全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2015，27:1374-1378
文章编号:1001-6880(2015)8-1374-05
收稿日期:2015-04-14 接受日期:2015-06-12
基金项目:浙江省海洋生物技术产业创新团队(20121009-2);宁波
市海洋藻类资源高效开发利用创新团队(2011B81007);国
家自然科学基金(41406163)
* 通讯作者 Tel:86-574-8760-0458;E-mail:zhangjinrong@ nbu． edu． cn
Folin-Ciocalteu比色法测定铜藻中褐藻多酚含量的研究
段海霞，林云霞，张金荣* ，严小军，骆其君
宁波大学海洋学院 教育部应用海洋生物技术重点实验室，宁波 315211
摘 要:以没食子酸为标准品，使用福林酚(Folin-Ciocalteu)试剂，通过紫外-可见分光光度法，对铜藻中褐藻多
酚的含量进行了测定。结果表明，测定波长为 760 nm，显色试剂 Folin-Ciocalteu 的用量为 1． 25 mL，0． 1 g /mL
Na2CO3 溶液用量为 4． 0 mL，定容至 10 mL，显色温度为 30 ℃，反应时间为 60 min，多酚含量在 15 ～ 50 μg /mL范
围内与吸光度呈良好线性关系，回归方程为 Y = 0． 0138X + 0． 0267，Ｒ2 = 0． 9993。本测定方法的平均回收率为
96． 18%，相对标准偏差(ＲSD)为 2． 44%。该方法的稳定性、重现性、精密度以及加标回收率的相对标准偏差均
符合要求，可用于铜藻中褐藻多酚含量的测定。按照本方法测定铜藻中褐藻多酚的平均含量为 17． 36 mg /g
(ＲSD = 1． 25 %)。
关键词:铜藻;褐藻多酚;福林酚
中图分类号:Ｒ284． 1 文献标识码:A DOI:10． 16333 / j． 1001-6880． 2015． 08． 011
Determination of Phlorotannins in Sargassum horneri
Using Folin-Ciocalteu Colorimetric Method
DUAN Hai-xia，LIN Yun-xia，ZHANG Jin-rong* ，YAN Xiao-jun，LUO Qi-jun
Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology，Ministry of Education，School of
Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China
Abstract:With gallic acid as the standard，the content of phlorotannins in Sargassum horneri was determined by UV-visi-
ble spectrophotometric method using Folinphenol (Folin-Ciocalteu)． The detection wavelength was set at 760 nm． The
color reaction was carried out with 1． 25 mL of Folin-Ciocalteu reagent and 4． 0 mL of 0． 1 g /mL aqueous Na2CO3 solu-
tion in darkness at 30 ℃ for 60 min． The linear range of the established standard curve was 15-50 μg /mL and the re-
gression equation was Y = 0． 0138X + 0． 0267，Ｒ2 = 0． 9993． The average recovery rate of the added sample was 96．
18%，with relative standard deviation (ＲSD)of 2． 44% ． The ＲSDs of stability，reproducibility，precision and recovery
rate of the developed method were all satisfactory． Thus，this method can be applied to determine phlorotannins of S． hor-
neri． The average content of phlorotannins in S． horneri was 17． 36 mg /g (ＲSD = 1． 25%)．
