全 文 ：食用菌学报 2011.18(2):15～ 18
收稿日期:2010-10-19 原稿;2011-01-06 修改稿
基金项目:国家自然科学基金项目(编号:30972371)的部分研究内容
作者简介:郭　亮(1987-), 男 , 在读硕士研究生 , 研究方向为森林微生物。
＊本文通讯作者　E-mail:leu 0315@163.com
文章编号:1005-9873(2011)02-0015-04
基于形态特征和 ITS序列分析对湖南松菌的分类鉴定
郭　亮1 , 2 , 刘君昂1 , 2 , 3 , 周国英2 , 3＊ , 李　河2
(1中南林业科技大学生物技术中心实验室 ,湖南长沙 410004;2中南林业科技大学林学院 ,湖南长沙 410004;
3林业生物技术湖南省重点实验室 ,湖南长沙 410004)
摘　要:基于子实体及孢子的形态特征 ,结合 ITS序列分析对湖南省松林中分布最多的 4 种松菌进行分类鉴
定。样品 CSUFTHH1 、CSUFTHH2 、CSUFTZ J和 CSUFTHY 分别鉴定为乳菇属未知种(Lactarius sp.)、松乳
菇(L .deliciosus)、橙红乳菇(L .akahatsu)以及红汁乳菇(L .hatsudake)。
关键词:乳菇属;ITS序列;分类鉴定
　　湖南松菌是红菇科(Russulaceae)乳菇属
(Lactarius)几种真菌的统称 ,因生长在松树林里
而得名。这一类真菌与松树形成外生菌根[ 1 , 2] ,
对松树的生长具有重要意义 ,同时其子实体肉质
鲜嫩 ,美味可口 ,营养丰富 ,是一类天然 、无公害
的珍贵野生食(药)用菌。
松菌在湖南地区十分受欢迎 ,发生季节在当
地市场随处可见 , 因子实体形态和口味比较相
似 ,人们通常不加以区分 ,且常认为松菌即是松
乳菇(L .del iciosus)的俗名[ 3] 。本文作者考察了
湖南长沙 、怀化及吉首等地的野生菌市场 ,并通
过初步的形态学观察认为松菌就是松乳菇是不
正确的。为了规范松菌的命名 ,笔者基于形态特
征并结合 I TS 序列分析对湖南松树林中的几种
主要松菌进行分类鉴定。
1　材料与方法
1.1 材料
　　4个松菌子实体分别编号为 CSUFT HH1
(采自湖南省怀化市市郊松林)、CSUFT HH2
(采自湖南省怀化市凉亭坳镇松林)、CSUFTZJ
(采 自 湖 南 省 怀 化 市 芷 江 县 松 林)和
CSUFTH Y(采自湖南省吉首市花垣县城郊松
林)。现场观察样品子实体菌盖的颜色 、形状 ,
菌柄的颜色 、形状和大小 ,菌褶的颜色 、着生状
态;用刀片将子实体纵向剖开 ,观察菌肉 、乳汁
以及菌柄内部结构;然后迅速带回学校显微观
察孢子形态 。
1.2 DNA提取
　　以烘干子实体为材料 , 参照改进的 CTAB
法[ 4]提取总 DNA ,并作适当修改 。
1.3 ITS基因扩增及纯化
　　PCR反应引物:采用 ITS序列的通用引物对
(I TS4:TCCTCCGCT TA TTGATA TGC;ITS5 :
GGAAGTAAAAG TCG TAACAAGG)[ 5] 。
PCR反应体系(25 μL):10 ×缓冲液2 .5 μL ,
dNTP(2.5 mmoL/L)1 μL ,引物各 1 μL , Taq 酶
(5 U/μL)0 .25 μL , 模板 DNA 1 μL , ddH 2O
18.25 μL。
PCR反应条件:95 ℃变性5 min ;95 ℃变性
30 s ,56 ℃退火 30 s ,72 ℃延伸 1 min ,共 40 个
循环;72 ℃延伸 10 min ;4 ℃保存 。
PCR 扩增产物在含有 EB的 1.8%琼脂糖凝
胶中电泳(80 V ,3 h),将目的条带从琼脂糖凝胶
中切下 ,用Gel Extr action Mini Kit试剂盒回收 ,
具体操作步骤同说明书。将回收纯化后的扩增
产物在 1.8%琼脂糖凝胶中电泳(80 V , 3 h),分
析其浓度 , 并确定连接反应中外源插入片段
的量 。
1.4 测序
　　PCR产物双向测序委托上海桑尼生物科技
有限公司完成 。
DOI :10.16488/j.cnki .1005-9873.2011.02.008
食　用　菌　学　报 第 18 卷
1.5 系统进化树的构建与分析
