全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2013 年
收稿日期：2012－08－27
基金项目：陕西省科学院计划项目（2011K－11）
作者简介：赵文娟（1972－），女，陕西眉县人，副研究员，主要从事造纸用酶的开发研究，（电话）13772015895（电子信箱）xshy1389＠163．com。
第 52卷第 12期
2013年 6 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 52 No.12
Jun．，2013
漆酶（Laccase，EC1．10．3．2）是一种含铜元素的
多酚氧化酶，是重要的木质纤维（Ligno cellulose）降
解酶之一 ［1］。 20 世纪末，以担子菌亚门（Basidiomy-
cotina）的白腐菌（White rot fungi）为代表的真菌产
生的漆酶成为了国内外研究的热点，真菌分泌的漆
酶主要具有催化木质素的降解、去除有毒化合物的
毒性、促进真菌色素的合成等作用。 基于此，真菌漆
酶在造纸工业中的生物制浆和纸浆生物漂白、有毒
造纸废水处理、酶法脱墨等方面表现出了相当的研
究价值和应用潜力［2－8］。
裂褶菌（Schizophyllum commune Fr．）又称白参、
树花，隶属于真菌门（Eumycota）担子菌亚门层菌纲
产漆酶裂褶菌的筛选及其产酶培养条件优化研究
赵文娟，徐升运，任 平
（陕西省科学院酶工程研究所 ／陕西省酶工程技术中心，西安 710600）
摘要： 从采自秦岭的森林腐木菌苔上分离到一株产漆酶的裂褶菌 （Schizophyllum commune Fr．） 菌株
mys005，对其产漆酶培养方式、培养基组成及培养条件进行了优化试验。 结果表明，裂褶菌菌株 mys005
的产漆酶适宜培养方式为液体浅层振荡培养，含有 Cu2＋、Mn2＋、Zn2＋的微量元素复合液、洋葱（Allium cepa L．）、
麦（Triticum aestivum L．）麸对其产漆酶都有较大的促进作用，而愈创木酚则对其生长和产漆酶有抑制作
用 。 由新鲜马铃薯 （Solanum tuberosum L．） 200 g、K2HPO4 1．00 g、NaCl 0．50 g、MgSO4·7H2O 0．50 g、
NaNO3 2．50 g、CaCl2·2H2O 0．10 g、FeCl3 0．02 g、 吐温-80 1．20 mL 溶于 1 000 mL 去离子水中组成的培养
基在添加微量元素复合液（50 mg ／ mL CuCl2·2H2O＋20 mg ／ mL MnSO4·H2O＋10 mg ／ mL ZnSO4·7H2O）3 mL、
洋葱 100 g、麦麸 10 g 后，并且培养基起始 pH 4．5、培养温度 30 ℃、培养摇床转速 200 r ／ min、培养时间 7
d，则摇瓶发酵的漆酶产酶量最高可达 1 121 U ／ mL，显示出了良好的工业开发潜力。
关键词：漆酶；裂褶菌（Schizophyllum commune Fr．）；筛选；产酶培养基；优化
中图分类号：Q554＋．9；S646．1＋9；Q93－33 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2013）12－2792-06
Isolation of Schizophyllum commune Producing Laccase and Optimization of Laccase
Production Conditions
ZHAO Wen－juan，XU Sheng－yun，REN Ping
（Enzyme Engineering Institute of Shaanxi Sciences /Shaanxi Engineering Center for Enzyme Technology， Xi’an 710600， China）
