全 文 ：应用与环境生物学报　2003 , 9(3):239～ 242 　 　
Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X 　 2003-06-25
　
蕹菜类囊体膜磷酸酯酶的分离纯化和部分性质＊
刘映秋　杜林方＊＊
(四川大学生命科学学院　成都　610064)
摘　要　使用 NaCl抽提 、硫酸铵分步沉淀 、离子交换和疏水柱层析等方法 ,从蕹菜叶绿体类囊体膜中分离纯化到一种
蛋白磷酸酯酶.SDS-PAGE 检测表明 , 这种磷酸酯酶的分子量(M r)为 14.9×103.该酶具有水解磷酸单酯类物质的活
性 ,水解 pNPP 的 Km 值为 1.76×10-6mol/ L;体外测活时最适 pH 为 5 ,属于酸性磷酸酯酶;该酶耐热 ,在 50 ℃时活力
达到最高 ,对 NaCl不太敏感;但 EDTA 和 NaF 可以明显影响该酶的活性.图 6 表 3 参 24
关键词　蕹菜;类囊体膜;磷酸酯酶;对硝基苯磷酸;去磷酸化
CLC　Q814.1
PURIFICATION AND PARTIAL CHARACTERIZATION OF A
PHOSPHATASE ON THYKOID MEMBRANE IN IPOMOEA AQUATICA
＊
LIU Yingqiu &DU Ling fang＊＊
(Col lege of Li fe S cience , S ichuan Universi ty , Chengdu　610064 , China)
Abstract　A phosphatase w as isola ted from the chlo roplast thylakoid membrane of I pomoea aquatica by NaCl extration , am-
monium sulfate precipitation , io n -exchange chromatog raphy and hydrophic chromatog raphy through Butyl-Toyopearl
650M column.The results from SDS-PAGE show ed that the enzyme was a pro tein w ith molecular weight(M r)of 14.9×
103.This phosphatase catalyzed hydroly sis of phosphate monoesters pNPP and had a K m of 1.76×10-6mol/ L.The pH 5
was optimal for the enzyme reaction , indicating it belonged to acid phosphatase , w hile the optimal temperature of enzyme
catalysis w as 50 ℃, suggesting it was thermostable.EDTA and NaF inhibited the enzyme activity intensively , however , it
was obviously that no effect o f NaCl was found on the phosphatase activity.F ig 6 , Tab 3 , Ref 24
Keywords　I pomoea aquatica;thylakoid membrane;phospha tase;pNPP;dephospho rylation
CLC　Q814.1
　　Bennett首次发现叶绿体类囊体膜蛋白可以磷酸化[ 1 , 2] ,
随后他人证实许多类囊体膜蛋白[ 3]和基质蛋白均可以进行磷
酸化[ 4] .近年来 ,许多研究表明 , 光系统 II(PSI I)蛋白的可逆磷
酸化参与了对光合作用的调节 , 如主要捕光天线蛋白(LHCI I)
的磷酸化和去磷酸化可以调节光能在状态 1 和状态 2 之间转
换和分配[ 5] .PSI I蛋白磷酸化和去磷酸化需要蛋白激酶和蛋
白磷酸酯酶的分别参与[ 6] .目前认为 , 只有膜结合蛋白激酶才
能使类囊体膜蛋白磷酸化.叶绿体含有两类蛋白磷酸酯酶:膜
结合的和基质的蛋白磷酸酯酶 ,它们都具有去磷酸化的生理活
性[ 5-9] , 但它们对环境 pH 、抑制剂 、二价阳离子的敏感度不同 ,
表明它们是两类不同的磷酸酯酶[ 10] .人们已从叶绿体中初步
分离到一些蛋白磷酸酯酶[ 10 ～ 15] .为了研究可逆磷酸化对 PSII
反应中心结构与功能的影响 ,我们从蕹菜叶绿体类囊体膜中分
离纯化到一种膜结合蛋白磷酸酯酶 ,利用其具有水解对硝基苯
磷酸(pNPP)的作用来检测酶的活性 , 并考察了温度 、pH、离子
收稿日期:2003-01-15　　接受日期:2003-03-18
＊国家自然基金(No.39970068)、教育部跨世纪优秀人才基金 、优秀青
年教师基金 、霍英东基金资助项目　Supported by the Nat ional Natu-
ral Science Foundat ion of China , T rans-century Excellen t Talent Foun-
dat ion of the Educational M inistry , Excellent Young Teacher Founda-
t ion and Huo Yingdong Foundat ion
＊＊通讯作者　Corresponding author(Email:dulinf@mail.sc.cninfo.net)
强度和抑制剂等因素对酶活性的影响 , 结果表明 , 这是一种新
的膜结合蛋白磷酸酯酶.
