全 文 ：碱提鬼毛针多糖的研究
白日霞 薛 业
(大连民族学院化工系 大连 116600)
白日霞 女 , 35岁 ,副教授 ,从事糖化学的研究。
国家民委资助项目 1999-12-01收稿
关键词 鬼毛针 鬼毛针多糖 结构
Key words Marasmius andro saceus( Fr. ) Fr. , · Polysaccha ride, Structure
治疗癌症的方法主要有三种:手术、化疗和放疗 ,但近十年来世界上普遍认为癌的免疫疗法更
为优越 ,所以寻找免疫促进剂成为当今发展新药的方向之一。多糖作为药物最早是 1943年 ,但作为
广谱免疫促进剂是 60年代以后。近年来研究发现多糖不但能治疗机体的免疫系统受到严重损伤的
癌症 ,也能治疗多种免疫缺损病症如病毒性肝炎 ,风湿症 ,甚至可以辅助治疗爱滋病等。多糖将在治
疗癌症、爱滋病和减缓衰老等领域有着广阔的应用前景 [1 ]。 所以我们选取了药用真菌鬼毛针作原
料 ,从中提取多糖 R-1并对其一级结构、分子量、理化性质等进行研究。
1 实验部分
1. 1 材料和主要仪器
材料采用本实验室自己培养的鬼毛针菌丝体 ,将菌丝体烤干即可。
岛津 FTIR-8000红外光谱仪 ,岛津 2000紫外可见分光光度计 ,岛津 GC17A气相色谱仪 ,岛津
LC-10液相色谱仪 ,岛津 Q P-5000质谱仪 ,布鲁克 DRX-400核磁共振仪 ,日立 282型分析超速离
心机 , BS-100A自动部分收集器。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 多糖的提取:将干燥的菌丝用 90℃热水提取多次 ,直到水溶糖提净为止 (提取液用酚-硫酸
检测至不显色为止 )。用 0. 1mo l /L NaOH浸提三次 (在氮气流保护下 ) ,浸出液用稀 HCl中和 ,将中
和后的沉淀物用 0. 1mol /L NaOH溶解 ,离心弃沉淀 ,滤液加 1倍甲醇醇析 ,如此反复醇析三次得
多糖 R-1。
1. 2. 2 多糖 R-1纯度检验和分子量测定:
a. 取 R-1 2mg用 0. 1mo l /L NaOH溶解 ,上 Sepha rose CL-4B凝胶柱 ( 1× 100cm ) ,用 0. 1mol /
L NaOH液洗脱 ,流速 2mL /10min,分部收集 ,酚 -硫酸法测糖分布并定出分子量 [2 ]。
b. 高效液相色谱法检验纯度和测分子量按文献 [3 ]进行。
c. 取多糖 10mg溶于 1. 0ml生理盐水中 , 15. 7℃下 , 55000r /min转速下超离心分析 , 15min后
拍照。
1. 2. 3 糖量与糖组成分析: 5mg样品 ,加 2mL浓度为 1mo l /L盐酸 -甲醇溶液 ,充 N2封管 , 80℃醇
解 12h,用氢氧化钠 -甲醇中和 ,减压蒸干 ,加 0. 2mL无水吡啶 ,再加硅烷化试剂衍生 (六甲基二硅
胺烷:三甲基氯硅烷= 2: 1)摇匀 ,进行气相色谱测定。色谱条件同文献 [2 ]。
·46· 化学通报 2000年 第 7期 h ttp: / /ww w. chemist rymag . o rgDOI : 10. 14159 /j . cnki . 0441 -3776. 2000. 07. 028
1. 2. 4 红外光谱测定按文献 [2]方法进行。
1. 2. 5 高碘酸氧化、 Smith降解及 R-2的制备:将 R-1 30mg加少量蒸馏水溶于 50mL容量瓶中 ,
再加 30mmo l /L的高碘酸钠 25m L定容 ,放在暗处反应 ,用 223nm紫外光谱法 [2 ]测反应物吸收值 ,
计算高碘酸消耗量 [4 ]。 测定值稳定后取 2mL氧化液加一滴乙二醇中止反应 ,加一滴溴甲酚红作指
示剂 ,用 0. 001mo l /L NaOH滴定甲酸生成量 ,在剩下氧化液中加乙二醇中止反应 ,透析 ,加
140mgNaBH4 ,室温 12h,然后加 50% HAC中和 ,透析 ,浓缩 ,加等体积 2mo l /L硫酸 , 25℃下水解
40h,用 BaCO3中和 ,抽滤 ,透析 ,袋内部分加乙醇醇析得 R-2。 依上法对 R-2做气相色谱和上琼脂
糖 CL-4B柱层析。
1. 2. 6 C-13核磁共振测定:将 R-1和 R-2样品各 10mg,分别溶于 1. 5mL DMSO(氘代 )中 ,温度
80℃ ,仪器为 Bruck DRX-400型 ,观察频率 100. 624M Hz,华尔兹去偶 , 5mm样品管 ,累加 74112。
1. 2. 7 甲基化实验: 1mg样品加入 0. 5mL DMSO,充氮气密封 ,充分搅拌 ,超声 5min后 ,磁力搅拌
使其全溶。加入 0. 5mL NaOH-DMSO混悬液和 0. 3mg碘甲烷 ,密封 ,磁力搅拌 7h,加入 2mL水停
止反应 ,加入 3m L氯仿 ,振荡 ,离心弃水层 ,用水洗氯仿层 ,蒸干氯仿 ,得甲基化多糖。以下步骤同文
献 [2 ]。
2 结果与讨论
2. 1 R-1纯度与组成
将 R-1超离心和琼脂糖凝胶 CL-4B柱层析及高效液相色谱分析检查均为单一对称峰 ,说明
