全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (8): 1307~1314　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0099 1307
收稿 2015-03-03　　修定 2015-08-03
资助 国家自然科学基金项目(31270663)和国家转基因生物新品
种培育科技重大专项(2014ZX08009-003-002)。
* 通讯作者(E-mail: lyzhang73@sohu.com; Tel: 010-
62336044)。
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析
周燕妮, 李艳芳, 张通, 张凌云*
北京林业大学林学院, 省部共建森林培育与保护教育部重点实验室, 北京100083
摘要: 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通
过RACE-PCR的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA全长, 共987 bp, 其中编码区723 bp, 共编码240个氨基酸。利用生物信
息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行分析, 结果显示, 该蛋白理论分子质量为26.84 kDa, 理论等电点为4.61,
有丝氨酸和苏氨酸结合位点, 为非跨膜的亲水蛋白。PwUSP2具有USP家族典型的UspA结构 域, 但无典型的ATP结合位点
G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中均有表达, 在果实中
表达量较高。同时, PwUSP2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等非生物胁迫下表达量有明显变化, 推测PwUSP2可能参
与青杄对逆境胁迫的响应。
关键词: 青杄; PwU SP2; 组织表达; 胁迫响应
Cloning and Expression Analysis of PwUSP2 from Picea wilsonii
ZHOU Yan-Ni, LI Yan-Fang, ZHANG Tong, ZHANG Ling-Yun*
Key Laboratory of Forest Silviculture and Conservation of the Ministry of Education, College of Forestry, Beijing Forestry Uni-
versity, Beijing 100083, China
Abstract: Universal stress proteins (USPs) involve in multiple abiotic responses includin g carbon starvation,
O2 deprivation, drought and high salinity; however, it still remains elusive in plants. In this study, the full length
cDNA of PwUSP2 was obtained using RACE-PCR method. Bioinformatics analysis showed that the full length
cDNA of PwUSP2 is 987 bp, including the open reading frame (ORF) 723 bp. The PwUSP2 contains 240 ami-
no acids with a theoretical molecular weight of 26.84 kDa and theoretical isoelectric points (pI) of 4.61. It is
also a hydrophilic protein with serine and threonine binding sites and has non-transmembrane domain. Mean-
while, it has the typical UspA domain of USP family but not the characteristic o f ATP-binding s ite G-2X-G-9X-
G[S/T]. RT-qPCR analysis showed that PwUSP2 was expressed in different tissues, while highly expressed in
fruit. Furthermore, the expression of PwUSP2 signifi cantly changed under abiotic stresses such as abscisic acid
(ABA) and methyl jasmonate (MeJA), indicating that PwUSP2 might be involved in response to multiple
stresses in plants.
Key words: Picea wilsonii; PwUSP2; tissue expression; stress response
广泛逆境胁迫蛋白(univers al stress proteins,
USPs)是一个 古老而保守的蛋白家族, 属于自磷酸
化丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)的磷酸蛋白, 可以作
为GTP和ATP的磷酸供体(Freestone等1997)。因其
