全 文 ： Marine Sciences / Vol. 38, No. 3 / 2014 63
条斑紫菜类囊体膜蛋白质组双向电泳研究方法
周 伟1, 2, 3, 何林文1, 陆勤勤3, 朱建一4, 高 山1, 2, 杨睿灵5, 杨 芳5, 王广策1
(1. 中国科学院 海洋研究所 实验海洋生物学重点实验室, 山东 青岛 266071; 2. 中国科学院大学, 北京,
100049; 3. 江苏省海洋水产研究所, 江苏 南通, 226007; 4. 常熟理工学院 生物与食品工程学院, 江苏 常熟
215500; 5. 天津科技大学 海洋科学与工程学院 天津 300457)
摘要: 以蓝绿温和胶电泳为工具, 首次在国内用于条斑紫菜(Porphyra yezoensis)类囊体膜色素蛋白质
复合物的研究。结果显示: (1)利用非离子型去污剂十二烷基麦芽糖苷(DM)增溶条斑紫菜类囊体膜 ,
DM/Chla(w/w)15︰ 1 产生的效果较好, 在 BN-PAGE 胶中可以分离到较多较清晰的条带。(2)选取蔗糖
密度层 50%条带制备得到的类囊体膜样品进行第一向 BN-PAGE 和第二向 SDS-Urea-PAGE 电泳实验。
第一向电泳分离出 4 个蛋白复合物, 对第二向电泳胶上的 15 个蛋白点切取做质谱鉴定, 检测到 PSⅡ
47ku, PSⅡ 44ku, cytochrome f , PSⅡ D2, PSⅡ D1 等蛋白。本实验证实了温和胶电泳与 SDS 电泳结
合对于条斑紫菜这种原始红藻的类囊体膜研究方面应用的可行性。
关键词: 条斑紫菜(Porphyra yezoensis); 类囊体膜; 蓝绿温和胶电泳; SDS 尿素电泳
中图分类号: Q946 文献标识码: A 文章编号: 1000-3096(2014)03-0063-06
doi: 10.11759/hykx20130131002
紫菜 (Porphyra)是一类原始红藻 , 属于红藻门
(Rhodophyta)红藻纲 (Rhodophyceae)红毛菜亚纲
(Bangiophycidae) 红 毛 菜 目 (Bangiales) 红 毛 菜 科
(Bangiaceae)紫菜属(Porphyra)[1]。紫菜是世界上最重
要的栽培海藻之一, 目前我国的栽培物种包括长江
以南的坛紫菜和长江以北的条斑紫菜, 其中条斑紫
菜的产值最高。
长期以来, 对于光合作用研究主要集中在陆地
高等植物, 对于藻类方面的研究也大多集中在遗传
背景较清晰的海洋绿藻类等少数物种上, 关于红藻
的光合作用研究报道较少。红藻的光合系统结构与
高等植物大不相同 , 例如 , 红藻光系统Ⅱ的捕光色
素系统主要由附着在类囊体膜上的藻胆体构成 [2-3],
光合碳同化作用的关键酶 Rubsico 大小亚基编码基
因均存在于叶绿体基因组中等[4]。另外, 对于红藻的
光合作用研究也一直缺少较好的模式材料。紫菜生
活史周期短、便于室内培养、基因组小且减数分裂
阶段形成四分子等特点使其成为藻类尤其是红藻光
合作用研究的理想模式生物。
光合作用的基本反应都是在类囊体膜上进行 ,
这些反应是由存在于 PSⅠ、PSⅡ、Cytb6/f、ATPase
这 4 个复合物上几百个蛋白完成的。这些蛋白除了
负责把光能转化为电能外, 还有个别蛋白负责 4 个
复合物的组装、固定与调节[5]。处于不同进化层次上
的光合生物, 其光合膜上的色素蛋白质复合物结构、
组成和功能并不完全相同。红藻属于最原始的真核
藻类, 其光合作用进化地位处于蓝藻与高等植物之
间的过渡类型, 类囊体膜并不形成垛叠的基粒结构[6]。
研究探寻条斑紫菜类囊体膜上的蛋白组成与功能将
对了解掌握红藻的光合作用机制提供基础依据。
1991年, Schägger等[7]为了研究哺乳动物和真菌
线粒体中的蛋白质复合物, 建立了一种温和胶电泳
系统, 并称之为 blue-native polyacrylamidegel elec-
trophoresis(BN-PAGE). 它可以真实地反映叶绿体蛋
白质复合物的情况, 具有直观、高效、方便的优点和
被广泛应用于同类蛋白质组研究中的潜质。该温和
胶电泳系统与其他温和胶系统最明显的区别就在于,
电泳之前 , 考马斯亮蓝染液代替了阴极电极液 , 从
而使电泳和染色得以同时进行, 直观而快速地反映
了电泳的结果。在电泳时, 结合叶绿素的蛋白质复合