Abstract： A Schizophyllum commune Fr． strain mys005 producing laccase was isolated from the rotten wood lawn in forest of
Qinlin． The culture method for laccase production， medium composition and cultivation conditions was optimized． Results
showed that the suitable cultivation method for S． commune strain mys005 to produce laccase was shallow liquid shaking cul-
ture． Trace elements compound liquid containing Cu2＋， Mn2＋， Zn2＋， onion （Allium cepa L．）， wheat （Triticum aestivum L．）
bran could promote laccase production； while guaiacol could inhibit the growth and laccase production． If adding trace ele-
ment compound solution （50 mg ／ mL CuCl2·2H2O＋20 mg ／ mL MnSO4·H2O＋ 10 mg ／ mL ZnSO4·7H2O） 3 mL， onion 100 g， wheat
bran 10 g，in the medium containing fresh potato （Solanum tuberosum L．） 200 g， K2HPO4 1．00 g， NaCl 0．50 g， MgSO4·7H2O
0．50 g， NaNO3 2．50 g， CaCl2·2H2O 0．10 g、FeCl3 0．02 g、tween－80 1．20 mL in 1 000 mL deionized water， and keeping the
starting pH at 4．5， starting temperature at 30 ℃， culture shaker speed at 200 r ／ min， culturing for 7 d， the laccase enzyme
production yield in shake flask fermentation could be up to a maximum of 1 121 U ／ mL， showing great potential for industrial
development．
Key words： laccase； Schizophyllum commune Fr．； isolation； enzyme producing medium； optimization
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2013.12.013
第 12 期
（Hymenomycetes） 伞菌目 （Agaricales） 裂褶菌科
（Schizophyllaceae）裂褶菌属（Schizophyllum sp．），是
一种珍贵的食、药两用真菌［9］。关于裂褶菌产漆酶的
文献较少，李梦杰等 ［10］报道了一株产漆酶能力强且
产酶速度快的裂褶菌菌株 GGHN08－104，其在固体
发酵培养基里产漆酶活力达 2 449．02 U ／ g；Muham-
mad 等 ［11］利用裂褶茵对纺织品染料进行脱色研究，
发现裂褶菌菌株 IBL－06 的产漆酶活力达到了 179
U ／ mL；黄彩霞等［12］报道了裂褶菌用于废新闻纸的脱
墨研究试验， 结果裂褶菌能分泌高活力的漆酶，并
能对废新闻纸进行高效脱墨。已有试验［13，14］证明，对
