全 文 ：昆虫 分 类学 报
Entomotaxonomia
Vol. 25, No. 1
Ma rch, 2003
中国油葫芦属昆虫的 RAPD分析
(直翅目: 蟋蟀总科: 蟋蟀科 )
李　恺 1 , 郑哲民 2
( 1. 华东师范大学生命科学学院 , 上海 200062;
2. 陕西师范大学动物研究所 , 陕西 西安 710062)
摘要: 用 RAPD技术研究了我国油葫芦属 Teleogryllus 5种蟋蟀的系统发生关系。研
究中使用了 15个标本 ,在所试用的 54种随机引物中 ,有 9种引物能扩增出清晰而稳
定的多态性片断 ,多态性片断共计 167条。 应用 U PGM A法对多态性片断进行聚类
分析 ,构建树状图 ,推测其系统发生关系。每一种蟋蟀先各自聚为一类 ,聚类结果所呈
现的属内种间关系与传统分类研究结果基本一致 ,且支持黑脸油葫芦与黄脸油葫芦
为独立种的观点。
关键词: 直翅目 ; 蟋蟀科 ; 油葫芦属 ; RAPD; 系统发生关系
中图分类号: Q969. 26+ 3. 4　　　文献标识码: A
文章编号: 1000- 7482( 2003) 01- 0009- 05
油葫芦属 Teleogryl lus是 Chopard于 1961年从 Gryllus属中分出的一属 ,本属全世
界已知有 55种 ,中国已知 7种 ,其中 2种分布于台湾 ,中国大陆分布 5种。油葫芦是常见
的一类蟋蟀 ,由于近缘种现象较为普遍 ,许多学者对其分类归属意见分歧 ,因此 ,油葫芦属
分类还较为混乱 ,出现许多同物异名现象和异物同名现象。目前 ,关于本属的系统学研究
主要以形态学性状为依据。 RAPD(随机扩增多态性 DNA)技术是 Williams和 Welsh等
分别于 1990年报道的一项 DNA多态性检测技术 ,由于其具有简便、快捷等特点 ,被广泛
应用于种属分类鉴定、基因图谱构建、以及物种亲缘关系和系统进化的研究。我们运用
RAPD技术对中国油葫芦属主要种类的基因组 DNA多态性进行了分析 ,在分子水平对
我国该属蟋蟀间的系统发生关系作初步探讨。
1　材料和方法
1. 1　实验材料
本研究所用实验材料均为 100%酒精浸泡标本 ,种类、数量、采集地点及时间详见表
1。
收稿日期: 2002-07-15
基金项目: 国家自然科学基金项目 ( 3957010)
9
1. 2　基因组 DN A的提取
参照田英芳等 ( 1999)昆虫基因组 DNA提取方法。
1. 3　 DN A提取物的检测
用两种方法: 凝胶电泳检测 ( 1%琼脂糖 )和紫外分光光度计检测。
1. 4　 RAPD-PCR扩增及电脉
根据预实验中对 PCR各组分的优化结果 ,扩增反应体系的组分如下:反应总体积为
25μL,含 0. 12 mmo l. L-1 dN T P, 1× buf fer, 1. 5mmol. L-1 MgCl2 , 20ng引物 , 2. 5U Taq
DN A聚合酶 (上海 Sangon公司 )及 25- 50ng模板 DNA。
反应程序为: 94℃预变性 1min45sec, 94℃变性 30sec, 37℃退火 1min, 72℃延伸
2min,共 45个循环 ,最后 1个循环后在 72℃延伸 10min。
扩增产物用含有 0. 05%溴化乙锭的 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测 ,电泳缓冲液为 0. 5
× TBE,输出电压 50v ,电泳约 2h,紫外透射仪上观察并拍照。
PCR扩增仪使用美国 Thermdyne Am li t ron II型 ,所用随机引物为上海 Sangon生物
工程公司合成。
表 1. 实验材料 List of species and locality of samples
种　　名 数量 采集时间 采集地点 样品号
黄脸油葫芦 T . emma ( Ohmachi et
Matsumura)
3♂♂ 2001-Ⅷ -26 陕西西安 A1-3
北京油葫芦 T . mitratus ( Burmeister ) 3♂♂ 2000-Ⅷ -03 广西陇瑞 B1-3
黑脸油葫芦 T . occipitalis ( Serv ille) 3♂♂ 2000-Ⅶ -31 广西十万大山 C1-3
污褐油葫芦 T . testaceus ( Walker) 3♂♂ 2000-Ⅷ -06 广西陇瑞 D1-3
银川油葫芦 T . infernalis ( Saussure) 3♂♂ 1999-Ⅷ -20 甘肃清水县黄行乡 E1-3
1. 5　 RAPD结果分析
根据记录和电泳照片计数清晰可辨的扩增片断 ,用数字“ 1”、“ 0”表示扩增片断的有或
无 ,从而获得原始数据矩阵。利用统计软件 SPSS10. 0中的形状 ( Shape)距离计算两标本
间的遗传距离指数 ,得出距离矩阵。然后 ,用 M EGA2. 1中的 UPGMA法对此矩阵作聚类
分析。
2　结果
2. 1　引物筛选及 RAPD扩增结果
研究共使用 54种随机引物 ,经筛选有 9种引物 S8、 S83、 S142、 S4、 S50、 S61、 S97、
S55、 S379可产生稳定且重复性良好的扩增带 ,其碱基序列及扩增带数见表 2。
10 昆　虫　分　类　学　报 第 25卷第 1期
表 2. 随机引物序列及扩增带数
List of sequence of primers and numbers of RAPD bands
引物 引物序列 ( 5’ 3’ ) 扩增带数 引物 引物序列 ( 5’ 3’ ) 扩增带数
S4 GGACTGGAGT 22 S83 GAGCCCTCCA 14
S8 GTCCACACGG 15 S97 ACGACCGACA 20
S50 GGTC TAC ACC 17 S142 GGTGCGGGAA 19
S55 CATCCGTGC T 21 S379 CAC AGGCGGA 20
S61 TTCGAGCCAG 19 合计 167
　　图 1　引物 S8对油葫芦属 5个种的 RAPD扩增结
果 ( Amplifi cation of genemic DN A of 5 species of the
genus Teleogryl lus using p rimer S8) . 1, 10. 分子量标
记 (λDNA /Eco R1+ HindIII) ; 2～ 4. 黄脸油葫芦 T .