收稿日期:2013-05-25; 修回日期:2013-09-12
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (31272664); 国家海洋局项目
(201105023); 国家 863 科技计划项目(2012AA10A406); 江苏省科技支
撑计划项目(BE2012420, BE2011375); 江苏省农业科技自主创新项目
(Cx(12)2039); 江苏省三新工程项目(2011-2012, 2012-2013)
作者简介: 周伟(1982-), 女 , 江苏南通人 , 博士 , 助研 , 主要从事紫
菜育种与生理生化研究 , 电话 : 0513-85228262, E-mail: crasszhou
@yahoo.com.cn; 王广策 , 通信作者 , 男 , 研究员 , E-mail: gcwang
@qdio.ac.cn
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物呈绿色, 而不含叶绿素的呈蓝色, 因此称之为蓝
绿温和胶电泳。作者以蓝绿温和胶电泳为工具, 首次
在国内用于条斑紫菜类囊体膜色素蛋白质复合物的
研究。
1 材料与方法
1.1 材料来源
条斑紫菜叶状体采自江苏南通栽培海区, 取回实
验室后用消毒海水洗净, 阴干, 冻存于−80℃待用。
1.2 材料组织破碎
将叶状体放入高速组织捣碎机(上海标本模型厂)
中, 加入预冷的类囊体膜提取缓冲液(50 mmol/L Tris,
5 mmol/L EDTA, 1 mmol/L MnCl2, 1 mmol/L MgCl2,
2 mmol/L NaNO3, 100 mmol/L Sucrose, 0.5 mmol/L
K2HPO4, pH7.8)[8]。整个破碎过程在冰浴低光条件下
进行。将叶状体尽量搅碎, 在显微镜下检查碎片大小
小于 1 mm2。破碎后溶液经筛绢过滤, 去除细胞碎片,
滤液于 4℃避光保存。
1.3 超声波破碎细胞
将滤液保持在低温避光条件下进行超声处理
(JY92-II 超声波细胞粉碎机, 宁波新芝), 超声条件
输出功率 100 W, 工作时间 5 s, 间隙时间 15 s, 工作
次数 300次。
1.4 类囊体膜制备
将超声后样品进行超速离心 30000 rpm, 30 min,
4℃(Beckman Coulter, SW 32 Ti rotor), 所得沉淀
即为类囊体膜粗制品。将沉淀保持在低温避光条
件下 , 加入不含蔗糖的类囊体膜提取缓冲液 , 充
分研磨后重新悬浮。再进行蔗糖密度梯度离心 ,
30000 r/min, 4 h, 4℃(Beckman Coulter, SW 32 Ti
rotor), 不连续蔗糖密度梯度从下至上为 70%, 60%,
50%, 40%, 30%蔗糖浓度 , 每个梯度加入蔗
糖溶液体积分别为 2, 2, 2, 1, 1mL。超离后
吸出各条带 , 加入 10 倍无蔗糖缓冲液超离
30 000r/min, 30 min, 4℃, 去除样品中的蔗糖。所
得沉淀用无蔗糖缓冲液重悬, 分装后, 一部分用
Shimadzu UV-1800 分光光度计测定其吸收光谱,
其余冻存于–80℃待用。
1.5 Blue-native PAGE
BN-PAGE 参照 Nijtmans [9]进行: 取冻存样品,
解冻后离心 8 000g, 15 min, 去上清。沉淀用增溶
buffer(1.5 mol/L aminicaproic acid, 50 mmol/L
Bis-Tris/HCl pH=7.0)溶解后再加入 5% 十二烷基麦
芽糖苷(dodecyl-β-maltoside, DM)或 1% Triton X-100
进行增溶。去污剂/Chla(w/w)为 5︰1, 10︰1, 15︰1,
20︰1, 冰浴30 min~1h后离心8 000g, 10 min去除未溶