裂褶菌产漆酶情况及在造纸行业的开发应用进行
深入研究很有必要。 为了得到造纸工业用高活力漆
酶， 试验从自然界筛选到一株产漆酶的裂褶菌菌
株，并对其产酶培养方式、液体产酶培养基组成及
培养条件进行了优化比较，为其在造纸工业和环境
保护中的应用提供参考。
1 材料与方法
1．1 菌种采样
采样地点在秦岭骊山；主要采集腐木树皮上的
白色菌苔、腐木屑及腐木根基处的腐殖土［15］。
1．2 试剂与仪器
培养基所用新鲜马铃薯 （Solanum tuberosum
L．）、洋葱（Allium cepa L．）和当年麦（Triticum aes-
tivum L．）麸均为市售，试剂均为分析纯或生化级试
剂；测定漆酶活力的 2， 2－联氮－二（3－乙基－苯并噻
唑－6－磺酸）铵盐［2，2′－azino－bis（3－ethylbenzthiazo-
line－6－sulfonic acid），ABTS］ 为美国 Sigma 公司产
品。 仪器主要有 DU640 型紫外 ／可见光分光光度计
（美国贝克曼公司）、KYC－1102 型恒温培养摇床（上
海新苗医疗器械有限公司）、PYS－DHS 型恒温培养
箱（上海跃进医疗器械厂）。
1．3 培养基
1．3．1 真菌斜面保藏培养基 （PDA 综合培养基 ）
由新鲜马铃薯（切碎）200 g、葡萄糖 20．0 g、KH2PO4
3．0 g、MgSO4·7H2O 1．5 g、 维生素 B1 8 mg、 琼脂
20．0 g 溶于 1 000 mL 去离子水中组成， 调培养基
pH为 6．0［16］。
1．3．2 真菌初筛（纯化）培养基 ①愈创木酚 PDA
（G－PDA）培养基，PDA 培养基灭菌后添加经无菌过
滤器除菌的 4 μL ／ mL 的愈创木酚－乙醇溶液 ［4］，使
培养基中愈创木酚的终浓度为 0．4 μL ／ mL；② α－萘
酚 PDA（αN－ PDA）培养基，PDA 培养基灭菌后添加
经无菌过滤器除菌的 50 mmol ／ L的 α－萘酚－乙醇溶
液，使培养基中 α－萘酚的终浓度为 5 mmoL ／ L。
1．3．3 复筛产酶摇瓶培养基 （基础产酶培养基）
配方①， 在综合 PDA培养基组分中去掉琼脂成分；
配方②，由新鲜马铃薯（切碎）200 g、K2HPO4 1．00 g、
NaCl 0．50 g、MgSO4·7H2O 0．50 g、NaNO3 2．50 g、CaCl2
·2H2O 0．10 g、 FeCl3 0．02 g、 吐温-80 1．20 mL 溶
于 1 000 mL 去离子水中组成，调培养基 pH为 6．0。
1．3．4 发酵产酶培养基 配方③， 由配方②1 000
mL＋微量元素复合液 （50 mg ／ mL CuCl2·2H2O＋20
mg ／ mL MnSO4·H2O＋10 mg ／ mL ZnSO4·7H2O）3 mL 组
成；配方④，由配方③＋新鲜洋葱（切碎）100 g ／ L 组
成；配方⑤，由配方③＋新鲜洋葱（切碎）100 g ／ L＋当
年麦麸 10 g ／ L组成
1．4 方法
1．4．1 产漆酶菌株初筛 ①称取 1～5 g 所采菌样
（较大的腐木屑与菌苔剪碎）， 装入有玻璃珠与 50
mL 去离子水的 250 mL 三角瓶中，在摇床上浸泡振
荡 30 min以上，制成菌悬液。 取 0．2 mL菌悬液分别
涂布在 G-PDA 培养基、αN-PDA 培养基上进行初
筛，每个菌样分别涂 5～8 个平板，置于恒温培养箱
中 30 ℃培养， 每天观察菌落生长及变色圈产生情
况。 ②将在 G-PDA培养基上初筛后产生棕红色、浅
红黄色变色圈的菌株以及在 αN-PDA 培养基上初
筛后产生浅蓝紫色变色圈的菌株挑出，继续在相对
应的 G-PDA 培养基、αN-PDA 培养基平板上进行
划线接种，置于恒温培养箱中 30 ℃培养，每天观察
菌落生长及变色圈的产生情况。 如此反复直到分离
到产生变色圈的单菌落， 记录变色圈的颜色与深
浅，测量菌丝圈直径（d1）及变色圈的直径（d2），由
