全 文 ：中国种学我甫大攀母来 J C t I S T8 4 0 2 0
增 刊
J O U R N A L O F C H I N A U N I V E R S I T Y O F S C I E N C E A N D T E C H N O L O G Y
S U P P L EM E N T
《中国科学技术大学学报》 编辑部 1 9 8 4 年 6 月
多边膝沟藻和梭梨甲藻整体细胞和
其分离线粒体呼吸之比较 ’
张 小 云
( 生 物 系 )
摘 要
1
. 用氧电极呼吸测定仪测定 了多边膝沟藻和棱梨甲藻整体细胞 24 小时中呼吸
之变化及其与光照的关系 。
2
. 从多边膝沟藻和梭梨甲藻细胞中分离其线粒休 , 并同时测定它们 24 小时中
呼吸的变化和光照的关系 。
3
. 在同一时间点上 , 所测整体细胞和分离线粒体 之 呼 吸 曲 线 几 乎 是 一 致
的 , 只是细胞耗氧量要比线粒体的耗氧量大 。
4
。 多边膝沟藻和梭梨甲藻均属甲藻类 . 但有鞭毛能运动的多边膝沟藻的呼 吸
没有表现和光照有相应的联系 . 而无鞭毛不能主动运动的梭梨甲藻的呼吸却表现和
光照有相应的关系 。
10 8 1 年 g 月 7 日收到
. 本文于八一年七月完成于美国加州大学圣它巴巴拉分校细胞生物实验室 .
遥2 5
前 言
多边膝沟藻和梭梨甲藻同层双鞭毛类 , 有人认为是植物 , 归为双鞭藻成甲藻类 . 有人认
为是动物归为双鞭毛虫 . 都是生活在海水中的单细胞毕物 . 胞内有色素体 , 营光合作用 。 多
边膝沟藻有很厚的细胞壁 , 在细胞的纵轴和横轴有沟纹 , 并各有一根鞭毛 , 靠鞭毛打动能在
水中主动运动 。 细胞纵轴约长 45 产 左右 。 关于它的形态结构 、 发光 、 及其生理方面 的 研 究
已有较多的狠导 , 但未觅对其呼吸的研究报告 . 故本实验着重了解它的呼吸状况 , 包括整体
细胞和分离线粒体的呼吸变化 。 为了可以进行比较 , 对梭梨甲藻细胞和分离线粒体的呼吸也
作了测定 . 校梨甲藻有较薄的细胞壁 , 细胞个体较大 , 胞长轴可达 8 0 0 户左右 , 胞内有大 量
的色素体 , 」 不具鞭毛 , 不能主动运动只能被动漂浮 。 如此对具有不同运动形式 , 而又同属一
类的单细胞生物的呼吸进行比较 , 还是有意义的 。
; 奋材 料 与 方 法卜舒
. 多边膝沟藻和城翼
配制 f 2/ 培养液 < 1 谷
场称
角烧报内, 分别接种两种细胞 , 置人工光 照 1 5 0 户` 一 ’ “ m 恒
温 21 ℃ 下培养 。 并分成三对照组 , 分别置于 1 ) 连续光照 2 . )光照从 1 点一 23 点 。 3 ) 光
照从 23 点一次 日 n 点 . 一周后 , 便可采样测定 .