解的沉淀。上清加入 1︰10(v/v)上样 buffer(750 mmol/L
aminocaproic acid, 50 mmol/L Bis-Tris/HCl, pH 7.0
(4℃), 0.5 mmol/L EDTA, 5% Coomassie-blue G250)
后即可上样。电泳缓冲液阴极 A: 50 mmol/L
Tricine/15 mmol/L Bis-Tris/HCl, pH 7.0 (4℃)/0.02%
(w/v) Coomassie-blue, 阴极 B: 50mmol/L Tricine/
15 mmol/L Bis-Tris/HCl, pH 7.0 (4℃); 阳极: 50 mmol/L
Bis-Tris/HCl, pH 7.0 (4℃)。电泳在 Bio-Rad 的 Mini-
Protean III cell 装置中进行, 分离胶为 5%~13%梯度,
浓缩胶为 4%。凝胶大小为 10 cm×8 cm×0.075cm。电
泳在 4℃进行, 初始条件为 50 V, 30min, 进入分离胶
后为 120V, 当电泳前沿到达分离胶的一半时, 用阴
极缓冲液 B 代替阴极缓冲液 A。当蓝色前沿到达凝
胶底部时电泳结束。
1.6 SDS-Urea-PAGE 第二向电泳
将第一向电泳凝胶用处理液(6 mmol/LUrea, 5%
SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 50 mmol/LTris/HCl, pH
7.0, 20% glycerin)室温下平衡 1h, 去离子水清洗 3
次。将各复合物条带分别切下, 插入上样孔后进行第
二向电泳。电泳方法与常规 SDS电泳基本相同。12%
分离胶和 5%浓缩胶中均含有 6 mol/L尿素。电泳在
Bio-Rad 的 Protean II xi装置中进行, 凝胶大小为 20
cm×20 cm×0.1cm。电泳后凝胶用考马斯亮蓝 R250
进行染色。
1.7 质谱检测
将第二向电泳凝胶上的点切下后, 送至天津生
物芯片技术有限责任公司进行质谱检测。具体步骤
为将电泳染色后凝胶中的蛋白质点切成 1~2 mm2 大
小, 清洗几次后用含 50%乙腈, 25 mmol/L NH4HCO3
(100 µL , pH8.0)溶液浸泡胶块, 振荡 20 min后弃去溶
液, 重复 3次至胶块中蓝色褪尽。蒸馏水洗涤 1次。
加入乙腈脱水, 胶块变白, 然后室温抽干。脱水胶块
加入胰蛋白酶溶液 (10 mg/L Trypsin, 50 mmol
NH4HCO3, pH8.0)再水化, 37℃保温过夜。酶解胶块
加 40 µL 5%TFA于 40℃保温 1 h, 吸出上清, 加入
40 µL 5% TFA, 50% 乙腈于 37℃保温 l h, 小心吸出
上清, 抽真空干燥, 4℃保存待用。用 ABI 4700质谱
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仪分析, 数据在 NCBI非冗余(nr)、Swissprot数据库
进行了检索。
2 结果
2.1 类囊体膜的分离
样品经蔗糖密度梯度离心, 分成 3 条明显的绿
色条带, 分别位于 40%, 50%, 60%蔗糖密度层(图 1)。
位于离心管上端 30%蔗糖密度层的色素带为游离色
素和藻红蛋白, 其他较大的细胞碎片均沉于离心管
底部。对所得 3 条绿色条带进行可见光吸收光谱测
定 , 得到类囊体膜上蛋白的特征吸收峰 (图 2)。
434~438 nm和 680 nm左右为叶绿素 a的特征吸收峰,
488 nm左右和 627 nm左右处为辅助色素吸收峰, 其
中 488 nm为类胡萝卜素, 627 nm处可能是藻蓝蛋白,
418 nm为脱镁叶绿素 a吸收峰。所得 3条类囊体膜
条带的吸收光谱基本一致。