在IEF-PAGE凝胶上的迁移率而被命名为C13.5
(VanBogelen等1990)。目前, 在细菌、古生菌、真
菌、原生动物和植物中均已发现USP的存在(Kvint
等2003)。
在大 肠杆菌中, USPs根据结构分析和氨基酸
序列可以分为4类: 第一类为UspA、UspC、UspD;
第二类为UspF、UspG; 第三类和第四类分别是
UspE的两种USP结构域蛋白(Nachin等2005)。
UspA是一种小的细菌蛋白, 它能在细胞受到饥
饿、有毒化学物质等一系列不利条件时, 增强细
胞生存能力(Nystrom和Neidhardt 1992, 1993,
1994)。在细菌中, UspA蛋白是USP家族中唯一的
与特定的生物学活性相关的蛋白(Zarembinski等
1998), 是USPA结构域家族中的一员。而USPA结
构域是以细菌中UspA蛋白所命名的一个蛋白结
构, Aravind等(2002)推测USPA结构域只是一个更
大的结构蛋白家族的其中一部分。他们还指出
植物生理学报1308
USPA结构域的最基本的功能可能是结合核苷酸和
参与信号转导。USPA结构域家族可被分为两类,
一类能与ATP结合, 有ATP结合位点, 如甲烷球菌
中的MJ0577 (1MJH); 另一类不能与ATP结合, 如流
感嗜血杆菌中的1JMV (Sousa和McKay 2001)。
Kerk等(2003)分析了44个与细菌USPA结构域相似
的拟南芥蛋白, 认为拟南芥中包含USPA结构域的
蛋白全部由近似于1MJH的蛋白演化而来。USP家
族能够参与一系列胁迫应答反应, 能在碳、氮、
磷、硫酸盐、氨基酸缺乏时表达量增加(Liu等
2007)。但在植物中只有一少部分USP家族的同源
基因被分离和克隆出来(Chou等2007; Maqbool等
2009), 且具体的生物学功能尚未研究清楚。
青杄属于松科(Pinaceae)、云杉属(Picea)植
物, 是中国特有的多年生木本针叶树种, 对恶劣的
环境有较强的适应能力。基于木本植物的生活史
较长, 突变体较难获得等原因, 目前对针叶植物的
生物学研究相对较少。本文通过RACE-PCR的方
法, 从青杄cDNA文库中克隆出PwUSP2的全长
cDNA序列, 并对其进行生物信息学分析, 预测其
理化性质、二级结构、三级结构等。同时用
RT-qPCR分析其在青杄各组织中的表达情况, 以及
在干旱、NaCl等非生物胁迫下的表达模式, 旨在
为深入研究青杄USP家族的功能提供基础。
材料与方法
1 植物材料
青杄(Picea wilsonii Mast)种子、花粉、果实
采集于中国科学院北京植物园, 成熟叶(多年生青
杄的多年生叶)、幼叶(多年生青杄的一年生叶)、
成茎(多年生青杄的多年生茎)采自北京林业大
学。将用于逆境胁迫实验的八周大的青杄幼苗置
于营养土和蛭石2:1 (V/V)混合的培养基质中培养,
温室中光周期为16 h光照, 8 h黑暗, 温度21 ℃, 空
气湿度50%~60%。各试验植物材料采集后用液氮
处理, 置于–80 ℃备用。
2 青杄PwUSP2全长cDNA的获得
青杄cDNA文库用gateway技术构建, 由Invit-
rogen公司完成(张盾等2012)。以青杄cDNA文库
为模板, 根据PwUSP2的EST序列与pDONR222载
体的序列设计引物。经5和3 RACE, 获得PwUSP2
末端序列, 与EST序列拼接后获得PwUSP2全长
cDNA。设计引物USP2-F和USP2-R (表1)扩增
PwUSP2的编码序列(coding sequence, CDS)区域,
将PCR片段连接到pEASY-T1载体上, 通过酶切和
测序进行验证。
表1 cDNA克隆和RT-qPCR引物序列
Table 1 Primers used in cDNA cloning and RT-qPCR
引物 序列(5→3)
5RACE-F CAGTCTTAAGCTCGGGCCCCA
5RACE-R GACGTTGTCACTGGGTCGGAG
3RACE-F GTACGCCCGACCAGCGTCCTC
3RACE-R CTGCCAGGAAACAGCTATGAC
EF1-α-F AACTGGAGAAGGAACCCAAG
EF1-α-R AACGACCCAATGGAGGATAC
USP2-F ATGGACGTTGGAAACAGGAAA
USP2-R TCATATTTGTTCCTTCTCTTC
USP2-RT-F TCAAGATTCACATCGTCAAGG
USP2-RT-R GCAATGGCGAACACAATAATC
3 生物信息学分析
利用DNAMAN软件进行PwUSP2的cDNA序
列的CDS区域分析 , 并得到其氨基酸 序列。在
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上用
BLAST找出其氨基酸序列的同源序列, 用ClustalX
和DNAMAN软 件进行多序列比对, 用MEGA5构建
系统进化树。用ProParam预测该蛋白分子式及不
稳定指数, 蛋白等电点和分子质量(http://web.ex-
pasy.org/protparam/)。用N etPhos对磷酸化位点进
行预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)。
用ProtScale分析蛋白疏水性(http://web.expasy.or g/
protscale/)。用FoldIndex进行无序化特征预测
(http://bip.Weizmann.ac.il/fldbin/findex)。用
TMHMM预测蛋白跨膜区域(http://www.cbs.dtu.dk/
services/TMHMM-2.0/)。用GOR4预测蛋白二级结
构(https://npsa-prabi.ibcpfr/cgi-bin/npsa_automat.