R-1纯度很高。 用酚 -硫酸法测含糖量 98. 7%。 琼脂糖 CL-4B柱层析方法定出 R-1分子量大约为
200万 ,高效液相色谱法定出分子量为 196万。经气相色谱分析表明 R-1只含葡葡糖。
2. 2 R-1的结构分析
2. 2. 1 红外光谱分析: 890cm- 1处无吸收 ,表明无 β -D-糖苷键。
2. 2. 2 高碘酸氧化和 Smith降解分析: R-1经高碘酸氧化结果 ,平均每摩尔已糖残基消耗高碘酸
1. 0摩尔 ,释放甲酸 0. 48摩尔 ,说明平均每二个已糖残基有一个非还原末端或 1→ 6糖苷键 ,高碘
酸氧化产物经 Smith降解 ,产物水解衍生 ,经 G. C检测 ,袋内只检出甘油和葡萄糖 ,袋外只检出甘
油 ,未检出葡萄糖 ,说明袋内沉淀为葡聚糖。该葡聚糖经琼脂糖凝胶层析分子量大约为 110万 ,说明
1→ 3糖苷键构成了分子主键 ,侧键为 1→或 1→ 6糖苷键组成。
2. 2. 3 甲基化分析甲基化糖作气-质联用结果如表 1。
表 1 R-1的甲基化分析
峰数 甲基化糖 摩尔比 主要离子碎片 ( m /e) 键型
1 2, 3, 4, 6-Me4-Glc 1 43, 45, 71, 87, 101, 117, 129, 145, 161, 205 1→
2 2, 3, 4-Me3-Gle 1 43, 87, 99, 101, 117, 129, 161, 189 1→ 6
3 2, 3, 6-Me3-Glc 1 43, 45, 87, 101, 117, 129, 161 1→ 3
4 2, 4-Me2-Glc 1 43, 87, 117, 129, 189 1→ 3, 6
说明分子中存在 ( 1→ ) -葡萄糖残基 , ( 1→ 3) -葡萄糖残基 , ( 1→ 6) -葡萄糖残基和 ( 1→ 3, 6) -葡萄
糖残基。
2. 2. 4 13 C核磁共振分析: 将 R-1和 R-2进行 13 C核磁共振检测。 分别将二者的异头碳区、 C-3区、
C-6区比较如表 2。
·47·http: / /china. chemistrymag. o rg 化学通报 2000年 第 7期
表 2 R-1和 R-2的核磁共振的化学位移
糖单位 碳原子 R-1的化学位移 R-2的化学位移
→ 3) - Glc- ( 1→ c- 1 102. 4 102. 3
→ 6) - Glc- ( 1→ c- 1 100. 6
→ 3, 6) - Glc- ( 1→ c- 3 84. 9
→ 3) - Glc- ( 1→ c- 3 84. 7 84. 7
→ 6) - Glc- ( 1→ c- 3 76. 3
→ 3) - Glc- ( 1→ c- 6 63. 8 63. 9
→ 6) - Glc- ( 1→ c- 6 69. 0
很显然 ,经氧化再 Smith降解后 ,侧链 ( 1→ 6)糖苷键被去掉了 ,只剩下分子量小于 200万的 ( 1
→ 3)葡聚糖主链 ,说明 R-1和 R-2结构分别如图 1和图 2。
G16
G1
G1 36 1 G3 1G3 1G36
G16
G1
n
1G3 1G3 1G3 1 G3 1G3
图 1 R-1的结构 图 2 R-2的结构
参 考 文 献
[ 1 ] 田庚元 ,冯宇澄 .化学进展 , 1994, 6( 2): 114～ 124.
[ 2 ] 白日霞 ,张翼伸 .真菌学报 , 1990, 9( 2): 161～ 167.
[ 3 ] 张惟杰 . 复合多糖生化研究技术 . 上海:上海科技出版社 , 1987, 101～ 108.
[ 4 ] 梁忠岩 ,张翼伸 .高等学校化学学报 , 1983, 4( 3): 364～ 369.
(上接第 33页 )
4. National Center for Clean industrial and Treatment Technologies ( http: / /cpas. mtu. edu /
cencitt / )
1992年成立于美国 Michigan科技大学的研究协会 ,从事工业需要的清洁技术研究并关注政府和公众对环境
保护的兴趣。
5. Grdon Research Conf erence on Green Chemistry
( h ttp: / /w ww . g rc. uri. edu /prog rams /1999 /g reen. h tm)
第四届 Gordon系列会议中的绿色化学会议已于 1999年七月在牛津大学的 Queen s学院召开 ,会议的主席为
荷兰的 R. Sheldon教授和英国 York大学的 J. Clark 教授。 下一届绿色化学会议将于 2000年七月在美国
Connecticut学院召开。
6. The Consortium on Green Design andManufacturing
( h ttp: / /g reenmfg. me. berkeley. edu /g reen / Home /Index . h tml)
美国 Califo rnia大学 Be rkeley分校建立的网站 ,提供了与绿色技术有关的网站。
(下转第 53页 )
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