d2 ／ d1比值大小初步判断菌株产漆酶的能力。将初筛
到的产漆酶菌株接入斜面保藏培养基中， 以供复
筛 ［17］。
1．4．2 产漆酶菌株复筛 初筛得到的斜面菌种用
PDA综合培养基平板活化，打成直径 8 mm 的菌饼，
取不同数量的菌饼分别接种于配方①、 配方②中，
250 mL 摇瓶装液 50 mL，30℃、150 r ／ min 培养 7 d，
发酵液过滤，得粗酶液用于测定漆酶活性。 产酶活
性高者即为复筛得到的目的菌株，用于下一步研究。
1．4．3 确定产漆酶培养方式 用配方①和配方②，
分别选择静置与振荡、浅层（50 mL）与深层 （100、
150 mL）2 组对比培养方式进行复筛菌株产漆酶发
酵试验，测定发酵滤液的酶活，以确定合适的基础
发酵培养基及发酵方式，每处理重复 3 次。
1．4．4 产漆酶发酵培养基优化 向试验确定的基
础产酶培养基（配方②）中分别添加不同量的微量
元素复合液以及洋葱、麸皮、愈创木酚进行摇瓶发
酵，测定发酵滤液的酶活，对产漆酶培养基进行初
赵文娟等：产漆酶裂褶菌的筛选及其产酶培养条件优化研究 2793
湖 北 农 业 科 学 2013 年
表 1 不同培养基配方、不同培养方式下菌株 mys005
产漆酶情况
配方
配方①
配方②
培养方式
静置
振荡
静置
振荡
250 mL 三角瓶装液量//mL
50
150
50
100
50
150
50
100
发酵滤液比酶活//U/mL
2
1
27
18
12
9
62
54
步优化，每处理重复 3次。
1．4．5 产酶培养条件确定 培养基选用配方⑤，分
别比较不同起始 pH（4．0、4．5、5．0、5．5、6．0、6．5、7．0）、
培养时间（4、5、6、7、8 d）、培养温度（25、28、30、35℃）、
接种量（直径 8 mm 的菌饼 2、3、4、5 片）、培养摇床
转速（120、150、180、200 r ／ min）对产漆酶菌株漆酶
产量的影响。 500 mL三角瓶装液 100 mL，培养温度、
接种量、 培养摇床转速及起始 pH 和培养时间用优
化后的数值，5 个培养条件的处理都重复 3 次 ［18］。
1．4．6 漆酶活性测定方法（ABTS 法） 酶液（发酵
滤液）、缓冲液和底物 ABTS 都先在 30 ℃下预热；在
3 mL 反应体系中，先加入酶液 0．1 mL，然后分别加
入 pH 4．5 的醋酸－醋酸钠缓冲液 2．5 mL、1 mmol ／ L
的 ABTS 0．4 mL，温度 30 ℃启动反应，每 15 s 在紫
外 ／可见光分光光度计上测定一个反应体系在 420
nm 下的 OD 值， 求得反应前 3 min 内反应体系的
OD值变化用于计算酶活。要求酶反应体系的 OD值
变化在前 3 min 内呈线性关系， 否则需将酶液用缓
冲液稀释到合适倍数 。 以每分钟转化 1 μmol ／ L
ABTS（或生成 1 μmol ／ L ABTS 自由基）的酶量为一
个酶活单位［19，20］。 计算公式：
漆酶活性＝106 ／ ε·b×△OD ／△t，
比酶活＝漆酶活性 ／V。
式中，酶活的单位为 μmol ／ （L·min），比酶活单
位为 U ／mL；ε 为 ABTS 自由基的摩尔吸光系数 ，
ε420＝3．6×104 L ／ （mol·cm）；b 为比色管厚度 （cm）；V
是反应体系中加入酶液的体积 （mL）；△OD 为在反
应时间 （△t） 内的吸光度增加值；△t 是反应时间
（min）。 试验中漆酶产量以比酶活表示。
1．4．7 产漆酶菌株的分子鉴定 将复筛得到的产
漆酶活力高的菌株用 PDA 综合培养基平板纯化至
少 3 次以上，进而得到纯度高的单菌落，将该菌落
送样至生工生物工程（上海）股份有限公司进行真
菌 ITS 分子鉴定 。 基因组 DNA 提取采用生工
SK1375真菌基因组 DNA抽提试剂盒， 引物序列分
别有 ITS1： 5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′ ，20