pl?page=npsa_gor4.html)。用SWISS-MODEL预测
蛋白三级结构(http://swis-smdel.expasy.or g/)。
4 组织特异性表达
利用Aidlab公司的RNA提取试剂盒提取多年
生青杄的花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶和成
茎的RNA, 通过Fast Quant RT Kit反转录试剂盒
(TIANGEN)反转录成单链cDNA, 均一化浓度之后
周燕妮等: 青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 1309
在Step One Plus Real Time RT-PCR仪器(ABI)进行
RT-qPCR实验, 检测PwUSP2在不同组织中的相对
表达量。用于RT-qPCR的特异性引物为USP2-RT-F
和USP2-RT-R, 以青杄EF1-α作为内参基因(Yu等
2011), 引物为EF1-α-F和EF1-α-R (表1), 试验设置3
次重复。
5 胁迫处 理
选取长势一致的八周大青杄幼苗 , 参考
Loukehaich等(2012)的方法进行胁迫处理: (1)幼苗
分别置于4和42 ℃金属浴中0、3、6、12 h和0、
1、3、6、12 h; (2)根浸入100 μmol·L-1脱落酸(ab-
scisic acid, ABA)中处理0、3、6、12 h; (3)根浸入
200 mmol·L-1 NaCl溶液中处理0、1、3、6、12 h;
(4)幼苗置于吸水纸上放置0、1、3、6、12 h。参
考Nakashima等(2007)的方法, 将根浸入100 μmol·L-1
茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)中处理0、1、
3、6、12 h。对照为正常生长的植株。所有试验
设置3次重复 , 取样后的材料进行液氮冻存 , 置
于–80 ℃备用。
实验结果
1 青杄PwUSP2基因的克隆
通过RACE-PCR方法获得PwUSP2基因的末
端序列, 与EST序列拼接后获得完整的cDNA序列
全长。PwUSP2基因cDNA 序列全长共987 bp, 编码
区共723 bp, 共编码240个氨基酸。在85 bp处为起
始密码子ATG, 805 bp处为终止密码子TGA, 968 bp
处为Poly(A)20尾巴(图1)。
图1 PwUSP2全长cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig.1 Nucleotide sequenc e of full-length cDNA and deduced amino acid sequence of PwUSP2
植物生理学报1310
2 生物信息学分析
2.1 功能结构域分析
用NCBI网站上的BLAST对PwUSP2蛋白进行
功能域分析, 结果显示PwUSP2蛋白有典型UspA结
构域, 但无ATP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]结构序
列, 推测其可能属于USPA家族中不能与ATP结合
的一类蛋白(图2-A)。
2.2 氨基酸组成及理化性质分析
采用ProParam工具预测PwUSP2分子质量为
26.84 kDa, 理论等电点为4.61, 分子式为C1160-
H1835N329O387S8, 其中缬氨酸(Val)含量最高 , 为
12.9%, 其次为谷氨酸(Glu), 含量为11.7%, 并带有负
电残基(Asp+Glu) 51个, 带有正电氨基酸残基(Arg+
Lys) 26个, 预测其半衰期约为30 h, 不稳定指数为
52.27, 预测蛋白不稳定。
用NetPhos预测磷酸化位点, 结果显示有12个
丝氨酸磷酸化位点, 有2个苏氨酸磷酸化位点(结
果未显示)。用ProtScale分析蛋白疏水性, 结果显
示, 在208位赖氨酸(Lys)和209位谷氨酸(Glu)分值
最小, 为–2.844, 亲水性最强, 在154位脯氨酸(Pro)
分值最大, 为2.356, 亲水性最弱, 预测蛋白为亲水
性蛋白(图2-B)。 采用FoldIndex预测蛋白质的无
序化特征, 结果显示, 在51~58、61~90、164~240
氨基酸处有无序化区域, 预测此蛋白有很强的动
态结构, 在行使功能时其蛋白构象容易发生变化
(图2-C)。用TMHMM预测蛋白跨膜区域, 整条多
肽链都位于细胞膜外, 不存在跨膜结构域(结果未