emma; 5～ 7. 北京油葫芦 T . mitratus; 8, 9, 11. 黑脸油
葫芦 T . occipitali s; 12～ 14. 污褐油葫芦 T . testaceus;
15～ 17. 银川油葫芦 T . infernal is; 18. 阴性对照 ( neg-
ative con t rol )
从表 2可见 , 9种随机引物总扩增带数
为 167,平均每个引物扩增带数为 18. 6条。
扩增带数最多的为 S4,为 22条 ;扩增带数最
少的为 S83,为 14条。不同引物扩增产物有
显著差异。引物 S8对 5种油葫芦 15个个体
的扩增图谱如图 1所示。
2. 2　聚类分析结果
根据个体间的遗传距离 ,用 U PGM A法
对所有个体之间的关系进行聚类分析 ,构建
了聚类图 (图 2)。
从油葫芦属 5种 15个个体的聚类图 (图
2)可见:每一种蟋蟀先各自聚为一类 ,聚类结
果显示: 黑脸油葫芦与黄脸油葫芦的亲缘关
系最近 ,银川油葫芦与前 2种有较近的亲缘
关系 ,而北京油葫芦和污褐油葫芦与前 3者
的亲缘关系较远 ,污褐油葫芦与其它油葫芦
亲缘关系最远。
3　讨论
油葫芦是常见的一类蟋蟀 ,主要通过颜
面和外生殖器特征进行识别。 因油葫芦同种
不同个体的体色、大小等有一定差异 ,还存在
一些过渡类型 ,有时从形态上很难鉴别。如黑脸油葫芦与黄脸油葫芦在外形上很相近 ,只
有颜面和颊颜色不同: 黑脸油葫芦的为黑色 ,黄脸油葫芦的为黄色 ,但黑脸油葫芦也有黄
面型 ,且它们的雌性难以区分 ,因此这两种常常被混淆。从图 2所示的聚类结果来看 ,同种
不同个体均首先聚在一起 ,这说明同种不同个体之间虽然存在差异 ,但个体差异小于种间
差异。同时也表明实验中建立的 RAPD反应体系较为稳定 ,可用于分类和进化的研究。研
112003年 3月 李恺等: 中国油葫芦属昆虫的 RAPD分析
究结果表明 ,黑脸油葫芦与黄脸油葫芦的亲缘关系最近 ,但它们在较高水平相聚 ,两者应
为独立种 ;银川油葫芦与它们有较近的亲缘关系 ,这 3种油葫芦头部复眼内缘具有明显的
淡色斑点或条纹 ;而北京油葫芦和污褐油葫芦与前 3种的亲缘关系较远 ,这 2种油葫芦体
较大 ,头部沿复眼内缘无淡色斑纹 ;污褐油葫芦是这几种油葫芦中分化程度最高的一种 ,
与其他 4种油葫芦亲缘关系最远。聚类结果所显示的属内种间关系与传统形态分类方法
所得的结果基本一致。这一结果也证明了 RAPD技术在属内种间系统学的研究中具有很
大的实用性 ,同时也在解决传统方法难以区分的近缘种问题上具有很大的优越性。
　　图 2　油葫芦属 5种蟋蟀的 UPGM A聚类图 (代号同表 1) Dendrogram of 5 species of the g enus Teleogryl lus
using UPGM A ( see table 1 for explanation of code)
参 考 文 献
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RAPD Study of the Genus Teleogryllus
(Orthoptera: Grylloidea: Gryllidae) from China
LI Kai
1
, ZHENG Zhe-min
2
( 1. School of Lif e Science , East China Normal University , Shanghai 200062, China;
2. Institute of Zoology , Shaanx i Normal University , X i’ an, Shaanx i 710062, China )
The phylo genetic rela tionship o f 5 species of the genus Teleogry llus f rom China w as
studied by means of RAPD technique. To tals o f 15 samples of Teleogryllus were used in
this study. Among 54 arbi t ra ry primers ( 10 bp) predetermined optimal reaction condi-
tions, 9 primers were info rmativ e and yielded a total of 167 clea r and reproducible
bands. The phylog enetic rela tionships w ere inferred by using U PGM A based on RAPD
makers. Individuals of the same species clustered respectiv ely fi rst. The result of RAPD
analysis was simi lar to the one by using mo rphological characters, and ag reed wi th the
idea that T. emma ( Ohmachi et Ma tsumura) and T . occipitalis ( Serville) are tw o inde-
pendent species.
Key words: O rthopte ra; Gryllidae; Teleogry llus; RAPD; phylog enetic r ela tionship
132003年 3月 李恺等: 中国油葫芦属昆虫的 RAPD分析