　　通过前端引物与后端引物双向测序获得
ITS的完整基因序列 。用 ClustalW 软件对序列
进行对位排列 ,然后手工适当校正 ,排列中产生
的空位(gap)被处理为缺失(missing)。以红菇
(Russula vinosa)为外类群 ,应用 Mega 4 .1 软件
包[ 6] 计算它们相互间的碱基差异 , GenBank 数
据库中进行 BLAST 搜索 ,搜索并下载得到相似
度大于 99%的序列 ,使用 Kimura双参数模型构
建邻接系统发育树(NJ tree), 利用自展法
(Bootst rap , 1 000 次重复)检验各分支的置
信度 。
2　结果与分析
2.1 形态学鉴定
　　根据子实体样品菌盖的颜色 、形状 、大小 、乳
汁颜色以及孢子显微形态等特征 ,经湖南师范大
学真菌系统分类学专家张平副教授初步鉴定:样
品 CSUF THH1 为乳菇属未知种(Lactarius
sp .), CSUFTHH2 为松乳菇(L.del iciosus),
CSUFTZJ为橙红乳菇(L.akahatsu), CSUFTHY
为 红 汁 乳 菇 (L.hatsudake), 其 中 样 品
CSUFTHH1 与 NUYTINCK 等[ 7] 对种 Lacta-
rius sp .的描述极为相似 。具体形态学特征描述
如下:
CSUFTHH1 子实体土黄色 。菌盖直径
4.6 cm ,扁半球形 ,中央稍凹陷 ,无环纹 ,边缘整
齐;菌肉黄色 ,伤后不变色;菌褶较密 ,颜色鲜艳 ,
橙红色;伤后具乳汁 ,橙红色 ,接触空气后无明显
色变;菌柄 2 .5 cm ×φ1.2 cm ,圆柱形 ,颜色同菌
褶 ,表面有白色窝斑 。
孢子 7 .7 ～ 9.0 μm × 8.0 ～ 9.7 μm ,近球
形 ,表面有完整网纹 。
CSUFTHH2 子实体土黄色。菌盖直径
5.3 cm ,扁半球形 ,中央脐凹 ,后下凹 ,有浅同心
环纹;菌肉硬而脆 ,初白色 ,后胡萝卜黄色;菌褶
直生或稍延生 ,较密 ,近柄外分叉 ,褶间有横脉相
连;与菌盖同色 ,伤或老后呈绿色;乳汁桔红色 ,
伤后变绿色;菌柄 4 cm ×φ1.3 cm ,近圆柱形 ,中
空 ,颜色与子实体相同;气味清香。
孢子 6 ～ 7 μm×5 ～ 6 μm ,椭圆或近圆形 ,表
面有不完整网纹 。
CSUFTZ J子实体橙黄色 ,具有光泽。菌盖
直径 6 cm ,表面有薄膜 ,初中央凹陷 ,后变为近漏
斗状 ,湿时表面稍粘 ,有不明显的同心环纹;菌肉
橙黄色 , 伤后渐变绿色。菌褶稍延生 , 狭窄 ,稍
密 ,橙黄色 ,受伤部分变蓝绿色;乳汁呈鲜艳橙红
色 ,接触空气后变深酒红色 ,干后变为绿色;菌柄
3 cm ×φ2 cm ,圆柱形 ,内部中空 ,表面具不明显
浅凹 ,深橙黄色至鲜橙色或橙红色 ,与菌盖几乎
同色 ,有蓝绿斑 。
孢子 8.5 ～ 10 μm ×6.5 ～ 7 .5 μm ,椭圆形 ,
有细网纹 ,遇碘试剂变蓝(类淀粉质反应)。
CSUFTHY 子 实 体 红 褐 色 , 菌 盖 直 径
4.6 cm ,扁半球形 ,边缘内翻 ,整齐 ,中央稍有凹
陷 ,表面光滑 ,有颜色较深的同心环带;菌肉近
白色 。菌褶稍密 ,延生 ,分叉 ,与菌盖同色 ,伤后
变蓝绿色;乳汁血红色 , 后渐变蓝绿色;菌柄
3 cm ×φ1.5 cm , 圆柱形 ,中空 ,颜色较子实体
偏白 。
孢子 7.7 ～ 9.1 μm ×6 .0 ～ 6 .8 μm ,椭圆形 ,
有网纹。
2.2 ITS序列扩增 、系统进化树的构建与分析
　　样品 CSUFTH H1 、CSUFT HH2 、CSUFTZJ
和 CSUFT HY 的 I TS 序列 GenBank 登录号分
别为 HQ323351 、 HQ630671 、 HQ323367 和
HQ323340。4个样品的 ITS 序列间的差异性在
2.8%～ 4 .3%之间(表 1)。
表 1　4 个样品 ITS序列间的碱基替换率
Table 1　Genetic distance between different Lactarius
ITS sequences
CSUFTZJ CSUFTHY CSUFTHH1 CSUFTHH2
CSUFTZJ
CSUFTHY 0.031