显示)。
2.3 二级结构和三级结构预测
用GOR4对PwUSP2蛋白的二级结构进行预
测, 发现PwUSP2中α-螺旋含量达到35.42%, 无规
则卷曲结构含量为46.25%, 延伸链含量为18.33%,
无β-转角结构(图3-A)。用SWIS S-MODEL预测
的三级结构与二级结构结果相似, 蛋白含有较多
无规则卷曲结构, 且在空间上存在一定距离(图
3-B)。
2.4 多序列比对和系统进化树分析
在NCBI网站上用BLAST对PwUSP2蛋白进行
同源检索, 找到其他物种中的同源蛋白: 拟南芥
AtUSP (AT1G11360.1)、丹参SmUSP (JX416284.1)、
大豆GmUSP (XM_003540282.1)、桃PpUSP (XM_
007211909.1)、葡萄VvUSP (XM_003633275.1)、
长春花CrUSP (KJ634235.1)、马铃薯StUSP (XM_
006343208.1)、黄瓜CsUSP (XM_004144433.1), 以
及本实验室之前研究的青杄PwUSP1蛋白(崔晓燕
等2014), 利用ClustalX和DNAMAN进行同源比对,
发现不同植物的U S P有一定的同源性 , 但除
PwUSP1蛋白有ATP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]
外, 其余均无此位点(图4)。用MEGA5构建系统进
化树显示, PwUSP2和其他物种中的USPs同源性不
高, 其中与丹参SmUSP同源性最高, 达52.21%。
3 PwUSP2的表达分析
3.1 组织特异性表达
用RT-qPCR技术测定PwUSP2基因在各组织
中的相对表达量, 结果显示, PwUSP2基因在果
实、成熟叶、成茎中表达量较高, 表达量相近, 在
种子中表达量最低(图5)。
3.2 对温度胁迫的响应
在4 ℃低温胁迫下, PwUSP2在处理3 h时表达
量上调, 6 h时表达受到抑制, 12 h时PwUSP2又被重
新诱导表达, 且达到最高值, 是对照的2.7倍(图
6-A)。PwUSP2在热激胁迫与冷胁迫下表现出不同
的表达模式, 42 ℃处理青杄幼苗后, 表达量先下降,
然后逐渐升高, 其中3 h时是对照的0.3倍(图6-B)。
3.3 对ABA和MeJA胁迫的响应
经ABA处理后, PwUSP2表达明显受到抑制, 3
和6 h时分别是对照的0.18和0.3倍, 12 h时为0.5倍
(图7-A)。而MeJA处理后, PwUSP2在1 h时表达量
即达到最高, 是对照的3.7倍, 在3 h时表达量出现下
降, 胁迫6和12 h后又被重新诱导, 呈整体上升趋势
(图7-B)。
3.4 对NaCl和干旱胁迫的响应
PwUSP2的表达量在NaCl处理1 h时显著上调,
达到对照的1.8倍, 而在3、6、12 h时表达量明显下
调, 维持在对照的0.5倍水平左右(图8-A)。干旱胁
迫下, PwUSP2在处理3和12 h时表达量分别达到对
照的2.3和2.6倍, 而在处理1和6 h时则无明显变化
(图8-B)。
讨　　论
本研究基于RACE-PCR方法获得PwUSP2全
长cDNA序列, 与传统方法相比, RACE-PCR方法有
周燕妮等: 青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 1311
简单、准确等优点(Borson等1992)。PwUSP2全长
cDNA共987 bp, 其中编码区723 bp, 起始密码子出
现在85 bp处。PwUSP2蛋白由240个氨基酸组成,
含有UspA结构域。研究显示, 在长时间胁迫条件
下, UspA能提高细胞的存活率, 表明PwUSP2可能
具有一定的响应逆境胁迫的能力。PwUSP2蛋白
中无典型的ATP结合位点, 即无G-2X-G-9X-G[S/T]
序列, 说明其可能属于USPA家族中不能结合ATP
的一类蛋白。生物信息学分析磷酸化位点结果显
图2 PwUSP2蛋白功能结构域(A)、疏水性( B)和固有无序化特征(C)分析
Fig.2 Protein functional domain (A), hydrophobicity (B) and inherent disordered characteristic (C) analyses of PwUSP2
图3 PwUSP2的二级结构(A)和三级结构(B)分析
Fig.3 Secondary structure (A) and tertiary structure (B) analyses of PwUSP2