图 1 蔗糖密度梯度离心分离类囊体膜
Fig.1 Thylakoid membranes isolated by sucrose density
gradients

图 2 40%、50%和 60%蔗糖密度层类囊体膜可见光吸收
光谱
Fig. 2 Visible absorption spectra of thylakoid membranes
located at 40%, 50% and 60% sucrose layers

2.2 去污剂的选择
实验选用 40%蔗糖层分离到的类囊体膜进行去
污剂的筛选。尝试选用了两种不同的去污剂 Triton
X-100和DM对类囊体膜增溶, 以比较蓝绿温和胶电
泳分离的效果, 结果显示, 确定 DM/Chla(w/w)15︰1
产生的效果较好, 在 BN-PAGE胶中可以分离到较多
较清晰的条带。相比较而言, 用 Triton X-100增溶类
囊体膜时 , 只有少数膜蛋白复合物被分离 , 条带较
少, 显示增溶效果不充分(图 3, 图 4)。

图 3 Triton X-100和 DM增溶类囊体膜 BN-PAGE电泳图
Fig.3 BN-PAGE analysis of thylakoid membranes solubi-
lized by Triton X-100 and DM

图 4 不同浓度 DM增溶类囊体膜 BN-PAGE电泳
Fig.4 BN-PAGE analysis of thylakoid membranes solubi-
lized by different concentrations of DM

2.3 双向电泳
选取蔗糖密度层 50%条带制备得到的类囊体膜
样品进行第一向 BN-PAGE 和第二向 SDS-Urea-
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PAGE 电泳实验。如图 5, 第一向电泳得到 4 条清晰
的条带, 既分离出 4个蛋白复合物。为了进一步分析
类囊体膜蛋白复合物的组成, 将这 4 条带切下再做
第二向电泳 , 在此条件下 , 复合物各蛋白质亚基解
离, 依据各自分子质量不同而分离。如图 6, 在第二
向电泳中, 各蛋白质复合物的各个亚基可以被清晰
地分开。为了确定各个亚基的性质, 我们将第二向电
泳胶上的 15个蛋白点切取做质谱鉴定。其中 7个点
有结果, 其余 8个点未与数据库中蛋白序列比对上。
质谱结果 5: PSⅡ 47ku , 6: PSⅡ 44ku, 7: cyto-
chrome f , 8: PSⅡ D2, 9: PSⅡ D1, 13: PSⅡ D2 ,
14: PSⅡ D1 另外, 1、2、3、4、10、11、12、15号
点未检出。

图 5 BN-PAGE分离类囊体膜蛋白复合物
Fig.5 BN-PAGE analysis of protein complexes in thylakoid
menmbrane

