全 文 ：桂皮紫萁离体快繁研究
闫海川　董 然　赵和祥　顾德峰
(吉林农业大学园艺学院, 130118,吉林长春)
　　摘　要　以桂皮紫萁的穗状孢子为外植体进行
离体快繁研究。结果表明 ,破碎孢子囊后的孢子接
种在 1/6MS+蛋白胨 0.5g/L+蔗糖 20g/L+琼脂
8.6g/L中 ,在变温变光下培养更易萌发。 1/2MS培
养基中添加 8g/L桂皮紫萁叶片提取液以及(KT
5.0mg/L和 NAA 0.5mg/L、NAA1.0mg/L)均能更
好的促进原叶体的增殖。变温变光培养有利于瓶内
孢子体的形成和生长 , 培养瓶外诱导更适合孢子体
的转化。
关键词　桂皮紫萁;孢子;原叶体;孢子体;离体
快繁
桂皮紫萁(OsmundacinnamomeaL.var.asiatica
Fernad)别称牛毛广、黄毛蕨菜 , 商品名薇菜(目前通
用)[ 1-3] 。桂皮紫萁是长白山地区常见的多年生蕨
类植物 ,寿命可达 30年以上 [ 4] 。桂皮紫萁主要用于
蔬菜加工领域 ,经济价值较一般蔬菜高 4 ～ 5倍。目
前由于大量采集 ,桂皮紫萁已近濒危状态 ,严重破坏
了生态平衡。自然状态下只能靠播种、分株的方法
繁殖 , 但繁殖速度非常慢 , 很难满足庞大的市场需
求。靠分株繁殖还存在资源严重不足的困难 ,如何
合理利用和保护野生资源已成为目前亟待解决的难
题。因此 ,急切地需要探索出适合桂皮紫萁快速繁
殖的技术 ,弥补资源短缺。
本试验针对不同培养条件 , 不同接种方式对孢
子萌发的影响;不同激素浓度对原叶体的增殖和孢
子体转化;不同培养条件 、不同诱导方式等对孢子体
的诱导率的影响等进行了研究 , 旨在为桂皮紫萁人
工产业化生产提供必要的技术支持。
1　材料与方法
1.1　材料来源
材料来自吉林省临江市山区 ,秋季挖取桂皮紫
萁的地下根茎栽植于吉林农业大学校园实验区内 , 5
月中旬收集孢子穗接种。
1.2　接种桂皮紫萁孢子
以桂皮紫萁的孢子为外植体 ,采用两种方式接
种:(1)带囊壳的孢子穗用 0.1%HgCl2 灭菌 6 ～
7min, 无菌水冲洗 4 ～ 5次 , 在无菌的培养皿上切成
0.5cm×0.5cm的小段后接种。 (2)将灭菌后的孢
子穗在解剖镜下剥出的孢子囊 , 放在经灭菌后
2cm×2cm大小的滤纸上 , 用手术刀小心压碎孢子
囊 ,散出其内的孢子 ,连同小滤纸片一同接种 [ 5] 。接
种后逐日观察孢子萌发情况 , 调查孢子萌发后肉眼
可见绿点的时间。
以 1/6MS为孢子萌发基本培养基 , 所有培养基
添加蛋白胨 0.5g/L、蔗糖 20g/L、琼脂 8.6g/L、pH
值为 5.6～ 5.8。采用两种培养条件分别培养 , 一是
培养室内 ,温度 25±2℃,光照时间 12 ～ 14h/d,光照
强度 1 500 ～ 2 000Lx。另一种培养是在 HP1000GS
型人工智能气候箱内模拟自然环境下温度与光照的
变化 ,温光变化过程(见表 1)。
表 1　人工智能气候箱内温度与光照的变化
时间 6∶00 ～ 8∶00 8∶00 ～ 10∶00 10∶00 ～ 12∶00 12∶00 ～ 14∶00 14∶00 ～ 16∶00 16∶00 ～ 18∶00 18∶00 ～ 21∶00 21∶00 ～ 6∶00
温度(℃) 22 24 26 28 26 24 22 20
光照(Lx) 1 500 2 200 2 400 2 600 2 400 2 000 1 500 0
1.3　原叶体增殖与生长
将孢子萌发后形成的小原叶体团转接到原叶体
增殖培养基 ,增殖基本培养基为 1/2MS培养基 , 其
中添加不同植物生长调节剂(见表 3)和 0.2g/L
KH2PO4 及不同量的桂皮紫萁叶片提取液 , 以叶片
鲜重计算 ,将新鲜的桂皮紫萁叶片在研钵内捣碎。
作者简介:闫海川 ,在读硕士 ,主要从事植物组织培养研究
顾德峰为通讯作者 ,教授 ,主要从事园林植物组织培养工作
基金项目:长春市科技支撑项目(2008245)
收稿日期:2010-05-11;修回日期:2010-06-28
每处理 6个瓶 , 每瓶接 5 ～ 6个 0.5cm×0.5cm原叶
体团 ,每个团含 8 ～ 10片原叶体。于培养室内培养
60d后调查原叶体的增殖情况和生长状态 , 按下式