1　材料和方法
1.1　材 料
蕹菜(Ipomoea aquatica)购自市场;Hepes为 Merck 公司产品;
Mes、Bis为 Fluka公司产品;Acr、标准分子量蛋白购自 Sigma公司;
Q-Sepharose (FPLC)为 Amersham 公司产品;Butyl-Toyopearl
650M 系 TOYO SODA公司产品;其余药品均为国产分析纯.
1.2 　类囊体膜的制备
参考 Sun等人[ 11]的方法改进如下:洗净的蕹菜叶片于 0.
4 mol/ L山梨糖醇 、1 mmol/ L NaCl、25 mmol/ L Hepes-NaOH
(pH 7.6)的缓冲液中 ,捣碎过滤 , 滤液在 0～ 5 ℃和 3 000 g 下
离心 1 min , 取沉淀搅匀于 1 mmol/ L KCl、25 mmol/ L MgSO4 、
25 mmol/ L Hepes-NaOH (pH 7.6)中 ,溶液在 27 000 g 下离
心 2次 , 每次 5 min , 均取沉淀 , 悬浮于同样的缓冲液中 , 保存
于液氮中备用.
1.3　叶绿素含量的测定
叶绿素含量的测定采用 Arnon[ 16]法.
1.4　磷酸酯酶的分离
在 0～ 5 ℃条件下 , 类囊体膜﹝ ρ(chl)=0.2 mg/mL﹞加
入 NaCl至终浓度为 0.2 mol/ L ,分别在 40 000 g 下离心 3 次 ,
用时 30 min、15 min 、15 min , 合并上清液.所得抽提液加入固
体硫酸铵 ,进行分步沉淀.收集 30%～ 60%硫酸铵饱和度沉淀
组分 ,将其悬浮于 10 mmol / L Mes-NaOH(pH 6.75)缓冲溶
液中 , 置于 500 倍体积的 10 mmol/ L Mes-NaOH (pH 6.75)
中透析过夜.得到粗酶液 ,置于冰浴中保存[ 11] .将粗酶液上预先
用10 mmol/L Mes-NaOH (pH 6.75)缓冲溶液平衡好的 Q-
Sepharose(FPLC)离子交换柱 , 用含 1 0 mmol/ L Mes(pH
6.75)缓冲溶液的 0 ～ 400 mmol/ L NaCl溶液梯度洗脱 , 分部
收集 ,检测蛋白峰和磷酸酯酶活性峰 , 合并酶活力较高组分.透
析后再将其上预先用 10 mmol/ L Mes-NaOH (pH 6.0)缓冲
溶液平衡好的 Buty l-Toyopearl650M 柱 , 用含 10 mmol/ L Mes
-NaOH (pH 6.0)缓冲溶液的 0 ～ 1 mo l/ L NaCl溶液梯度洗
脱 ,收集洗脱各组分 , 检测磷酸酯酶活性.
1.5　磷酸酯酶活性及性质分析
1.5.1　磷酸酯酶活性测定　　反应液总体积 1.5 mL , 含 33.3
mmol/ L 柠檬酸缓冲液(pH 5.0)、0.067 mmo l / L MgCl2、0.67
mg/m L对硝基苯磷酸(pNPP)和50～ 80μg酶蛋白 , 置 37 ℃水
浴保温 30 min 后 , 加 0.2 mL 的 2 mol/ L NaOH 终止反应 ,在
752C 紫外可见分光光度计上测定 405 nm 处光吸收值.磷酸酯
酶的活力单位 U 定义为每分钟内每毫克酶蛋白催化 1 μmol
pNPP所需酶量[ 17] .