2
. 整休细胞呼吸洲定样品的制备
每隔四小时取一定量培养的多边膝沟藻 (量可视细胞生长密度而定 ) 。 先在显微镜下计
算每毫升中的细胞个数 . 然后求出所取样品的细胞总数 . 以柏式离心机 (约 2 8 0 0 转 /分 ) 离
心三分钟 , 使细胞沉淀底部 , 小心去掉上清液 , 用消毒的培养液加以洗涤 , 再离心 , 反复两
次 , 目的为清除夹在藻中的细菌 , 以免影响耗氧量的数据 . 然后将洗净的藻细胞加入 5 毫升
无菌培养液置入氧电极呼吸侧定仪中 , 在完全黑暗的条件下 , 记录其呼吸曲线 , 测定时间约
十五分钟左右 (要求曲线稳定 , 重复性好 ) . 根据曲线 , 用以下公式 < 2 > 可计算每个时间点
上每个细胞的能氧量 , 再根据不 同时间点上耗氧量的多少可以得出 24 小时内细胞呼吸 周 期
之变化曲线 。
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每个细胞耗氧量一 M F ` id v is on / “ m 诵十细胞数 一 川 o : /细胞
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“ 为测定时样品的温度 (氧电极测定仪有恒温系统 , 本实验测定温度为 20 ℃ ) .
S o a l e 为使用仪器时所选用的定标 .
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s io n/ 6 m in 记为录曲线经六分钟后所记录的毫伏 ( m V ) 数 . M o un t 为曲线上升 数 ,
M F 为倍增系数 。
梭梨甲藻的细胞样品制备几乎和多边膝沟藻相同 , 只是梭梨甲藻较大 , 漂浮能力强 , 不
宜用离心方法收集 , 而是用筛栩或微孔漏斗过滤收集 , 其它步骤均与上同 。
3
. 线粒休呼吸洲定样晶的材备
工2 6
每隔 4 小时取三倍于制备细胞样品的细胞数 ( 细胞数不能太少 , 否则得不到 明 显 的 变
化 ) 。 用上述方法收集 、 洗涤 、 然后将细胞置于援冲液中 (缓冲液为 0 . 4从 蔗 搪 溶 液 内 含
1 % 牛血清蛋白及 o . I M T ir s , 然后用 O . 25 M E D T A 调虚 P H二 7 . 8) , 以震 动 匀浆器破碎
细胞 . 多边膝沟藻约需破碎 2 分 30 秒 , 而梭梨甲藻只需破 碎 30 秒 . 镜 桔 95 % 以上细胞均
被破碎即可 , 若破碎时间太长 , 会造成叶绿体破碎 , 以致影响测定数据的准确性 . 然后在低
温离心 机 。℃ 中离心 , 第一次 4 8 0 9 1 0 分钟 , 沉淀未破碎细胞及胞壁的碎片 , 取出上清液 ,
第二次离心为 3。。。 g 离心 5 分钟 , 目的是沉淀叶绿粒 . 小心取出含有大多数线粒体的上清液
即置入氧电极测定仪中测定 。
梭梨甲藻细胞个体大 , , 线粒体较易收集 , 破碎细抱后只要用速度为 2 8 0 0 转 /秒的离心机
离心两次即可 . 第一次离心 30 秒 , 小心取出上清液再离心 2 分 30 秒去除叶绿粒 , 上清液便
可置氧电极测定仪中测定 。 以上整个制备过程都是在 。一 6℃ 中进行 , 而测定过 程 则保持恒
温 20 ℃ . 所得线曲用上述方法计算 。 求出每个细胞线粒体的耗氧量: 但是所 得 数 值均是相
对值 , 而不是绝对值 。 因为本实验主要是求 24 个时中每个时间点上细胞和其线 粒 体耗氧量
之比较 。 所以要求每次制备测定样品的操作程序和条件的控制必须严格一致 , 这 是 很 关 键
的 。
4
. 叶株案之洲定
在破碎细胞过程中难免要破碎一些叶绿体 , 从而使一些叶绿素混入被测 样 品 之 中。 因
此在每次测完呼吸之后 , 再测一下样品中所含叶绿素的量 , 以便作为参考数 值 (即 取 。 . 02 毫
