全 文 ：鬼毛针中碱溶多糖的结构和生物活性
白日霞
(大连民族学院化学工程系　大连 116600)
关键词　鬼毛针多糖 ,结构 ,抗肿瘤活性
中图分类号: O636. 1　　　　　文献标识码: A　　　　　文章编号: 1000-0518( 2001) 06-0487-03
2000-08-24收稿 , 2001-01-05修回
　　近年来多糖在治疗癌症、爱滋病和减缓衰老
等领域的免疫调节作用引起国际上的广泛关
注 [1 ] . 鬼毛针是一种药用真菌 ,临床验证它对三
叉神经痛、坐骨神经痛、偏头痛、眶上神经痛、面神
经麻痹、面肌痉挛及风湿性关节炎等均有一定疗
效 ,对中、轻腰肌劳损也有缓解作用 . 本文从鬼毛
针中分离、提取出一种碱溶多糖 R-1及其降解多
糖 R-2,其中 R-2是一种水溶性好、具有增强免疫
组织功能和抗小鼠肉瘤 S-180的作用 .
材料和提取: 采用东北野生鬼毛针子实体 ,将
菌丝体烤干后 ,用热水浸提 2次 ,每次 4 h,弃热水
提取物 ,留残渣 . 用含 2%尿素的 2% NaOH在 N2
气保护下浸提 3次 ,浸出液用 0. 1 mol /L HCl中
和后弃去上层清液 ,沉淀物再用 2% NaOH溶解 ,
离心弃沉淀 ,滤液加 1倍体积的甲醇醇析 ,反复醇
析 3次得碱溶鬼毛针多糖 R-1.
纯度和分子量的测定:
高效液相色谱法: 高效液相色谱仪为日本岛
津 LC-10型 ,采用 μ-Bondagel E-linea r柱 ,洗脱
剂为双蒸馏水 . 标准品葡聚糖为 Sigma公司产
品 .
Sepharose CL-4B层析法: 取 3 mg R-1,用
0. 1 mol /L NaOH溶解 , Sepha ro se CL-4B凝胶柱
( 1× 100 cm ) ,用 0. 1 mol /L NaOH液洗脱 ,流速
2. 0 mL /min,分部收集 ,酚 -硫酸法和蒽酮法测糖
分布并定出分子量 [2, 3 ] .
多糖的组成和红外光谱的测定:测定方法按
文献 [2]进行 . 气相色谱仪为岛津 GC17A型 ,红
外光谱仪为岛津 -8 000型 .
高碘酸氧化、 Smith降解及 R-2的制备:准确
称取 R-1 30 mg和 30 mmol的高碘酸钠用蒸馏
水定容于 50 m L容量瓶中 ,放在暗处室温下反
应 ,间隔时间取样 0. 1 mL,用蒸馏水稀释 250倍 ,
用岛津 UV-2 000型紫外分光光度计 ,以蒸馏水
作空白对照 ,在 223 nm波长处测光密度值 ,直到
光密度值恒定为止 . 加 1滴乙二醇中止反应 ,计
算高碘酸消耗量 [3 ] . 取 2 mL上述氧化液 ,加 1滴
溴甲酚红 (紫 )指示剂 ,用 1 mmol /L NaOH(用邻
苯二甲酸氢钾标定 )滴定甲酸生成量 .
将乙二醇处理后的氧化液中加乙二醇中止反
应 ,装透析袋 ,先自来水流水透析 30 h,再蒸馏水
透析 12 h. 浓缩 ,加 NaBH4还原过夜 . 然后加
50% HAC中和至 pH= 6～ 7,透析 ,流水及蒸馏水
各 24 h. 浓缩 ,加等体积 2 mol /L硫酸 , 25℃下
水解 40 h,用 BaCO3中和 ,抽滤 ,透析 ,袋内部分
加乙醇醇析得到将 R-1去掉支链后的多糖 R-2.
依上法对 R-2做气相色谱、液相色谱和上琼脂糖
CL-4B柱层析 .