示PwUSP2有12个 丝氨酸磷酸化位点和2个 苏氨酸
磷酸化位点, 与其作为GTP和ATP的磷酸供体的功
能相一致。多序列比对结果显示, PwUSP2与其他
物种中USPs同源性不高, 与丹参SmUSP同源性最
高, 达52.21%, 且均无ATP结合位点G-2X-G-9X-
G[S/T]结构序列, 这可能与USPs有两种不同的存
在形式有关, 一种是只含有USP结构域, 另一种是
USP结构域和其他结构域融合。
组织特异性表达结果显示, PwUSP2在青杄各
植物生理学报1312
图4 PwUSP2蛋白的多序列比对(A)和系统进化树 (B)
Fig.4 Multiple protein sequence alignment (A) and phyloge netic tree (B) of PwUSP2
组织中均有表达, 而其在果实和成熟叶中表达量
均较高, 表明其可能参与多种生命活动。目前, 在
细菌和植物中, 只有少数USPs基因被克隆和分离
(Sauter等2002), 且部分参与了多种逆境胁迫。如
番茄USP (SpUSP)通过ABA依赖型路径协同 膜联
蛋白共同参与干旱、盐胁迫等非生物胁迫(Louke-
haich等2012)。在大豆中, GmUSP在ABA、NaCl和
聚乙二醇(polyethylene, PEG)的胁迫处理下在不同
大豆品种中表达量均有明显变化(黄姗等2012)。
邝静等(2013)发现, 丹参USP (SmUSP)可能在丹参
非生物胁迫防御反应中发挥作用。木棉叶片在受
到水涝胁迫后GUSP1和GUSP2的表达量显著上升
周燕妮等: 青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 1313
(Maqbool等2009)。我们之前的研究显示PwUSP1
参与了盐和干旱胁迫(崔晓燕等2014), 本研究发现,
PwUSP1的同一家族基因——PwUSP2在不同非生
物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2受4 ℃低温诱
导, 表达量上调, 且在12 h表达量达到最高, 在42 ℃
热激胁迫下, PwUSP2呈现不 同的表达模式, 表达
量呈整体下降趋势; PwUSP2在ABA胁迫下表达量
出现下降, 与42 ℃热激胁迫模式相似, 而在MeJA
胁迫下, PwUSP2基因受到诱导, 表达量显著上调;
图5 PwUSP2在青杄不同组织中的表达水平
Fig.5 Expression levels of PwUSP2 in different tissues of P. wilsonii
图6 温度胁迫下PwUSP2的表达分析
Fig.6 Expression analysis of PwUSP2 under temperature stress
图7 A BA和MeJA胁迫下PwUSP2的表达分析
Fig.7 Expression analysis of PwUSP2 under ABA和MeJA stresses
图8 NaCl和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析
Fig.8 Expression analysis of PwUSP2 under NaCl and drought stresses
植物生理学报1314
另外, 在NaCl胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上
升后下降, 同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱
导上调。PwUSP2是广泛逆境胁迫蛋白, 本研究结
果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差异, 对不
同胁迫的反应时间也存在差别, 暗示其可能广泛
参与多种逆境胁迫响应。
植物在逆境条件下逐渐进化出一套适应和响
应逆境的机制。尽管USPs在植物中普遍存在, 但
其功能大部分仍然未知, 尤其是在蛋白功能调控的
分子机制研究方面尚不够深入(Isokpehi等2011)。
因此, PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参
与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。
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