升样品加海水稀释 10 0 倍 , 置萤光测定仪中测定 , 便可得知数值 ) . 每次测定 , 发现其量变
化不大 , 不足以影响氧量变化数值 , 故忽略不计 。
三 、 结 果
经多次实测定 , 发现多边膝沟藻的呼吸没有表现出周期性的变化 , 有时耗氧高峰出现在
光照下 , 有时又出现在黑暗中 , 无相对稳定的规律性 (见图 l ) 。
梭梨甲藻的呼吸则表现出一定的周期性 , 并且和光照变化有相应的关系 。 光照时细胞和
线粒体耗氧量增加 , 黑暗时耗氧量减少 . 如果在连续光照下 , 耗氧量较为一致 (见图 2 ) 。
梭梨甲藻细胞及分离线粒体的耗氧量均比多边膝沟藻大 。 梭梨甲藻细胞耗氧量 约 在 l x
1 0
一 ’ 一3 x l 。一 ’ 微升氧 /细胞 , 而分离线粒体在 1 x 1-0 `一 8 x 1 0 “ ` 微升氧 /线粒体 。 多边膝沟
藻整体细胞耗氧量约在 2 x 1 0 一 ` 一 6 x 1 0 ~ ` 微升氧 /细胞之间 , 而分离线粒体 在 。 . 5 x l 。 ~ ’ 一
6 x 1 0 ” 微升氧 /线粒体之间 。
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图 1
图 1 多边膝沟藻细胞和分离线粒体在不同光照下的耗氧曲线 .
分离线粒体 .
a ) 光照从 1 1 : 0 0一 2 3 : 0 0 . b ) 光照从 2 3 : 0 0一 1 1 : 0 0 . 。 )
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图 2 。
图 2 梭梨甲藻细胞和分离线粒体在不同光照下的耗氧曲线 .
一 ) 光照从 1 1 , 0 0一 2 3 , o o b ) 光照从 2 3 : 0 0一 1 2 : o o e ) 连续光照 .
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四 、 讨 论
多边膝沟藻和梭梨甲藻都是单细胞生物 , 它们的呼吸一是靠溶解在培养液中的氧直接渗
透过细胞壁而提供细胞呼吸 , 另一是由细胞内的叶绿体在光合作用下产生氧而提供线粒体呼
吸 , 因此影响细胞呼吸和溶解在培养液中的氧量有关 . 在本实验中 , 培养液的量 、 所接种的
细胞数及培养的时间长短均一致 . 为此只有一个因素可以影响细胞呼吸中氧量的增加 , 即在
光照下 , 细胞中的叶绿粒进行光合作用而释放氧 . 为此当光照时 , 细胞中氧量增加 , 呼吸中
耗氧量也升高了 , 相反在黑暗时 , 光合作用停止 , 能提供给细胞呼吸的氧量减少自然耗氧量
降低 ,细胞长期培养在这种条件下 ,便自然形成了光照下耗氧多 , 黑暗中耗氧少的呼吸周期 ,
同样具有叶绿粒 , 又同属一类的多边膝沟藻 , 却表现了不稳定的呼吸周期 。 有时耗氧高
峰出现在光照下 , 有时又出现在黑暗中。 致使人考虑到它具有的两条能动的鞭毛 , 细胞运动
是要耗氧的的 , 很可能是它的运动扰乱了它的呼吸周期 , 而表现无规律状态 。
从表面上看 , 梭梨甲藻的耗氧量比多边膝沟藻大近 10 倍 , 但如果从两种单细胞的 大 小
来看 , 前者的细胞几乎要比后者大 20 倍 , 因此实际上 多边膝沟藻的呼吸量 要 大 于 梭 梨甲
藻 , 这和它的运动是有关系的 。
分离线粒体耗氧量 , 几乎低于整体细胞耗氧量的 10 倍左右 。 这有两个可能性 , 其一 是
在分离线粒体过程中 , 有丢失和损坏的绝不是细胞中的全部线粒体 , 为此耗氧量低 , 其二是
维持整体细胞的氧量肯定要比单维持线粒体的氧量要高 .
在本实验中 , 分离线粒体的呼状吸态和整体细胞呼吸状态大致相同 , 这是较明显的 。
参 考 文 献
〔10 ]
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