Key words:Sargassum horneri;phlorotannins;Folin-Ciocalteu reagent
铜藻(Sargassum horneri)，又名丁香屋，隶属圆
子纲(Cyclospreae)、墨角藻目(Fucales)、马尾藻科
(Sargassaceae)、马尾藻属(Sargassum)，为北太平洋
西部特有的暖温带性海藻。铜藻在我国沿海分布广
泛，是暖温带海域营造海洋牧场，进行生物修复海洋
生态的首选品种［1］。铜藻作为海藻工业的优质原
料，已广泛用于食品、饲料工业，具有较高的商业价
值［2，3］。近年来，随着我国海藻资源开发利用研究
的快速发展，铜藻因富含多糖、褐藻多酚、岩藻黄素
等多种生物活性物质而引起了人们的广泛关注，但
对其中褐藻多酚的研究不多［4］。褐藻多酚(phloro-
tannins)是海洋褐藻中重要的次级代谢产物，化学结
构上是一类以间苯三酚为基础骨架的独特的多酚类
化合物，其聚合度可以几个至几百个，并具有抗氧
化、抗菌、抗病毒、抗心血管疾病、抗糖尿病综合症、
保肝等多种生物活性［5-7］。严小军等以 Folin-Denis
法测定了中国常见海藻的褐藻多酚含量，并研究了
褐藻多酚含量随海藻生长及季节的变化规律［8］。
目前，植物多酚含量测定的最常见方法———Fo-
lin-Ciocalteu比色法［9-11］。鉴于褐藻多酚的化学结
构类型为多酚类化合物，故本研究选择 Folin-Ciocal-
teu比色法进行铜藻中褐藻多酚的含量测定。以没
食子酸为标准品，分别考察检测波长、显色温度、显
色时间、Folin-Ciocalteu试剂和碱液用量等测定条件
对 Folin-Ciocalteu比色法的影响，确定 Folin-Ciocal-
teu比色法测定铜藻中褐藻多酚含量的最优条件，为
铜藻中褐藻多酚提取工艺的研究提供理论依据。
1 材料与仪器
1． 1 材料
新鲜铜藻于 2013 年 5 月采自浙江温州南麂岛，
样品 由 宁 波 大 学 骆 其 君 教 授 鉴 定，编 号 为
NJD20130501，保存于宁波大学海洋学院。
1． 2 仪器
752N紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪
器有限公司);HH-4 数显恒温水浴锅(常州国华电
器有限公司);SB4200D超声波清洗机(宁波新芝生
物科技股份有限公司);BSA124S-CW 电子天平(北
京赛多利斯科学仪器有限公司);超纯水仪(Pall 公
司);ＲXZ-380B型智能人工气候箱(宁波江南仪器
厂);移液器(德国 Eppendorf 公司);1 cm 石英比色
皿(上海尤尼柯仪器有限公司)。
1． 3 试剂
Folin-Ciocalteu 试 剂 (Sigma 公 司，批 号
BCBL4436V);没食子酸标准品(Sigma 公司，批号
AGM01-HOSS);其余试剂均为国产分析纯。
2 实验方法
2． 1 没食子酸标准溶液的配制
精密称取没食子酸对照品 0． 100 g，用重蒸馏水
完全溶解并定容至 100 mL，配成质量浓度 1000 μg /
mL没食子酸储备溶液(现配)。
2． 2 没食子酸工作液的配制
用移液管分别移取 1． 5、2． 0、2． 5、3． 0、3． 5、
4. 0、4． 5、5． 0 mL的没食子酸标准储备液于 100 mL
容量瓶中，分别加水定容至刻度，摇匀，配置质量浓
度分别为 15、20、25、30、35、40、45、50 μg /mL的没食
子酸工作液，待用。
2． 3 供试品溶液的制备
称取新鲜铜藻 1． 000 g于锥形瓶中，加入 50 mL
60%(V /V)乙醇溶液，40 ℃超声提取 30 min，过滤
至 50 mL容量瓶，加 60%乙醇定容至 50 mL，待用。
2． 4 Folin-Ciocalteu法测定褐藻多酚的比色条件优
化
2． 4． 1 检测波长的选取
精密量取没食子酸工作液(50 μg /mL)、供试品
溶液 1． 0 mL 于 10 mL 容量瓶中，分别加水稀释，加
1． 25 mL Folin-Ciocalteu 试剂，混匀，3 min 后加入
4. 0 mL 0． 1 g /mL Na2CO3 溶液，加水定容至 10 mL，
混匀，30 ℃避光反应 60 min，以试剂空白为对照，在
400 ～ 800 nm范围内扫描确定最大吸收波长。
2． 4． 2 显色温度的考察
精密量取没食子酸工作液(50 μg /mL)1． 0 mL，
加水稀释，加入 Folin-Ciocalteu试剂 1． 25 mL，混匀，
3 min后加入 4． 0 mL 0． 1 g /mL Na2CO3 溶液，加水
定容至 10 mL，混匀，分别于 15、20、25、30、35、40 ℃
条件下避光反应 60 min，以试剂空白为对照，在 760
nm处测定溶液吸光值，以考察反应温度对比色效果
的影响。