计算原叶体的增殖系数:
增殖系数 =增殖 60d每瓶原叶体数 /接种时每
瓶原叶体数
1.4　孢子体诱导培养
培养基为 1/2MS, 添加 0.2g/LKH2PO4、 0.2%
AC(活性碳)及不同植物生长调节剂(见表 5)。方
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作物杂志　Crops2010.5DOI :10.16035/j.issn.1001-7283.2010.05.033
法与原叶体增殖时的相同 ,培养条件与孢子萌发时
相同。 120d后统计孢子体的诱导率。
将增殖后的原叶体直接从培养瓶内取出 ,洗净
表面沾有的培养基 ,移栽到草炭 +河沙、落叶松土的
基质上。盆上覆盖塑料膜 ,保持湿度 90%以上。于
温室内散射光下培养 ,每 7d浇 1次营养液。 60d后
统计孢子体的诱导率 ,观察孢体的生长状态。
2　结果与分析
2.1　孢子的萌发情况
2.1.1　不同培养条件对桂皮紫萁孢子萌发的影响
　不同培养条件对孢子萌发的影响是不同的(见表
2)。孢子接种 6d后在显微镜下观察发现 , 置于变
温变光下培养的孢子均已萌发 ,而恒温培养下 ,带囊
表 2　不同接种方式 、不同培养条件对孢子萌发的影响
不同接种方式 培养条件 孢子萌发需天数(d) 片状体形成需天数(d) 20d后肉眼观察萌发情况
带囊壳直接接种 恒温恒光 8 27 可见少量浅绿色的绒状体
变温变光 6 24 孢子囊和培养基表面有大量的鲜绿色绒状体
破碎囊壳后接种 恒温恒光 5 19 可见直径约 0.1cm左右片状体 ,密实 ,淡绿
变温变光 4 18 可见直径约 0.2cm左右的片状体 ,浓绿
壳的孢子未见萌发。培养 20d后肉眼观察发现 ,经
变温变光条件培养后形成的可见绿色绒状体 ,且其
密度大小及其形成的片状体生长状态均好于恒温条
件下的培养。可见 , 变温变光培养在孢子萌发过程
中起了促进作用。
2.1.2　不同接种方式对桂皮紫萁孢子萌发的影响
　不同接种方式对桂皮紫萁孢子的萌发有明显影响
(见表 2), 带囊壳的孢子在培养基中经过约 6d左右
的培养孢子开始萌发 , 20d时达到肉眼可见的程度;
而破碎孢子囊后的孢子约 4d开始萌发 , 经 12 ～ 15d
的培养即达肉眼可见状态 , 而且萌发后的长势也明
显好于前一种(图 1,图 2, 图 3)。可见 ,桂皮紫萁离
体培养中去除孢子囊壳的孢子更利于其萌发。
2.2　原叶体的增殖与生长
2.2.1　不同浓度的植物生长调节剂对原叶体增殖
的效应　将孢子萌发后形成的原叶体团接种到增殖
培养基中 , 60d观察原叶体的增殖和生长状态(见图
4, 图 5)。
　　从表 3可知 ,在供试的几种培养基中均能促进
原叶体的增殖。经显著性差异检测结果表明:原叶
体增殖最好的激素组合为 KT 5.0mg/L+NAA
1.0mg/L和 KT5.0mg/L+NAA0.5mg/L,二者无显
著性差异。 BA 0.8mg/L+NAA 1.0mg/L和 ZT
1.0mg/L+NAA1.0mg/L组合的分化假根能力较
强 ,可以考虑用于孢子体生根壮苗培养。
2.2.3　添加桂皮紫萁叶片提取液对原叶体生长的
影响　由表 4可知 ,培养基中未添加桂皮紫萁叶片
提取液时 ,原叶体生长缓慢 ,颜色鲜绿。培养基中随
着添加桂皮紫萁叶片提取液浓度的增加 , 原叶体生
长较快 ,颜色浓绿 , 长势较好。其原因可能是因桂皮
紫萁叶片中含有多种氨基酸和维生素 , 富含硒 [ 6]
等 ,这些营养物质能促进原叶体增殖和生长。但当
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作物杂志　Crops 2010.5
表 3　植物生长调节剂浓度与原叶体增殖及生长状态
激素浓度(mg/L)
KT ZT 6-BA NAA
接种原叶体数
(片 /瓶)
60d后原叶体片数
(片 /瓶)
增殖
系数 原叶体生长状态
3.0 0 0 0.5 54 302 4.6fg 生长缓慢 ,片状体小 ,少密实 ,浓绿
3.0 0 0 1.0 56 325 5.1de 生长缓慢 ,片状体小 、平展 ,少密实 ,浓绿
5.0 0 0 0.5 60 372 6.2a 生长较快 ,片状体肥厚 、平展 ,蓬松 ,浓绿