CSUFTHH1 0.043 0.041
CSUFTHH2 0.028 0.029 0.043
　　CSUFTHH1 、 CSUFTHH2 、 CSUFTZJ 和
CSUFTHY 的 I TS序列系统发育树(图 1)分析结
果表明 ,4 个样品分别位于不同的进化枝中 ,其
中 , 样 品 CSUFTHH1 与 乳 菇 属 未 知 种
(Lactarius sp.)聚在一枝 , CSUFTHH2 与松乳
菇(L .del iciosus)聚在一枝 , CSUFTZJ 与橙红
乳菇(L .akahatsu)聚为一枝 , CSUFTHY 则与
红汁乳菇(L .hatsudake)表现出极近的亲缘关
系 ,Bootst rap支持率都接近 100%。结合样品子
实体和孢子形态学特征的鉴定结果 ,可确定样品
CSUFTHH2 、CSUFTZ J 和 CSUFTHY 分别为
16
第 2 期 郭　亮 ,等:基于形态特征和 ITS 序列分析对湖南松菌的分类鉴定
松乳 菇 (L . deliciosus )、橙 红 乳 菇 (L .
akahatsu)及 红 汁 乳 菇 (L . hatsudake );
CSUFTHH1 为乳菇属未知种(Lactarius sp .),
该种在乳菇属的分类中暂未给出正式命名。
进化枝上的数字表示 boo tst rap支持率 ,标尺表示枝长为 0.005
Numbers on l ines indicate boots tr ap support numbers;th e s cale bar r ep resen ts a 0.005 b ranch len gth
图 1　基于 ITS序列构建的 NJ 系统发育树
Fig.1　Phylogenetic tree based on ITS sequences
3　讨论
　　笔者考察了湖南长沙 、怀化及吉首等地的
野生菌市场 ,发现在湖南各地市场中最常见的
松菌是红汁乳菇 ,其次是橙红乳菇 ,而真正的松
乳菇则较少 ,说明通常称松菌的种类并非全都
是松乳菇 。
乳菇属的多个种因形态特征十分相似 ,基于
形态学特征的传统分类方法常常很难将某些种
准确区分 。NUYTINCK等[ 8] 曾用以 ITS序列和
gpd序列为基础的分子系统进化分析方法对乳菇
属全球范围内的 38 个种进行系统分类 。王云
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食　用　菌　学　报 第 18 卷
等[ 9]采用传统形态学手段进行研究 ,认为湖南松
菌应是红汁乳菇 。李河[ 10] 利用 ITS 序列鉴定出
组织分离菌株是红汁乳菇的纯菌种。熊涛等[ 11]
基于 I TS 序列对松乳菇组织分离菌株进行分子
鉴定 。李河等[ 12] 也曾利用 I TS 序列对湖南省 2
类乳菇属贸易种进行鉴别。目前认为结合形态
学特征与 ITS 序列分析结果进行真菌种的鉴定 ,
结果更可靠 、准确。
本研究通过测定样品的 ITS 区段的序列并
构建系统发育树 ,结合样品子实体和孢子形态
特征 ,对湖南松林中常见的几种松菌进行鉴定 ,
鉴定结果发现湖南主要分布的几种松菌为红汁
乳菇(L.hatsudake)、橙红乳菇(L .akahatsu)、
松乳菇(L .deliciosus)以 及乳菇 属未 知种
(Lactarius sp.)。其中橙红乳菇和松乳菇在形
态上非常相似 ,曾有日本学者提出它们应该是
相同种的不同命名[ 13] ,但本文分子鉴定结果表
明它们应属于两个不同的种。另外本研究表
明 , 4 个松菌样品为乳菇属的 4 个不同种 , 其
ITS序列间的相似性为95 .8 %～ 97.2%,该结
果与 RENSKE 等认为通过 ITS 区域比对 ,序列
相似性大于 95%且小于 99 %,鉴别为相同属[ 14]
的结论相吻合 。
参考文献
[ 1] EBERHARDT U , OBERWINKLER F , VERBE-
KEN A , et al.Lactarius ectomy-cor rhizae on Abies
alba: Morpholog ical desc ription , mo lecular
characteriza tion and taxonomic rema rks [ J] .
