全 文 ： 12 海洋科学 / 2015年 / 第 39卷 / 第 3期
条斑紫菜 SSU 中内含子分析
李星辰, 徐佳杰, 姮林中 , 沈颂东
(苏州大学 医学部基础医学与生物科学学院, 细胞生物学系, 江苏 苏州 215123)
摘要: 根据 GenBank中已知的条斑紫菜(Porphyra yezoensis)SSU和 LSU rRNA基因序列分别设计引物,
分别以混合个体和单个个体的基因组 DNA以及 cDNA为模板进行扩增, 测序分析后推测 SSU rRNA基
因中的内含子转录后加工可能仍被保留, 而在 LSU rRNA 基因上游序列中没有发现内含子。长 511bp
的内含子位于 SSU rRNA 基因序列的上游, 其插入位点为 TCTGGTG-CCAGCAGCC, 内含子 5′ 和 3′
端的核苷酸序列分别为 AAC-和-ATGG。该内含子的剪接位点以及保守区 P, Q, R, S与 I型内含子是不
同的。研究发现, 在同种紫菜中, 不同个体 SSU 基因中内含子的有无、分布及结构特征是不同的, 说
明内含子对于分类是不太适合的。但是内含子的长度以及核苷酸序列在种间又具有一定的特异性, 可
以为红藻种间以及种内亲缘关系较远的亚种和不同地理群的区分和鉴定提供参考。
关键词: 条斑紫菜(Porphyra yezoensis); rRNA基因; 内含子; 同质性; 系统发育
中图分类号: Q523+.8 文献标识码: A 文章编号: 1000-3096(2015)03-0012-07
doi: 10.11759/hykx20130930001
核糖体 RNA 是由核糖体 DNA(rDNA)编码。核
糖体 DNA在分子系统发育研究中具有重要作用, 一
直是研究的热点。rDNA是由一些高度重复的序列组
成 , 在真核细胞中有几十甚至数千个拷贝 , 以簇的
形式存在于一条或多条染色体的核仁组织区。真核
生物的基因大部分都是断裂的, 编码区被居间序列
或者内含子分隔开来。
内含子是真核生物基因组中的一种独特成分 ,
在基因演变过程中起到了重要作用。其中 I型内含子
是具有特定的高级结构以及能够自我剪切的一类
RNA 分子家族[1], 存在于真核生物的细胞器(线粒体
和叶绿体)基因, 低等真核生物核的 rRNA基因中, 细
菌和噬菌体的个别基因中。I型内含子已经在病毒[2]、
细菌[3] 、真菌[4, 5]、植物、原生生物的核糖体 RNA
基因(rDNA)中被发现[6]。典型的 I型内含子具有保守
的二级结构, 包括 9个碱基配对区(P1-P9), 4个保守
序列 P、Q、R、S, 以及 5′ -U和 G-3′ 剪切位点。 Stiller
等[7]在不同种紫菜的核 SSU rRNA基因中发现了大的
插入序列, 并且指出它们具有差异性。Oliverira 等[8]
推测这些内含子可以用来区分不同地理群的紫菜。
条斑紫菜(Porphyra yezoensis)在分类学上隶属
于红藻门(Rhodophyta)、原红藻纲(Rhodophyphyta)、
红毛菜目(Bangiales)、红毛菜科(Bangiaceae)、紫菜
属(Porphyra), 是中国最重要的经济海藻, 在江苏沿
海和辐射沙洲大规模栽培, 面积超过 13000ha。条斑
紫菜生活史是异形世代交替, 具有大型的叶状体(配
子体)和小型的丝状体(孢子体)世代。一个叶片即一
个紫菜个体, 可以在个体水平上对条斑紫菜进行研
究 , 避免了混合个体基因组的干扰 , 能够准确的进
行分子生物学研究。由于条斑紫菜生物学方面的重
要性, 很多研究者把条斑紫菜作为研究海藻生理和
遗传学的海洋模式植物[9]。本研究采用 PCR 扩增及
TA 克隆测序的方法, 对来自江苏南通如东紫菜育苗
基地的条斑紫菜进行了核糖体 RNA 基因片段中内含
子的序列分析。探讨了核糖体大小亚基中内含子的特
点以及其对分类鉴定的作用, 为不同种、亚种以及其
他不同地理群的条斑紫菜的研究提供了分子依据。
1 材料和方法
1.1 材料和主要试剂
栽培条斑紫菜叶状体, 采自江苏南通如东紫菜
育苗基地。RNA 提取试剂盒、RT-PCR 试剂、