2． 4． 3 显色时间的影响
取没食子酸工作液(50 μg /mL)1． 0 mL，加水稀
释，加入 Folin-Ciocalteu 试剂 1． 25 mL，混匀，3 min
后加入 4． 0 mL 0． 1 g /mL Na2CO3 溶液，加水定容至
10 mL，混匀，30 ℃分别避光反应 30、60、90、120、
150、180 min，以试剂空白为对照，在 760 nm 处测定
溶液吸光度，以确定显色完全的最佳时间。
2． 4． 4 Folin-Ciocalteu试剂的加入量
取没食子酸工作液(50 μg /mL)1． 0 mL，加水稀
释，分别加入 0． 75、1． 0、1． 25、1． 5、1． 75 mL Folin-
Ciocalteu 试剂，混匀，3 min后加入 4． 0 mL 0． 1 g /mL
Na2CO3 溶液，加水定容至 10 mL，混匀，30 ℃避光反
应 60 min，以试剂空白为对照，在 760 nm 处测定溶
液吸光度，以考察 Folin-Ciocalteu试剂用量对显色效
果的影响。
2． 4． 5 Na2CO3 溶液用量的确定
取没食子酸工作液(50 μg /mL)1． 0 mL，加水稀
释，加 Folin-Ciocalteu试剂 1． 25 mL，混匀，3 min，分
别加入 3． 2、4． 0、4． 8、5． 6、6． 4 mL 0． 1 g /mL Na2CO3
溶液，加水定容至 10 mL，混匀，30 ℃避光反应 60
min，以试剂空白为对照，在 760 nm处测定溶液吸光
度，考察 Na2CO3 溶液用量对吸光度的影响。
2． 5 标准曲线的绘制
精密量取不同浓度的没食子酸工作液各 1． 0
mL于 10 mL的容量瓶中，加水稀释，分别加入 1． 25
mL Folin-Ciocalteu试剂，混匀，3 min 后加入 0． 1 g /
mL Na2CO3 溶液 4． 0 mL，加水定容至 10 mL，混匀，
30 ℃避光反应 60 min，以试剂空白为对照，在 760
5731Vol. 27 段海霞等:Folin-Ciocalteu比色法测定铜藻中褐藻多酚含量的研究
nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，没食子酸溶
液质量浓度为横坐标绘制标准曲线，褐藻多酚含量
以没食子酸标准品计。
2． 6 Folin-Ciocalteu法测定铜藻中褐藻多酚的方法
学评价
2． 6． 1 稳定性实验
精密量取同一铜藻供试品溶液按 2． 4 的测定条
件，分别在样品液与显色剂反应完全(60 min)后的
0、30、60、90、120 min 测定吸光度，以评价该方法在
一段时间内的稳定性。
2． 6． 2 重现性实验
分别取同一铜藻样品 5 份，依 2． 3 的方法制备
供试品溶液，分别测定其多酚含量，计算结果的相对
标准偏差(ＲSD)，以评价该方法的重现性。
2． 6． 3 精密度实验
采用优化的 Folin-Ciocalteu 比色法对同一铜藻
供试液测定 5 次，并计算结果的相对标准偏差
(ＲSD)，以评价该方法的精密度。
2． 6． 4 加标回收实验
精密量取已知含量的铜藻供试品溶液 0． 5 mL，
6 份，分别加入 1000 μg /mL 没食子酸工作液 0． 14、
0． 14、0． 17、0． 17、0． 20、0． 20 mL，加水稀释，混匀，加
入 Folin-Ciocalteu试剂 1． 25 mL，混匀，3 min 后加入
4． 0 mL 0． 1 g /mL Na2CO3 溶液，加水定容至 10 mL，
混匀，30 ℃避光反应 60 min，分别测定混合样品中
褐藻多酚含量，并计算其回收率和相对标准偏差，以
评价该分析方法的准确性和可靠性。
2． 7 含量测定
精确量取 2． 3 中的铜藻供试液 1． 0 mL，5 份，加
水稀释，混匀，加入 Folin-Ciocalteu 试剂 1． 25 mL，混
匀，3 min后加入 4． 0 mL 0． 1 g /mL Na2CO3 溶液，加
水定容至 10 mL，混匀，30 ℃避光反应 60 min。反应
完全后，利用紫外-可见分光光度计，于 760 nm 下测
定体系吸光值，根据没食子酸标准品所得标准曲线，
计算铜藻供试液中褐藻多酚的含量，公式如下:
褐藻多酚含量(mg /g) = C × V /m
式中，C:铜藻供试液中多酚浓度(mg /mL);V:
铜藻供试液总体积(mL) ;m:铜藻质量(g)。
3 结果与分析
3． 1 检测波长的确定
多酚类物质与 Folin-Ciocalteu 试剂反应显色是
基于 Folin-Ciocalteu试剂中的钨钼酸能将多酚化合
物定量氧化，自身被还原，生成蓝色物质，在 680 ～
780 nm有较大吸收，测定显色反应后溶液的紫外-
可见吸收光谱，选择最大吸收波长作为比色法的测