图 6 双向电泳分析类囊体膜蛋白组成
Fig. 6 Two-dimensional analysis of protein composition of
thylakoid membrane
3 讨论
以等电聚焦(isoelectric focusing, IEF)为第一向
的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE), 是目前最
常用来分离蛋白质的技术。但一些分子质量较大的
蛋白质(大于 200 ku), 偏酸偏碱的蛋白质以及疏水性
较强的膜蛋白的分离, 采用 2D-PAGE往往不能得到
理想的结果[10]。BN-PAGE改进了第一向电泳, 使样
品保持复合物的活性在非变性条件下分离开。这一
技术的难点首先在于去污剂的选择与用量。去污剂
太少复合物不容易从膜上分离出来, 去污剂太强则
会导致复合物的降解。本实验采用了非离子型去污
剂十二烷基麦芽糖苷 dodecylmaltosi- de(DM), 这是
一种温和去污剂 , 能打断脂质间连接 , 而不破坏蛋
白质复合物的完整性。其次在电泳过程中以考马斯
亮蓝 G250 代替 SDS 使蛋白质复合物带负电荷。因
为 SDS 作为离子载体同时也会是很强的去污剂, 不
仅会解离蛋白质复合物, 还会使蛋白彻底变性。考马
斯亮蓝 G250则不会使蛋白变性, 而且在电泳的同时
进行染色, 含叶绿素的蛋白质复合物如 PSⅠ, PSⅡ
条带呈绿色, 不含叶绿素的蛋白质复合物条带呈蓝
色。另外第二向 SDS-PAGE 中加入了尿素, 提高了
蛋白的溶解效率。然而最终分离到的蛋白点还是不
多, 原因可能与第二向电泳前的胶处理不充分有关,
这方面技术还有待改进。
陈熙等[11]研究水稻类囊体膜蛋白分离出 8 个叶
绿素蛋白复合物。Kantzilakis[12] 研究单细胞绿藻
Scenedesmus obliquus也分离出 8个叶绿素蛋白复合
物。Kügler[13]用 BN-PAGE从菠菜的叶绿体中分离到
6个叶绿素蛋白复合物。本实验结果只有 4个叶绿素
蛋白复合物。高等植物的 PSⅡ捕光色素复合物是
Lhc1 至 Lhc6 其中由 Lhcb1 和 Lhcb2 组成的三聚体
是 PSⅡ主要的外周天线复合物[14]。而红藻的主要捕
光天线复合物是藻胆体, 其附着在类囊体膜的外表
面上, 通过锚定蛋白与类囊体的光合膜相联。本实验
中 , 制备类囊体膜样品采用的研磨 , 超声方法使得
藻胆体从类囊体膜上脱落下来 , 并发生解离 , 因此
电泳条带结果不呈现捕光天线复合物的蛋白成分 ,
与高等植物相比条带较少。
此外 , 第二向电泳结果的质谱分析 , 也只检测
到 PSⅡ有关的蛋白和细胞色素 b6f 连接蛋白等, 而
关于 PSⅠ的蛋白均没有检测出来。原因是分离到的
PSⅠ蛋白浓度较低 , 损失也较多 , 其蛋白量低于质
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谱检测要求, 导致没有成功检出。
温和胶电泳在研究叶绿体类囊体膜复合物的组
成、生物发生中具有十分重要的作用, 可使叶绿体
蛋白质复合物以近似天然的状态分离。高等植物的
叶绿体类囊体膜的研究已广泛应用这一技术, 并成
功分离出多个蛋白复合物。对于条斑紫菜这种原始
红藻的类囊体膜研究, 尚属于起步阶段, 本实验证
实了温和胶电泳与 SDS 电泳结合在这方面应用的可
行性。
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68 海洋科学 / 2014年 / 第 38卷 / 第 3期
Two-dimensional electrophoresis of thylakoid membrane pro-
teome in Porphyra yezoensis
Zhou Wei1, 2, 3, He Lin-wen1, Lu Qin-qin3, Zhu Jian-yi4, Gao Shan1, 2, Yang Rui-ling5,
Yang Fang5, Wang Guang-ce1
(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences,
Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Marine
Fisheries Institute of Jiangsu, Nantong 226007, China; 4. Department of Biology and Food Engineering,
Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China; 5. College of Marine Science & Engineering,
Tianjin University Science & Technology, Tianjin 300457, China)
Received: May, 25, 2013
Key words: Porphyra yezoensis; thylakoid membrane; BN-PAGE; SDS-Uera-PAGE

Abstract: The blue-native polyacrylamide gel electrophoresis was used for the first time in investigation of
thylakoid membrane proteome of Porphyra yezoensis. The results showed that: (1) dodecyl-β-maltoside was a
suitable detergent for the solubilization and stabilization of super-complexes of thylakoid membrane proteins.
The detergent/Chla ratio of 15︰1 gave the best solubilizing effect and a series of clear protein bands were ob-
tained using BN-PAGE assay; (2) The sample collected at 50% sucrose was separated by BN-PAGE in the first
dimension and then SDS-Urea-PAGE in the second dimension. Four protein complexes were separated by 1-D
BN-PAGE gels. 15 protein dots separated by 2-D SDS-Urea-PAGE were analyzed by MALDI-TOF MS and a
series of proteins including PSⅡ, 47ku, PSⅡ, 44ku, cytochrome f, PSⅡ D2, PSⅡ and D1 were confirmed.
These data demonstrated that combination of BN-PAGE with SDS-Urea-PAGE can be well used in study of
thylakoid membrane proteome of P. yezoensis.

(本文编辑: 梁德海)