多糖的甲基化: 称取 10 mg干燥的 R-1糖
样 ,溶于 3 m L二甲亚砜 ( 4A分子筛脱水 )中 ,充
N 2气封管后 , 25℃磁力搅拌 7 h至糖样完全溶
解 . 加 NaOH-DMSO混悬液 ( 120 mg 0. 177 nm
过筛的 NaOH与 3 mL二甲亚砜混合 ) ,充 N2气 ,
在 25℃磁力搅拌 ,加入 1. 8 mL碘甲烷 ,密封 ,磁
力搅拌 7 min,加入 3 mL蒸馏水中止反应 ,产物
用自来水流水透析 24 h ,再蒸馏水透析 24 h. 浓
缩至 10 m L,加入 10 mL氯仿 ,振荡 30 min萃取
甲基化糖 ,反复萃取 3次 ,合并萃取液 ,水洗萃取
液 3次 ,然后加无水 Na2 SO4干燥 24 h,过滤 ,蒸除
氯仿至 1 mL左右 . 作红外光谱检查至无
3 400 cm
- 1处吸收峰 . 干燥 ,加 85%甲酸 1 mL,
充 N2气封管 , 100℃水解 4 h ,加甲醇蒸除甲酸至
pH= 6～ 7,真空干燥 ,再加入 0. 5 mo l /L H2 SO4
1 mL, 100℃水解 20 h, 用 BaCO3中和 ,抽滤 . 滤
液加入 NaBH4 30 mg室温还原 24 h,过滤 ,向滤
液中加入甲醇蒸除硼酸 ,真空干燥 . 加乙酐、无水
第 18卷 第 6期 应 用 化 学 Vol. 18 No. 6
2001年 6月 　　　　　 CHINESE JOURN AL O F APPLIED CHEM ISTRY　　　　　 Jun. 2001
吡啶各 0. 5 mL,封管 , 100℃乙酰化 2 h,然后反
复加无水乙醇赶除乙酐 ,最后真空干燥 ,进行甲基
化多糖的气相色谱-质谱分析 . 质谱仪为岛津
QP-5 000型 .
C-13核磁共振测定: 采用 BRU CK DRX-400
型 NMR仪 , CDCl3作溶剂 ,温度 80℃ ,观察频率
100. 624 MHz, w altz去偶 . 累加次数 40 000.
抗肿瘤活性实验:将肉瘤 S-180移植到小白
鼠前肢腋皮下 ,每天按 1 mg /kg和 0. 5 mg /kg剂
量腹腔注射给药 ,连续 10 d,观察瘤平均大小和瘤
重变化 ,计算抑瘤率 .
将多糖 R-1、 R-2用水制成悬浮液 ,用已 3月
龄体 重为 10 g 的小 鼠腹 腔注射 , 剂量 为
50 mg / ( kg· d) ,连续给药 5 d,解剖测免疫组织
肝和脾的质量 .
结果与讨论
R-1的纯度与组成:将 R-1进行高效液相色
谱和琼脂糖凝胶 CL-4B柱层析检查为单一对称
峰 ,且 R-1水解后的气相色谱未发现有杂质峰 ,
说明 R-1纯度很高 ,用酚-硫酸法测含糖量为
98. 7% ,用蒽酮法测含糖量为 100% ; R-1的水解
产物的三甲基硅衍生物的气相色谱分析结果表明
它由葡萄糖所组成 ;高效液相色谱法测定出的分
子量为 1. 96× 106 u, Sepharose CL-4B层析法测
定出的分子量为 2. 00× 106 u; 红外光谱在
840 cm
- 1处检出有T-葡萄糖特征吸收 .
高碘酸氧化和 Smith降解分析:通过计算得
知 ,平均每摩尔己糖残基消耗高碘酸 1. 0 mol ,释
放甲酸 0. 48 mol ,说明多糖分子中平均每 2个已
糖残基有 1个非还原末端或 1→ 6糖苷键 . Smith
降解结果袋内只检出甘油和葡萄糖 ,袋外只检出
甘油 ,说明袋内沉淀为葡聚糖 . 该葡聚糖分子量
为 1. 10× 106 u,说明 1→ 3葡聚糖构成分子主键 ,
侧链是可被氧化断键 1→或 1→ 6糖苷键组成 .
13
C NMR分析:按文献 [4]的方法 ,对 R-1的
1 3
C NM R谱指认 ,结果见表 1.
表 1　R-1和 R-2的 13CNMR核磁共振的化学位移
Tab. 1　 The chemical shif t of 13CNMR
of R-1 and R-2
Sugar unit Carbon atom
Chemical
shi f t of R-1
Ch emical
shif t of R-2
→ 3)-Glc-( 1→ C1 102. 4 102. 3
→ 6)-Glc-( 1→ C1 100. 6
→ 3, 6)-Glc-( 1→ C3 84. 9
→ 3)-Glc-( 1→ C3 84. 7 84. 7
→ 6)-Glc-( 1→ C3 76. 3
→ 3)-Glc-( 1→ C6 63. 8 63. 9
→ 6)-Glc-( 1→ C6 69. 0
　　多糖的质谱: 为确定糖苷键的位置 ,对甲基化
的多糖 R-1,经水解、还原、乙酰化后的产物作色
谱 -质谱分析 ,结果列于表 2.