bp；ITS4：5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′，19 bp。
DNA 测序用 PCR 纯化产物 27f 和 1 492 r 实施完
成； 利用 GenBank 中的 BLAST 软件搜索同源序列
进行比对，对该菌株进行分子鉴定［21］。
2 结果与分析
2．1 产漆酶菌株初筛结果
将野外采集到的菌样经过适当稀释后， 在 G－
PDA 和 αN－PDA 2 种初筛培养基平板上培养，3 d
后在 G－PDA 平板上长出了深棕红色变色圈的菌
落， 将其在 G－PDA 和 αN－PDA 平板上反复划线纯
化分离， 最终在 G－PDA 平板上得到了产生明显深
棕红色变色圈的单菌落， 而在 αN－ PDA 平板上这
些菌株并不产生任何颜色的变色圈； 将在 G－PDA
平板上得到的菌株命名为 mys005，其菌落形态为蓬
松白色绵毛状，中央形成同心圆状的环纹区，菌丝
浓密厚重，堆积高出培养基表面，不向培养基内部
生长，培养基背面始终为白色；变色圈颜色为深棕
红色，培养 5 d 的变色圈直径（d2）为 18 mm，培养 5
d 的菌丝圈直径（d1）为 11 mm，d2/d1比值为 1．6。 菌
株 mys005 在 G－PDA 培养基上的菌落形态特征与
万力等 ［22］报道的结果基本一致，说明菌株 mys005
为裂褶菌的可能性比较大。
2．2 培养方式与基础发酵培养基的确定
综合 PDA 培养基（复筛配方①）适合所有真菌
生长，而配方②是在配方①的基础上添加了一些常
用的无机盐成分， 添加吐温-80 是为了利于酶的渗
出，从而减少细胞内酶合成的抑制作用。 王佳玲
等 ［23］报道称，国内外学者在进行白腐菌漆酶的液体
培养时，采用静置培养方式的次数比振荡培养方式
的多，采用深层培养方式的次数比浅层培养方式的
多，且前者比后者更有利于提高漆酶产量。 因此试
验分别对静置与振荡、浅层与深层培养方式进行了
比较试验， 振荡培养方式的条件是培养温度 30 ℃，
直径 8 mm 的菌饼在装液量为 50 mL 时接种 1 片、
在 100 mL 时接种 2 片、在 150 mL 时接种 3 片，150
r ／ min 培养 7 d；静置培养方式的培养温度与接种量
均与振荡培养方式条件一致，但培养过程中每隔 2 d
摇动三角瓶一次，结果见表 1。 从表 1 中可以看出，
菌株 mys005 的液体发酵采用振荡培养方式的产漆
酶量高于静置培养方式、浅层培养方式的产漆酶量
高于深层培养方式， 这说明菌株 mys005 的生长需
要消耗大量的氧气，这一结果与李梦杰等 ［10］的研究
结果相一致。 另外，在采用振荡培养时，配方②比配
2794
第 12 期
方①的漆酶产量高， 因此初步确定菌株 mys005 的
培养以新鲜马铃薯（切碎）200 g、K2HPO4 1．00 g、NaCl
0．50 g、MgSO4·7H2O 0．50 g、NaNO3 2．50 g、CaCl2·
2H2O 0．10 g、 FeCl3 0．02 g、 吐温-80 1．20 mL 溶
于 1 000 mL 去离子水中组成的配方②（调培养基
pH为 6．0）为基础发酵培养基，采用浅层振荡培养方
式（250 mL三角瓶装液量 50 mL）。
2．3 发酵培养基的优化
2．3．1 微量元素对菌株 mys005 产漆酶的影响 前
人研究指出，微量元素铁、锌、锰、钴、铜等往往是酶
的活性基组成部分［23，24］，是酶的激活剂，对酶活的影
响不容忽视。 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，铜对
漆酶有活化作用； 另外对于某些白腐菌而言，在
Mn2＋和 Cu2＋存在的前提下能显著提高漆酶的酶活。
因此试验以配方②为基础，通过往培养基中添加不
同量的微量元素复合液（50 mg ／ mL CuCl2·2H2O＋20
mg ／ mL MnSO4·H2O＋10 mg ／ mL ZnSO4·7H2O）， 比较
