利用水
蒸气蒸馏得到了对蚊子有生物活性的挥发油[19];
Weiquan Qin等采用水蒸气蒸馏从假蒟的叶子中获
得了对椰心幼虫有拒食作用和毒性的挥发油[20]。
本研究使用水蒸气蒸馏的方法从黄顶菊花中提取挥
发性物质,使黄顶菊花中一些沸点较低的物质随水
蒸气蒸馏出来,并使用有机溶剂进行萃取,但是利用
有机溶剂萃取出来的也只能是部分物质。
从植物组织中提取的除草活性组份种类繁多,
主要有香豆素类、有机酸、噻吩类、酚类、类黄酮类、
生物碱类、肉桂酸及其衍生物、苯嗪酮类、萘醌、蒽醌
和复合醌、腈类、脂肪族醛和酮、苯甲酸及其衍生物、
萜烯类、甾类化合物、单宁、硫化物和芥子油苷、噻嗯
聚乙炔类、氨基酸和多肽等[21-23]。它们的作用机理
也各不相同,其作用位点主要涉及对细胞膜、对线粒
体及叶绿体的影响等,作用方式主要影响呼吸作用、
光合作用、水分代谢、蛋白质和核酸合成、酶活性等。
本试验从黄顶菊中分离获得了除草活性成份Ⅱ,并
通过对马唐的丙二醛、超氧自由基、希尔反应、叶绿
素、电导率几个指标进行测定,初步确定了成份Ⅱ对
马唐的光合作用有影响,而关于其作用位点还有待
于进一步深入研究。
杂草抗药性的产生和发展对化学药剂除草造成
了很大的威胁,使杂草的化学防除面临着新的挑战,
寻求结构新颖、作用方式不同的新型除草剂显得更
为迫切。植物源农药的研究与开发是当前农药学领
域较为活跃的研究方向,一方面从植物中探寻新的
活性先导化合物,通过类推合成进行新农药的开发;
另一方面通过植物源活性物质作用机理的研究,探
寻新的作用靶标,利用生物合理设计开发新型环境
友好农药。高生物活性的天然化合物是研究新药所
需导向化合物的最重要来源,勿庸置疑,对植物源中
具有除草活性物质的构效关系和作用机理的深入研
究,将对环保型的除草剂的研发具有重要的意义。
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(编辑:李 川)