定波长。图 1 为没食子酸工作液(50 μg /mL)和供
试品溶液分别与 Folin-Ciocalteu 试剂显色后的全波
长扫描图，由图 1 可知，两者均在 760 nm 处有最大
吸收，故选择 760 nm为检测波长。
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
吸
光
值
Ab
so
rb
an
ce a
b
c
400% 450% 500% 550% 600% 650% 700% 750% 800
波长
Wavelength(nm)
图 1 没食子酸(a)、供试品(b)和试剂空白(c)分别与
Folin-Ciocalteu试剂显色后的全波长扫描
Fig. 1 Scanning spectra of gallic acid (a)，testing solutions
(b)and sample blank (c)reacted with Folin-Cio-
calteu reagent
3． 2 显色温度和时间的确定
吸
光
值
Ab
so
rb
an
ce
15% 20% 25% 30% 35% 40
反应温度
Reaction%temperature(℃)
0.80
0.75
0.70
0.65
0.60
0.55
0.50
0.40
图 2 吸光度随反应温度的变化
Fig. 2 The absorbance at different reaction temperatures
酚类化合物与 Folin-Ciocalteu 试剂反应需要一
定显色温度和时间才能显色完全。由图 2 可知，没
食子酸标准溶液在不同温度条件下显色，显色温度
对比色效果影响较大，反应温度过低、过高均不利于
多酚显色。当温度低于 30 ℃时，吸光度较小。30
℃显色，反应 60 min时，吸光度达到最大，吸光值为
0． 705。35 ～ 40 ℃，显色 60 min时，吸光度逐渐减
吸
光
值
Ab
so
rb
an
ce
25% 50% 75
反应时间
Reaction%time(min)
0.80
0.75
0.70
0.65
0.60
0.55
0.50
0.45
0.40
100%125%150%175%2000
图 3 吸光度随反应时间的变化
Fig. 3 The absorbance at different reaction times
6731 天然产物研究与开发 Vol. 27
小。说明温度高能加快显色进程，但是温度过高，反
应体系的稳定性较差。综合考虑显色的完全程度和
反应体系的稳定性，确定显色温度为 30 ℃。
没食子酸标准溶液在不同温度条件下显色，达
到最大吸光度的时间有差异。由图 3 可知，没食子
酸标准溶液与 Folin-Ciocalteu 试剂在 30 ℃条件下，
避光反应，显色时间 60 min 内，随着时间的延长，吸
光度增大。当显色 60 min时体系吸光度达到最大。
显色 60 min 后，体系吸光度变化很小，表明显色反
应基本完全，显色体系稳定性很好。因此，确定 Fo-
lin-Ciocalteu比色法的反应时间为 60 min。
综上所述，确定 Folin-Ciocalteu比色法测定褐藻
多酚含量的显色温度为 30 ℃，显色时间为 60 min。
吸
光
值
Ab
so
rb
an
ce
Folin-ciocaltcu试剂用量
Folin-ciocaltcu%amount(mL)
0.80
0.75
0.70
0.65
0.60
0.55
0.50
0.45
0.40
0.50%0.75%1.00%1.25%1.50%1.75%2.00
图 4 吸光度随 Folin-Ciocalteu试剂用量的变化
Fig. 4 The absorbance at different addition amounts of Fo-
lin-Ciocalteu reagent
3． 3 Folin-Ciocalteu 显色剂和 Na2CO3 加入量的确
定
Folin-Ciocalteu 显色剂的用量对显色效果具有
较大影响，由图 4 可知，Folin-Ciocalteu 试剂用量在
0． 75 ～ 1． 75 mL内，随着显色剂用量的增加，测得的
吸光度增加;当 Folin-Ciocalteu 试剂加入量为 1． 25
mL，吸光度达到最大，吸光值为 0． 707。当显色剂用
量超过 1． 25 mL 后，吸光度略有下降。因此，确定
Folin-Ciocalteu试剂的加入量为 1． 25 mL。
吸
光
值
Ab
so
rb
an
ce
10%Na2CO3溶液用量
10%Na2CO3%solution%amount(mL)
0.80
0.75
0.70
0.65
0.60
0.55
0.50
0.45
0.40
3.0%3.5%4.0%4.5%5.0%5.5%6.0%6.5%7.0
图 5 吸光度随 10% Na2CO3 溶液加入量的变化