了菌株 mys005 摇瓶发酵 （250 mL 三角瓶装液 50
mL， 直径 8mm 的菌饼 1 片，30 ℃、150 r ／ min 培养 7
d）的产漆酶情况。 结果见表 2。 由表 2可见，添加微
量元素 Cu2＋、Mn2＋、Zn2＋能促进菌株 mys005 提高漆酶
产量，随着微量元素复合液添加量的增加，产漆酶
量也相应提高，当添加微量元素复合液 3 mL 时，产
漆酶量比对照提高了 298．39％，达到了 247 U ／ mL。
2．3．2 洋葱对菌株 mys005 产漆酶的影响 王佳玲
等 ［23］报道称，在合成培养基中添加洋葱可以提高漆
酶的产量；赵琪等 ［25］报道，木腐菌具有较强的分解
木质素、纤维素的能力，其生长发育需要钾、镁、钙、
磷等矿质营养元素的参与。 洋葱每百克鲜品含钙
40 mg、磷 50 mg、铁 1．8 mg、维生素 C 8 mg，还含有胡
萝卜素、维生素 B1和尼克酸、前列腺素 A、二烯丙基
二硫化物及硫氨基酸等成分，营养非常全面，而且
洋葱是一种价廉易得的蔬菜， 若能提高漆酶产量，
将对工业化生产漆酶降低成本、提高经济效益产生
重大的影响。 因此试验以配方③为基础，通过往培
养基中添加不同量的洋葱 （切碎）， 比较了菌株
mys005 摇瓶发酵（250 mL 三角瓶装液 50 mL，直径
8mm 的菌饼 1 片，30 ℃、150 r ／ min 培养 7 d）的产漆
酶情况。 结果见表 3。 从表 3 中可以看出，洋葱的加
入确实能提高菌株 mys005 产漆酶的能力， 其中以
添加量为 100 g ／ L 的产酶量达到最高， 其摇瓶发酵
液的比酶活比对照提高了 260．61％， 达到了 238
U ／ mL， 随后虽添加量增大而漆酶比酶活却基本保
持平稳。 因此确定洋葱的适宜添加量为 100 g ／ L。
2．3．3 愈创木酚对菌株 mys005 产漆酶的影响 研
究漆酶相关文献 ［23］指出，结构与木质素有关的低分
子芳香化合物或木质素降解的碎片化合物可以作
为漆酶的诱导剂来提高酶活，而愈创木酚是具有木
质素特征苯环结构的木质素类似物，对某些白腐菌
漆酶的产生有一定的诱导促进作用，侯红漫等 ［26］在
研究糙皮侧耳 ［Pleurotus ostreatus （Jacq．ex Fr．）
Quel．］的漆酶产量时发现添加 0．5 mmol ／ L 的愈创木
酚可使糙皮侧耳培养液的产酶量提高 2．5 倍。 但是
愈创木酚具有毒性，浓度高时会对菌体的生长产生
明显的抑制作用，因此愈创木酚的添加量和添加时
间对漆酶产量的提升与否将是很关键的因素。 试验
以配方③为基础， 培养条件为 500 mL 三角瓶装液
100 mL， 直径 8mm 的菌饼 2 片，30 ℃、150 r ／ min 培
养 7 d，通过用浓度 4 μL ／ mL 愈创木酚－乙醇溶液的
添加量（添加量分别是 1．0、1．5、2．0 mL）和添加时间
（试验开始时添加、 试验第三天添加） 分别进行试
验，比较了菌株 mys005摇瓶发酵的产漆酶情况。 结
果见表 4。 由表 4 可见， 当试验开始添加了 1．0 mL
愈创木酚－乙醇溶液后，菌株 mys005 漆酶的比酶活
降低了 72．48％，添加了 2．0 mL 的愈创木酚－乙醇溶
液后漆酶比酶活降低了 86．43％；当试验第三天添加
了 1．0 mL的愈创木酚－乙醇溶液后，菌株 mys005 漆
酶的比酶活降低了 63．18％， 添加了 2．0 mL 后的漆
酶比酶活降低了 85．27％。由此看来愈创木酚并不是
菌株 mys005 的诱导剂，反而是抑制剂；而添加时间
的早晚并不影响愈创木酚添加量对菌株 mys005 产
漆酶的抑制作用。
2．3．4 麦麸对菌株 mys005 产漆酶的影响 在产漆
酶培养基中添加含有木质素的天然植物原料如稻
草、 锯木屑等可选择性地提高木质素降解酶的产
量 ［23］。 王宜磊［27］研究了彩绒革盖菌［Coriolus versi-