5.0 0 0 1.0 59 384 6.5a 生长较快 ,片状体肥厚 、平展 ,蓬松 ,浓绿
0 1.0 0 0.5 63 340 5.0e 生长缓慢 ,片状体细长 ,浓绿
0 1.0 0 1.0 58 325 4.8ef 生长缓慢 ,片状体碎小 ,浅绿 ,大量假根
0 1.5 0 0.5 55 275 5.6bc 生长较快 ,片状体肥厚 ,平展 ,浓绿
0 1.5 0 1.0 59 283 5.4cd 生长较快 ,片状体细长 ,浓绿 ,有少量绒毛
0 0 0.8 0.5 61 305 5.6bc 生长较快 ,片状体肥厚 ,少密实 ,浓绿
0 0 0.8 1.0 54 275 4.4g 生长缓慢 ,片状体碎小 ,淡绿 ,大量假根
0 0 1.5 0.5 55 253 5.8b 生长较快 ,片状体肥厚 ,平展 ,浓绿
0 0 1.5 1.0 57 251 5.0e 生长缓慢 ,片状体碎小 ,多密实 ,浓绿
　注:同列不同大小写字母表示显著性差异水平(P﹤ 0.05)下同。以上数均为 6瓶的平均值 ,每种培养基均含蛋白胨 2.0g/L+AC0.2%
表 4　桂皮紫萁叶片提取液对原叶体生长状况的影响
叶片提取液(%) 原叶体生长状况
0 生长缓慢 ,片状体小 ,鲜绿
0.6 生长较快 ,片状体大 ,平展 ,鲜绿
0.8 生长快 ,片状体大 ,肥厚 、心形平展 ,浓绿
1.0 生长较快 ,叶片边缘锯齿 ,肥厚 、卷曲 ,暗绿
浓度大于 10g/L时 ,原叶体生长状态发生改变 ,片状
体发生褶皱 、卷曲 ,不利于原叶体的继续增殖。
2.3　孢子体的诱导
2.3.1　培养瓶内孢子体的诱导情况　在培养瓶内
诱导中 ,原叶体分别在不同的培养环境中经过 120d
的诱导培养 , 孢子体植株诱导率存在显著的差异
(见表 5)。恒温培养条件下(图 6), 孢子体植株诱
导率最高达 19%, 植株叶片较小 , 叶色淡绿 , 茎纤
细 ,稍徙长。经变温变光培养条件下孢子体植株诱
导率最高达 31%(图 7), 而且孢子体植株茎长势粗
壮 ,叶片较大 , 叶色浓绿 , 植株长势明显优于在恒温
条件下培养的植株。可见 , 在培养瓶内诱导孢子体
植株时 ,变温变光培养有利于孢子体转化及生长。
表 5　桂皮紫萁的试管内孢子体植株诱导情况
培养条件 激素浓度(mg/L)KT NAA
接种原叶体数
(片 /瓶)
120d孢子数
(株 /瓶)
诱导率
(%) 孢子体生长状态
恒温培养 5.0 0.5 52 10 19c 叶片小 ,茎细 ,根细小 ,浅绿,平均株高 1.75±0.19cm
5.0 1.0 62 6 10d 叶片大 ,茎细 ,根细长 ,浅绿,平均株高 1.82±0.04cm
变温变光 5.0 0.5 60 19 31a 叶片小 ,浓绿 ,茎较粗壮 ,平均株高 1.70±0.32cm
5.0 1.0 58 14 24b 叶片大 ,浓绿 ,茎粗壮 ,平均株高 1.75±0.56cm
　注:孢子体转化率(%)=(孢子体植株数 /原叶体数)×100%
　　试验中还发现 ,不同激素浓度对孢子体的诱导
率还存在显著性差异 ,孢子体的诱导率随着 NAA浓
度的升高而下降 ,表明低浓度的 NAA有利于孢子体
的诱导。 NAA浓度为 0.5mg/L时孢子体的诱率明
显大于 NAA浓度 1.0mg/L, 但 NAA 0.5mg/L时孢
子体的生长状态不佳。只有外源激素与内源激素达
成某种平衡 ,实现原叶体向孢子体的最大量转化时 ,
植株才能生长健壮。因此 , 如何更好的调控植物外
源激素浓度 ,将有待于进一步的研究和探讨。
2.3.2　培养瓶外孢子体的诱导情况　将瓶内增殖
两个月后的原叶体分别移栽到瓶外已处理好的基质
中 , 60d后调查孢子体的转化情况和生长状态(表
6,图 8, 图 9)的试验结果表明:以草碳 +河沙为基
质 ,定期浇不同诱导液 , 孢子体的平均诱导率为
29%, 后期发现孢子体植株有一部分出现叶片枯黄 ,
植株死亡迹象;以落叶松土为基质 ,定期浇不同的诱
导液 ,孢子体的平均诱导率为 40%, 而且孢子体植
株长势良好。可见 ,以落叶松土为基质更适合孢子
体的转化和生长。两者存在差别的原因可能是草
炭 +河沙为基质透气性差 ,基质中易滋生细菌微生