1.5.2　pH 对酶活性的影响　　考察 pH 的影响时 , 采用 3 种
缓冲溶液:柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0 ～ 6.6), T ris-
HCl缓冲液(pH 7.0～ 8.9),碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 9.0
～ 11.0).酶液在不同 pH 下放置 30 min 后 , 分别测定酶活性.
1.5.3　温度对酶活性的影响　　考察温度的影响时 , 分别将
反应液于 0 、5、10、20 、40 、60 、80 、100 ℃下反应 30 min , NaOH
终止反应后 ,测定 405 nm 处光吸收值并计算酶活力.
1.5.4　离子强度对酶活性的影响　　在 37 ℃和 pH 5.0条件
下 ,将酶样品分别加入到 0、0.05 、0.1、0.2、0.4 、0.6 、0.8 、1
mol/ L 的 NaCl溶液中 , 处理30 min 后测定酶活力 ,分析离子强
度对酶活性的影响.
1.5.5　EDTA 及 NaF 对酶活性的影响　　分别使用 5 、10 、
20、50 mmol/ L的 EDTA缓冲溶液处理分离得到的磷酸酯酶 ,
在 pH 5.0和不加入 MgCl2条件下 , 37 ℃放置 30 min 后 , 再测
定酶的活性.NaF 能够抑制类囊体蛋白的去磷酸化[ 10] .反应液
中分别加入 NaF 至终浓度为 5、10、20 、50 mmo l/ L ,测定酶的活
性 ,研究 NaF对磷酸酯酶活性的影响.
1.5.6　磷酸酯酶的 Km 值测定　　Km 值是酶的特征常数 ,
在特定反应条件下只与酶的性质有关 , 而与酶的浓度无关.在
其他条件不变的情况下 , 只改变底物 pNPP 的浓度:7.81×
10-7 、1.56×10-6、3.13×10-6、6.25×10-6、9.38×10-6、1.
25×10-5 、1.56×10-5 mo l/ L ,测定反应速度 , 根据米氏方程的
改写式 1/ v=K m/(vmax×[ S])+1/ vmax ,以 1/ v 对 1/ [ S] 作图
(其中 v 为反应速度 , vmax为最大反应速度 , [ S] 为底物浓度),
当纵坐标为 0 时横坐标 X =-1/ K m ,可求得 Km 值.
2　结果
2.1　磷酸酯酶的分离纯化和活性检测
类囊体膜的 0.2 mol/ L NaCl抽提液中 , 加入硫酸铵进行
分步沉淀 ,取 30%～ 60%饱和度沉淀组分 ,充分透析过夜得粗
酶液.粗酶液用离子交换 Q-Sepharose (FPLC)柱层析分离
(图 1), 收集酶活力较高的组分(18～ 22 管).再用 Buty l-Toy-
opearl 650M 进行疏水层析(图 2), 可以得到纯化的样品.SDS
-PAGE 参照杜林方[ 18]的方法 , 分离胶和浓缩胶浓度分别为
15%和 5%, 含 6 mol/ L 尿素 ,电泳后银染检测到一条蛋白带 ,
分子量为 14.9 ×103(图 3).
图 1　Q-Sepharose(FPLC)柱层析图
Fig 1　C hromatography on Q-Sepharose(FPLC)
图 2　Butyl-Toyopearl 650M 柱层析
Fig 2　Chromatography of Butyl-Toyopearl 650M
图 3　纯化磷酸酯酶的 SDS-PAGE
Fig 3　SDS-PAGE of the purified phosphatase
240 　　　　　　　　应 用与 环境 生物 学 报　　Chin J Appl Environ Biol　　　　　　　 　　　　　　　　　　9卷
　　分离纯化过程中使用 pNPP 为底物 , 在 pH 5 时检测磷酸
酯酶活力的变化(图 1 、2), 经 Q 柱离子交换和 Butyl-Toy-
opearl 650M 疏水柱层析分离 , 纯化得到样品的磷酸酯酶比活
力明显提高 ,纯化倍数为 165 倍(见表 1).