Mycolo gia , 2000 , 92(5):860-873.
[ 2] YAM ADA A , OGURA T , OHMASA M.
Cultiv ation o f mushrooms o f edible ectomy-co rrhizal
fung i asso ciated w ith Pinus densi f lora by in vitro
myco r rhizal synthesis.Morpho lo gy o f myco rrhizae in
open culture[ J] .Myco rrhiza , 2001 , 11:67-81.
[ 3] 刘建成 , 杜娟.湘西北松乳菇的分布及生态研究[ J] .
中国食用菌 , 1998 , 18(1):22-23.
[ 4] XU J , YOELL HJ , ANDERSON JB.An efficient
pro tocol for iso lating DNA f rom higher fungi[ J] .
T rends in Genetics , 1994 , 10:226-227.
[ 5 ] WHITE TJ , BRUNS T , LEE S , et al.
Amplification and direct sequencing of fungal
ribosomal RNA genes fo r phy lo genetics [ M ] .
California:Academic P ress , 1990.
[ 6] KUMAR S , NEI M , DUDLEY J , et al.MEGA:A
bio log ist-centric so ftwar e fo r evo lutiona ry analy sis o f
DNA and pro tein sequences [ J ] . Briefings in
Bioinfo rmatics , 2008 , 9:299-306.
[ 7] NUYTINCK J , WANG XH , VERBEKEN A.
Descriptions and taxonomy o f the Asian
r epresentativ es o f Lactari us sect.De liciosi [ J] .
Fungal Div ersity , 2006 , 22:171-203.
[ 8] NUYTINCK J , VERBEKEN A , MILLER SL.
Wor ldwide phylogeny o f Lactarius section Deliciosi
infer red from ITS and g ly ce raldehyde-3-pho sphate
dehydrogena se gene sequences [ J ] . Myco log ia ,
2007 , 99(6):820-832.
[ 9] 王云 ,谭著明 ,何兴元.湖南的松菌[ J] .食用菌学报 ,
2003 , 10(2):24-28.
[ 10] 李河.红汁乳菇组织分离株 ITS 序列验证[ J] .食用
菌学报 , 2008 , 15(2):7-10.
[ 11] 熊涛 , 肖满 , 曾哲灵 , 等.松乳菇组织分离菌株的
rDNA ITS 序列分子鉴定[ J] .微生物学通报 , 2006 ,
33(4):1-4.
[ 12] 李河 , 周国英 , 宋光桃.湖南省 2 类乳菇属贸易种
的分子鉴别[ J] .中南林业科技大学学报 , 2007 , 27
(4):95-99.
[ 13] IMAI S.Studies on the Aga ricaceae o f Japan.II.
Lactarius in Hokkaido [ J] .Bo tanical Magazine
(Tokyo), 1935 , 49:603-610.
[ 14] RENSKE L , LEEFLANG P , KUYPER TW , et al.
Molecular identifica tion o f ectomyco rrhizal mycelium
in soil ho rizons[ J] .Appl Environ M icrobiol , 2003 ,
69(1):327-333.
18
第 2 期 郭　亮 ,等:基于形态特征和 ITS 序列分析对湖南松菌的分类鉴定
Identification and Classification of Lactarius
section Deliciosus Strains from Hunan Province Based
on Morphological Features and ITS Sequencing
GUO Liang
1 , 2 , LIU Jun ang1 , 2 , 3 , ZHOU Guoying2 , 3＊ , LI He2
(1Biotechnology Core Facilities , Centr al South University of Forest and Technology , Ch angsha ,
Hunan 410004 , China;2 College of Forestr y , Centr al South University of Forest and Technology ,
Ch angsha , Hunan 410004 , China;3Hunan Provincial key Laboratory of Forestr y Biotechnology ,
Changsha , H unan 410004 , China)
Abstract:Four Lactarius str ains , CSUFTHH1 、CSUFTHH2 、CSUFTZ J and CSUFTHY , were collected from
Hunan Province and identified as Lactarius sp., L .deliciosus , L .akahatsu and Lactarius hatsudake ,
respectively on the basis of fr uit body and spore morphology , and ITS sequencing da ta.
Key words:Lactarius ;ITS sequence;identif ica tion and classif ica tion
[本文编辑] 　于荣利
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