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作物杂志　Crops2010.5
表 6　桂皮紫萁孢子体的试管外诱导状况
基质 营养液 栽植原叶体数(片) 孢子体数(株) 孢子体诱导率(%)
草碳 +河沙 H2O 510 71 14
0.15%KH2PO4 500 160 32
1/10(MS1+MS2)+铁盐 520 177 34
1/10(MS1+MS2)+0.15%KH2PO4 500 180 36
平均值 508 147 29
落叶松土 H2O 495 124 25
0.15%KH2PO4 510 235 46
1/10(MS1+MS2)+铁盐 520 229 44
1/10(MS1+MS2)+0.15%KH2PO4 500 266 50
平均值 506 214 40
　注:表中数据为每盆内原叶体团的平均值
物等 , 感染植株。而落叶松土中本身含有机质丰富 ,
透气性强 ,更适合孢子体生长。不同的诱导液为何
影响原叶体的增殖和孢子体的诱导率还有待研究。
能否实现由原叶体向孢子体大量的转化 , 是桂
皮紫萁离体快繁的关键环节。瓶内和瓶外两种不同
途径的孢子体诱导试验结果表明 ,瓶外诱导更适合
孢子体的转化。瓶内诱导时 , 需要调控好培养条件、
生长调节剂种类和水平、培养基成分、酸碱度等 , 转
化条件要求较复杂 ,很难在一定时期内实现孢子体
的大量转化。而将自然状态下生长及增殖较慢的原
叶体经培养瓶内快速增殖后 , 孢子体的诱导尽量在
瓶外进行 ,此方案不仅可以缩短育苗时间 ,而且在瓶
外诱导时 ,孢子体的诱导率相对较高 ,幼苗更容易适
应外界环境变化。
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StudiesonthePropagationofOsmundacinnamomeaL.var.asiaticainVitro
YanHaichuan, DongRan, ZhaoHexiang, GuDefeng
(ColegeofHorticulture, JilinAgriculturalUniversity, Changchun130118, Jilin, China)
Abstract　ThisarticlewasabouttherapidreproductionofOsmundacinnamomeaL.var.asiaticausingthefringysporophylasexplantinvitro.Theresultsshowedthatthesporesfrombrokensporangiainoculatedinmediumof1/
6MSwithpeptone0.5g/L+sucrose20g/L+agar8.6g/Lwereeasytogerminatequicklyundertheconditionofchangeabletemperatureandlight.1/2MSculturemediumaddedwith8g/LliquidextractedfromleavesofOsmundacinnamomeaL.var.asiaticaorKT5.0mg/L, NAA0.5mg/LandNAA1.0mg/L, bothofwhichpresentedgoodper-formanceinpromotingproliferationofprothalium.Thechangeableconditionofdiferenttemperatureandlightbene-fitedthegrowthofsporophyteinvitro.Cultureinpersidishesratherinbotleswouldbemoresuitableforprothalustransformingintosporophyte.Keywords　OsmundacinnamomeaL.var.asiatica;Spore;Prothalus;Sporophyte;Rapidreproductioninvitro
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作物杂志　Crops 2010.5