表 1　提纯过程中各步骤产物的酶活性(λ)
Tab 1　Activity of phosphatase in the purification procedures
步骤
v/mL mpto/mg λpH5/U λpH5/ U mg -1 纯化倍数Purif ication
类囊体膜 74.50 321.23 11.886 0.037 1
粗酶液 7.35 32.37 2.557 0.079 2.14
FPLC-Q 4.15 8.452 1.817 0.215 5.81
Butyl-Toyopearl 650M 2 0.174 1.068 6.140 165
2.2　pH 对磷酸酯酶活性的影响
前人研究表明 ,根据最适 pH 可将磷酸酯酶分为酸性磷酸
酯酶和碱性磷酸酯酶 ,前者最适 pH 为 7 以下 , 后者的最适 pH
为7 以上[ 5 , 9] .不同 pH 下测定磷酸酯酶活性的结果显示 , pH
3.0 ～ 5.0 时 ,随反应液酸度减小活力逐渐增高 , pH=5 时酶活
力最大;pH 5.0～ 11.0 时 ,随 pH 值增大而酶活力减小(图 4).
此结果表明纯化的酶属于酸性磷酸酯酶.
图 4　pH 对磷酸酯酶活性的影响
Fig 4　Ef fect of pH on the activity of phosphatase
2.3　温度对磷酸酯酶活性的影响
实验结果表明 ,随反应温度的升高 , 纯化的磷酸酯酶的活
力逐渐升高 ,当温度达到 50 ℃时活力最高 , 之后迅速下降(图
5).此酶耐热的性质符合叶绿体类囊体膜结合的磷酸酯酶具有
耐热的特点 ,其生理意义有待进一步研究.
2.4　离子强度对磷酸酯酶活性的影响
当NaCl浓度从 0增加到 1.0 mol/ L时 ,磷酸酯酶活力随 NaCl
浓度的增加而有所增大 ,只是在盐浓度为 0.6 mol/ L时 ,活性略有
下降.这表明NaCl浓度增加对酶活力的影响较小(图 6).
2.5　EDTA 及 NaF 对磷酸酯酶活性的影响
EDTA和 NaF 的浓度分别为 0、5 、10 、20 、50 mmol / L(见
表 2和表 3).EDTA的浓度达到 20 mmol / L 时 , EDTA对磷酸
酯酶的抑制作用已经饱和 , 再升高 EDTA 浓度对酶的抑制能
力作用提高并不明显.5 mmol / L NaF可抑制 30%左右的磷酸
酯酶活力 , 10 mmol / L NaF 时 , 磷酸酯酶的活性被抑制了 82.
30 %, 50 mmo l / L时 NaF时 , 磷酸酯酶活性几乎完全被抑制.
图 5　温度对磷酸酯酶活性的影响
Fig 5　Ef fect of tem peratu re on the activities of phosphatase
图 6　离子浓度对磷酸酯酶活性的影响
Fig 6　Effect of ion concent ration on the activities of phosphatase
表 2　EDTA 对磷酸酯酶活性的影响
Tab 2　Effect of EDTA on the activity of phosphatase
ρ(EDTA)/ mmol/ L 0 5 10 20 50
λ/U 3.145 2.580 1.396 0.876 0.791
r i/ %＊ 0 % 17.97 % 55.62 % 72.15 % 74.85 %
　　　＊抑制比:加入不同浓度 EDTA 后磷酸酶活性下降值与不加 EDTA 时酶的活性之比.
　　　　Inhibit ion rat io:It means the activities of phosphatase added w ith of w ithout EDTA.The same below.