表 2　 R-1的甲基化产物的色-质分析
Tab. 2　 GC-MS analysis of methylated R-1
Peak Meth ylated sugar Reten tion time /min Molar ratio Main ion f ragm en ts (m /e) Linkage mod e
1 2. 3. 4. 6-Me4-Glc 1. 00 1 43, 45, 71, 87, 101, 117, 129, 145, 161, 205 1→
2 2. 3. 4-Me3-Glc 1. 15 1 43, 87, 99, 101, 117, 129, 161, 189 1→ 6
3 2. 3. 6-Me3-Glc 1. 40 1 43, 45, 87, 101, 117, 129, 161 1→ 3
4 2. 4-Me2-Glc 9. 02 1 43, 87, 117, 129, 189 1→ 3, 6
图 1　 R-1的结构
Fig . 1　 The str uct ur e of R-1
　　结合以上结果可知 R-1一级结构为图 1所 示 .
多糖的生物活性:连续给药 10 d后 ,摘取肉
瘤称重 ,计算抑瘤率= ( 1- m 2 /m1 )× 100% ,结果
如表 3. 其中 m 2为给药平均瘤重 ,m1为空白对照
表 3　R-1和 R-2的抗肿瘤 S-180活性
Tab. 3　 The inhibit ion rat io of R-1 and
R-2 against S-180 tumor
Sam ple Dose( mg· kg- 1· d- 1 ) Inhibi tion percentege /%
R-1 　 1× 10 14. 7
0. 5× 10 12. 2
R-2 　 1× 10 82. 7
0. 5× 10 92. 8
488 应 用 化 学　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 18卷　
平均瘤重 .
将难溶于水的多糖 R-1去侧链后 ,不仅水溶
性增加 , 抑瘤 活性也明 显增加 , 且剂量 以
0. 5 mg /kg组比 1. 0 mg /kg组效果好 .
多糖对小鼠免疫组织重量的影响结果如表
4.
表 4　 R-1和 R-2对小鼠免疫组织质量的影响
Tab. 4　 The ef fect of R-1 and R-2 on immunotissue of mice
Sample Num ber of mice Mas s on diss ecting /g Mass of liv er /mg Mass of splenocy te /mg
blan k 10 21± 1 476± 19 48± 7
R-1 10 21± 1 601± 36 91± 10
blan k 5 20± 1 461± 49 46± 6
R-2 5 20± 1 612± 81 101± 7
　　表明碱溶糖 R-1和水溶 R-2均可使小鼠免
疫组织肝、脾明显增重 ,是一个有开发价值的免疫
增强药物 .
参　考　文　献
　 1　 FAN G Ji-Nian(方积年 ) . Yaoxue X uebao (药学学
报 ) , 1986, 21( 12): 944
　 2　 BAI Ri-Xia (白日霞 ) , ZHAN G Yi-Shen (张翼伸 ) .
Zhenjun X uebao (真菌学报 ) , 1990, 9( 2): 161
　 3　 ZHAN G Wei-Jie (张惟杰 ) Ed (编 ) . Complex
Polysaccha rides Biochemical Resear ch Technique
(复合多糖生化研究技术 ) . Shanghai (上海 ):
Shanghai Science and Technolog y Press(上海科学
技术出版社 ) , 1987: 6
　 4　 BAI Ri-Xia (白日霞 ) . Fenx i Huaxue (分析化学 ) ,
1999, 27( 8): 969
Structure and Biological Activities of Alkaline Soluble
Polysaccharide fromMarasmius Androsaceus FR
BAI Ri-Xia
(Department of Chem ical Engineering ,Dalian National ity College ,Dalian 116600)
Abstract　 An alkaline so luble polysaccharide R-1 has been obtained by ex t raction wi th 2% NaOH
from marasmius androsaceus FR. and purified by chromatog raphy on Sepha ro se CL-4B and HPLC.
The GC-M S analy sis show ed i t appeared const ructed f rom g lucan. Through periodate oxidation,
Smi th deg rada tion, methyla ted analysis and 13 C NMR it rev ealed tha t R-1 has 1→ 3 Glc as main chain
and 1→ 6 Glc as side chain. The inhibition percentag e against S-180 tumo r o f R-2, which w as obtained
by elemination of it s side chains, w as 92. 8% .
Keywords　Marasmius androsaceus FR , polysaccha ride, st ructure, anti tumo r activi ty
489　第 6期 白日霞:鬼毛针中碱溶多糖的结构和生物活性