Fig. 5 The absorbance at different addition amount of 10%
Na2CO3 solution
酚类化合物与 Folin-Ciocalteu 试剂反应必须在
碱性条件才可以显色，反应体系中 Na2CO3 溶液是
显色的支持介质。由图 5 可知:随着 Na2CO3 用量
的增加，体系吸光度逐渐升高，当 Na2CO3 用量为
4. 0 mL 时，吸光度达到最大。但进一步增加
Na2CO3 溶液吸光度变化幅度不大，因此确定 0． 1 g /
mL Na2CO3 溶液的加入量为 4． 0 mL。
3． 4 标准曲线的绘制
精密量取不同浓度的没食子酸工作液各 1． 0
mL，按照 2． 4 确定的最优比色条件绘制标准曲线，
得线性回归方程为 Y = 0． 0138X + 0． 0267，相关系数
Ｒ2 = 0． 9993。表明没食子酸质量浓度在 15 ～ 50
μg /mL范围内，与其吸光值呈良好的线性关系，符
合朗伯-比尔定律，可用于铜藻中褐藻多酚的含量测
定。
3． 5 Folin-Ciocalteu法测定褐藻中褐藻多酚的方法
学评价
稳定性实验:对 Folin-Ciocalteu比色法测定的铜
藻中的褐藻多酚进行稳定性实验，反应完全后在 30
℃下避光放置 0、30、60、90、120 min 后测定吸光值，
其吸光值分别为 0． 508、0． 501、0． 499、0． 512、0. 499，
结果表明随着时间的延长，吸光度值略有下降，但幅
度不大，相对标准偏差(ＲSD)为 1． 169%，表明 120
min内溶液稳定性良好。
精密度实验:对 Folin-Ciocalteu比色法测定的铜
藻中的褐藻多酚进行精密度实验，同一样液测定 5
次，吸光值分别为 0． 487、0． 491、0． 510、0． 497、
0. 497，其相对标准偏差(ＲSD)为 1． 754%，表明该
方法具有较高的精密度，能够满足样液分析的要求。
重现性实验:对 Folin-Ciocalteu比色法测定的铜
藻中的褐藻多酚进行重现性实验，取同一批铜藻样
品 5 份，各 1． 0 g，精密称定，按 2． 3 的方法，分别测
定吸光度，吸光值分别为 0． 488、0． 492、0． 498、
0. 499、0． 502，其相对标准偏差(ＲSD)1． 145%，表明
该方法具有良好的重现性。
加标回收率试验:按照 2． 6 的方法进行加标回
收试验，由表 1 可以看出采用 Folin-Ciocalteu比色法
测定铜藻中褐藻多酚的加标试验中，回收率最高的
为 99． 36%，最低为 92． 50%，平均回收率 96． 18%，
其 ＲSD为 2． 44%。结果表明，该方法具有较高的准
确性和可靠性，可以用于铜藻中褐藻多酚含量的测
定。
3． 6 铜藻中褐藻多酚的含量
按照 2． 7 中的方法测定铜藻中褐藻多酚的含量
分别为 17． 44、17． 58、17． 08、17． 18、17． 51 mg /g，其
7731Vol. 27 段海霞等:Folin-Ciocalteu比色法测定铜藻中褐藻多酚含量的研究
表 1 加标回收率试验结果
Table 1 Ｒesults of recovery experiment
编号
No．
已知含量
Original (μg)
加入量
Added (μg)
测量值
Detected (μg)
回收率
Ｒecovery
rate (%)
平均回收率
Average recovery
rate (%)
ＲSD(%)
1 174． 13 140 306． 74 94． 72
2 174． 86 140 313． 96 99． 36
3 171． 23 170 328． 48 92． 50 96． 18 2． 44
4 171． 96 170 335． 72 96． 33
5 170． 51 200 364． 71 97． 10
6 169． 09 200 364． 71 97． 09
平均含量为 17． 36 mg /g(ＲSD = 1． 25%)。
4 结果与讨论
综上所述，考虑影响多酚含量测定的主要因素:
检测波长、显色温度、显色时间、Folin-Ciocalteu 试剂
和碱液用量，确定 Folin-Ciocalteu比色法测定铜藻中
褐藻多酚含量的测定条件为:精密量取铜藻供品溶
液 1． 0 mL，加水稀释，加 1． 25 mL Folin-Ciocalteu 试
剂，混匀，3 min后加入 4． 0 mL 0． 1 g /mL Na2CO3 溶
液，加水定容至 10 mL，混匀，30 ℃避光反应 60 min，
以试剂空白为对照，在 760 nm 波长处测定吸光度。
方法学实验证明该方法具有操作简单、精密度高、稳
定性好、准确可靠等优点，可用于铜藻中褐藻多酚含
量的测定。
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