表 3　NaF 对磷酸酯酶活性的影响
Tab 3　Effect of NaF on the activity of pho sphatase
c(NaF)/mmol L -1 0 5 10 20 50
λ/U 3.145 2.178 0.557 0.295 0.035
r i/ %＊ 0 30.75 82.30 90.62 98.89
　　　＊见表 2(See Tab 2)
241　3期 刘映秋等:蕹菜类囊体膜磷酸酯酶的分离纯化和部分性质 　　
2.6　磷酸酯酶的 Km 值测定
在不同底物浓度下测定酶促反应速度 ,用双倒数作图法求
得酶水解 pNPP 的 K m 值为 1.76×10-6mol/ L.
3　讨论
类囊体膜结合的磷酸酯酶可以催化磷酸化蛋白进行去磷
酸化 ,进而参与调控类囊体膜蛋白的可逆磷酸化.部分实验结
果表明 ,可能有多种叶绿体类囊体膜磷酸酯酶的存在[ 19 -21] .
Bennett[ 2]和 Hammer等人[ 12]的结果显示 , 碱性磷酸酯酶参与
了类囊体膜上蛋白的去磷酸化 , 而 Sun 等人[ 22]则认为起作用
的是酸性磷酸酯酶.我们从蕹菜叶绿体类囊体膜中分离纯化到
一种膜结合蛋白磷酸酯酶 ,发现其对环境 pH、抑制剂 、二价阳
离子的敏感度与以前分析的种种磷酸酯酶[ 10 ～ 15 , 22] 都不完全
相同 ,表明这是一种新的膜结合蛋白磷酸酯酶.
pH 影响的结果表明 ,在酸性条件此酶具有较高的活力 ,说
明它是一种酸性磷酸酯酶 ,再次证明了类囊体膜上酸性磷酸酯
酶的存在[ 22] .温度影响的结果显示 ,我们纯化得到的这种磷酸
酯酶在较高温度(40～ 70 ℃)时具有高活力 ,在 50 ℃时达到最
高 ,虽然这样的高温在绝大多数植物生长的自然条件下比较
少.有人认为叶绿体类囊体膜蛋白的去磷酸化在植物生长的环
境温度上升过程具有重要作用[ 23] ,因为温度急聚升高会直接
引起叶绿体类囊体膜上蛋白的去磷酸化.对类囊体光合膜蛋白
去磷酸化的动力学研究表明 , 温度升高时 PSII 核心蛋白的去
磷酸化显著增加 ,温度由 22 ℃升至 42 ℃时 , PSII 反应中心 D1
蛋白和 CP43 的去磷酸化速度加快 10倍[ 24] .
EDTA 对纯化的磷酸酯酶有强烈抑制作用 , 20 mmol / L
EDTA 可抑制 70%的酶活 , 由于 EDTA 是含金属离子酶的抑制
剂,该结果说明此种磷酸酯酶具有金属离子依赖性.而 NaF 的
浓度上升到 50 mmol / L 时, 磷酸酯酶的活性被抑制了 98.89
%,酶活性几乎完全丧失.前人实验表明 , NaF能够抑制类囊体
膜蛋白的去磷酸化[ 10] .本文 NaF对纯化的酶具有强烈的抑制作
用, 表明纯化的磷酸酯酶可能参与了类囊体膜蛋白的去磷酸化.
蛋白磷酸酯酶对蛋白质生理功能的调节起重要的作用 , 但
人们对 PSII 蛋白复合体可逆磷酸化过程中的去磷酸化和磷酸
酯酶的了解还比较少 ,其生理作用 、调节机理和过程还有待进
一步深入研究.本文通过层析分离得到的磷酸酯酶在以前的相
关文献中未见报道 ,并且这种磷酸酯酶对高温具有较强的耐受
性 ,在 pH 5 有最高的活性 , 且受到 NaF 以及 EDTA 的明显抑
制 ,这说明这是一种典型的酸性磷酸酯酶 , 可能参与了环境温
度变化过程中植物类囊体膜蛋白的去磷酸化调节.
作为光合作用中一个重要调节机制 ,蛋白可逆磷酸化的深
入研究将推动高效利用光合作用 、作物育种 、生物界中能量分
配等方面的发展.
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