color（L． ex Fr．）Quél．］产漆酶的能力，并对产酶条件
表 2 微量元素对菌株 mys005 产漆酶的影响
处理
1（CK）
2
3
4
配方②中微量元素
复合液添加量
mL/L
0
1
3
5
发酵滤液比
酶活
U/ mL
62
108
247
193
比酶活比
CK 增幅
%
74.19
298.39
211.29
表 3 洋葱对菌株 mys005 产漆酶的影响
处理
1（CK）
2
3
4
配方③中洋葱添加量
g/L
0
50
100
150
发酵滤液比酶活
U/ mL
66
114
238
212
比酶活比 CK 增幅
%
72.73
260.61
221.21
赵文娟等：产漆酶裂褶菌的筛选及其产酶培养条件优化研究 2795
湖 北 农 业 科 学 2013 年
pH4.0
pH4.5
pH5.0
pH5.5
pH6.0
pH6.5
pH7.0
表 4 愈创木酚对菌株 mys005 产漆酶的影响
处理
1（CK）
2
3
4
5
6
7
添加时间
试验开始时
试验开始时
试验开始时
试验第三天
试验第三天
试验第三天
配方③中 4 μL/mL 愈创木酚-乙醇溶液添加量//mL/100 mL
0
1.0
1.5
2.0
1.0
1.5
2.0
发酵滤液比酶活//U/mL
258
71
47
35
95
50
38
比酶活比 CK 增幅//%
-72.48
-81.78
-86.43
-63.18
-80.62
-85.27
和酶活性进行了比较，结果发现，以麦麸替代葡萄
糖后， 漆酶产量由 131 U ／ mL 提高到了 622 U ／ mL。
研究表明，小麦麸皮主要由纤维素（24％）、半纤维素
（62％）、木质素（11％）等组成［28］。 初步判断麦麸中的
木质素、 半纤维素有可能对漆酶产量有促进作用。
另外麦麸在中国北方是产量大、价格廉的农产品加
工副产物，若能作为漆酶工业生产的原料则经济价
值提升的空间就非常大。 试验以配方④为基础，通
过不同添加量的麦麸， 比较了菌株 mys005 摇瓶发
酵（500 mL三角瓶装液 100 mL，直径 8 mm 的菌饼 2
片，30 ℃、170 r ／ min 培养 7 d）的产漆酶情况，结果见
表 5。 由表 5 可见 ， 培养基中添加麦麸对菌株
mys005 产漆酶有较大的促进作用，随着添加量的增
加，产酶量大大提高，当麦麸添加量为 15 g ／ L 时，产
漆酶量比对照提高了 150．87％， 达到了 868 U ／ mL；
由产酶量结合成本因素，最终确定麦麸的添加量以
10 g ／ L为宜。 但是究竟是麦麸中的哪种成份在起作
用，还需要进一步试验确认。
2．4 发酵培养条件的优化
2．4．1 培养基不同起始 pH， 不同培养时间对菌株
mys005 产漆酶的影响 赵琪等 ［25］报道，裂褶菌的菌
丝生长最适 pH 为 5～6、 子实体生长最适 pH 为 4～
5，因此试验选择培养基的起始 pH 分别调整为 4．0、
4．5、5．0、5．5、6．0、6．5、7．0，摇瓶培养时间分别设置为
4、5、6、7、8 d，以此测定菌株 mys005 发酵液的酶活，
结果如图 1所示。 由图 1可见，当培养基起始 pH为
4．5～5．5时，适于菌株 mys005 产漆酶，随着培养时间
的延长，产漆酶量不断提高，基本上在第七天、第八
天达到最高值；其中当 pH为 4．5、培养时间到 7 d时
产漆酶量最高， 达到了 986 U ／ mL； 而当 pH＜4．5 和
pH＞6．5 时， 产漆酶量都大大降低。 因此确定菌株
mys005 培养基的起始 pH 为 4．5～5．0， 培养时间为
7 d。
2．4．2 不同接种量、培养摇床转速、培养温度对菌
株 mys005 产漆酶的影响 培养基起始 pH 4．5、500
mL 三角瓶装液量 100 mL，接种量分别是直径 8 mm
的菌饼 2、3、4、5 片；培养摇床转速分别是 120、150、
180、200 r ／ min；培养温度分别是 25、28、30、35 ℃，培
养 7 d，测定菌株 mys005 的产漆酶情况，结果分别
见表 6、表 7、表 8。从表 6、表 7、表 8 综合分析可知，
培养摇床转速对菌株 mys005 液体发酵的产漆酶量
影响较大，接种量次之，培养温度的影响最小。 因此
表 6 不同培养温度对菌株 mys005 产漆酶的影响
处理
1
2
3
4
接种 2 片菌饼、培养摇床转速
180 r/min 的培养温度//℃
25
28
30
35
发酵滤液比酶活
U/mL
625
938
995
596
表 7 不同接种量对菌株 mys005 产漆酶的影响
处理
1
2
3
4
培养温度 30℃、培养摇床转速
180 r/min 的接种菌饼量//片
2
3
4
5
发酵滤液比酶活
U/mL
992
997
953
849
表 5 麦麸对菌株 mys005 产漆酶的影响
处理
1（CK）
2
3
4
5
配方④中麦麸添加量
g/L
0
6
8
10
15
发酵滤液比酶活
U/mL
346
481
526
852
868
比酶活比 CK 增幅
%
39.02
52.02
146.24
150.87
1 200
1 000
800
600
400
200
0
比
酶
活
//U
/m
L
4.0 5.0 6.0 7.0 8.0
时间//d
图 1 起始 pH、培养时间对产漆酶的影响
2796
第 12 期
表 8 不同培养摇床转速对菌株 mys005 产漆酶的影响
处理
1
2
3
4
培养温度 30℃、接种 3 片菌饼的
摇床转速//r/min
120
150
180
200
发酵滤液比酶活
U/mL
693
841
1 016
1 121
菌株 mys005液体发酵的适宜培养温度为 28～30 ℃、
接种量为直径 8mm 的菌饼 2～3 片、 培养摇床转速
180～200 r ／ min。
2．2 分子鉴定结果
对菌株 mys005 高纯度的单菌落进行真菌 ITS
分子鉴定，基于 rDNA ITS 区段进行克隆测序，并对
ITS 序列进行核酸序列数据库 GenBank 同源性检索
比对，将从 GenBank 检索获得的相关分类元真菌的
ITS 序列连同菌株 mys005 ITS 序列一起用于系统
发育分析，结果表明，受试菌株 mys005 与 GenBank
核酸序列数据库中 Schizophyllum commune Fr．具有
100％的同源性，属于裂褶菌属的裂褶菌。
3 小结
裂褶菌菌株 mys005 的生长需要消耗大量的氧
气，其液体发酵产漆酶应选择浅层振荡培养方式为
宜。 微量元素、洋葱、麦麸的添加都能大幅度提高裂
褶菌菌株 mys005 的漆酶产量； 在新鲜马铃薯 （切
碎）200 g、K2HPO4 1．00 g、NaCl 0．50 g、MgSO4·7H2O
0．50 g、NaNO3 2．50 g、CaCl2·2H2O 0．10 g、 FeCl3 0．02
g、吐温-80 1．20 mL 溶于 1 000 mL 去离子水中组成
的培养基里添加微量元素复合液 （50 mg ／ mL
CuCl2·2H2O＋20 mg ／ mL MnSO4·H2O＋10 mg ／ mL Zn-
SO4·7H2O）3 mL、新鲜洋葱 100 g（切碎）、麦麸 10 g
后，于 500 mL 三角瓶装液 100 mL，在接种后调起始
pH 4．5、培养温度 30 ℃、培养摇床转速 200 r ／ min、培
养 7 d， 则摇瓶发酵的漆酶产酶量最高可达 1 121
U ／ mL，显示出了良好的工业开发潜力。
愈创木酚对裂褶菌菌株 mys005 产漆酶具有抑
制作用，添加时间的早晚不改变其抑制效果，当浓
度 4 μL ／ mL 的愈创木酚－乙醇溶液用量为 1．0 mL
时，产漆酶量可下降 60％以上。
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（责任编辑 王 珞）
赵文娟等：产漆酶裂褶菌的筛选及其产酶培养条件优化研究 2797