收稿日期: 2014-05-11; 修回日期: 2014-09-26
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(41276134)
作者简介: 李星辰(1989-), 女, 硕士研究生, 研究方向为藻类分子生物
学, E-mail: lixingchen2222@126.com; 沈颂东, 通信作者, 男, 教授,
E-mail: shensongdong@suda.edu.cn
Marine Sciences / Vol. 39, No. 3 / 2015 13
Recombinant DNase I均购自大连宝生物公司, 克隆
载体 pEASY-T3购自北京全式金生物技术有限公司。
引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成, 氯仿、异
丙醇、DEPC、乙醇等其他常规试剂均为进口或国产
分析纯。
1.2 DNA提取
本实验利用 CTAB 法[10]分别提取条斑紫菜混合
个体以及单个体的 DNA。提取的 DNA 在室温下干
燥后用 TE (pH = 8.0) 溶解, 用 1%的琼脂糖凝胶电
泳检测 DNA质量。
1.3 RNA提取及基因组 DNA的去除
按照 RNA抽提试剂盒操作说明分别提取条斑紫
菜混合个体和单个体的 RNA。电泳和核酸蛋白定量
仪检测RNA的完整性、含量和纯度, −80℃保存备用。
用 Recombinant DNase I去除基因组 DNA, 用琼脂糖
凝胶电泳检测消化反应后的 RNA。
1.4 cDNA的合成
按照 PrimeScript RT-PCR Kit中的操作说明进行
反转录反应, 得到的 cDNA在−20℃条件下保存备用。
1.5 引物和 PCR
根据GenBank中已有的条斑紫菜SSU rRNA基因序
列(GeneBank accession number: JN104582) 设计特异性
引物, SF (5′ –CGACTCACGAAGGGTGGTAT TT-3′ ), SR
(5′ -GGACCATTCAATCGGTAGGAGC-3′ ), 目的片段长
度为 2008 bp; 根据 LSU rRNA 基因序列 (GeneBank
accession number: JN104580)设计特异性引物 , LF
(5′-CGGGTTGTATAGTAAAGTGGTGTC-3′), LR (5′ -
ACCAGTTCT AATCCGTTCGTTG-3′), 目的片段长
度为 2083bp。用这两对引物分别对混合个体和单个
体的基因组DNA以及 cDNA进行 PCR扩增, 反应液
的总体积为 50L, 包括 : 模板 DNA 4L, dNTP
Mixture (2.5mM each) 5L, 上下游引物(20mol/L)
各 1L, 10×LA PCR Buffer II (Mg2+plus) 5L, Ta-
KaRa LA Taq (5U/L) 0.5L, 最后补加 dH2O至体积
50L。扩增反应在 TaKaRa PCR基因扩增仪上进行,
PCR 反应条件为 95℃预变性 3 min, 30 个循环包括
94℃变性 30 s, 56℃退火 30 s, 72℃延伸 2 min, 72℃延
伸 7 min。PCR扩增产物以 1%的琼脂糖凝胶电泳检
测, 用凝胶成像系统成像并记录结果。
1.6 PCR产物的克隆及测序
切胶回收的目的片段与克隆载体 pEASY-T3
25℃连接 10~15min, 转入 Trans1-T1 感受态细胞中,
在含有 IPTG, X-gal, Amp+的 LB平板上培养过夜。使用
菌液 PCR 的方法鉴定阳性重组子。每个平板至少送 3
个阳性克隆到苏州金唯智生物技术有限公司测序。
1.7 生物信息学分析
用BLAST软件进行序列同源性比对和相似性搜
索, 确定内含子的序列。分别对以基因组和 cDNA为
模板扩增出的序列进行比对, 确定序列之间是否具
有差异性。用 DNAMAN 软件将本实验得到的内含
子与 Porphyra yezoensis (GeneBank accession number:
AB013177) 上游内含子进行序列比对。运用软件
MEGA5, 通过最大似然法(Maximum Likelihood, ML)
将得到的内含子序列与 NCBI 中已经公布的其他紫
菜种的上游内含子序列以及不同种的 SSU rDNA 外
显子序列进行系统树构建。
2 结果
2.1 以混合个体及单个体基因组 DNA为模
板的 PCR扩增
分别以条斑紫菜混合叶状体和单个体基因组
DNA 为模板, 进行 SSU 和 LSU rDNA 的 PCR 扩增
反应。图 1显示混合个体基因组 DNA SSU rDNA扩
增出两条比较清晰的条带, 两者相差约 500bp; LSU

图 1 以条斑紫菜混合叶状体基因组 DNA为模板 PCR扩
增 SSU和 LSU rDNA的电泳图
Fig.1 The electrophoresis image of SSU and LSU rDNA
fragments amplified by PCR. Genomic DNA of
mixed Porphyra yezoensis was used as template
M. 表示 DNA分子质量标记 DL-5000; 1~2.PCR扩增 SSU rDNA;
3~4.PCR扩增 LSU rDNA
M shows the DNA molecular weight marker DL-5000; Lane 1 and
lane 2 are the PCR products of SSU rDNA; Lane 3 and lane 4 are the
PCR products of LSU rDNA
14 海洋科学 / 2015年 / 第 39卷 / 第 3期
rDNA只扩增出了一条带, 长度约为 2000bp, 与目的
片段长度相符。
以 3 个个体基因组 DNA 为模板分别进行 SSU
和 LSU rDNA的 PCR扩增反应, 由图 2可以看出, 不
同个体 SSU rDNA PCR扩增出单一条带, 且条带长
度不同, 这种现象与混合基因组 DNA SSU rDNA扩
增出两条带相吻合; LSU rDNA PCR扩增出与图 1中
相同的一条带。

图 2 以条斑紫菜单个体基因组 DNA 为模板 PCR 扩增
SSU和 LSU rDNA的电泳图
Fig.2 The electrophoresis image of SSU and LSU rDNA
fragments amplified by PCR. Genomic DNA of
Porphyra yezoensis individual was used as template
M. 表示 DNA分子质量标记 DL-5000; 1~3. SSU rDNA PCR扩增;
4~6. LSU rDNA PCR扩增
M shows the DNA molecular weight marker DL-5000; Lanes 1 to 3
are the SSU rDNA PCR products of three individuals, respectively;
Lanes 4 to 6 are the LSU rDNA PCR products of three individuals,
respectively.

2.2 混合个体及单个体 cDNA的 PCR扩增
分别以条斑紫菜混合叶状体和单个体 cDNA 为
模板, 进行 SSU和 LSU rRNA的 PCR扩增反应, 如
图 3, 4所示。图 3显示混合个体 cDNA SSU rRNA也

图 3 以条斑紫菜混合叶状体 cDNA 为模板 PCR 扩增
SSU和 LSU rRNA的电泳图
Fig.3 The electrophoresis image of SSU and LSU rRNA
fragments amplified by PCR. cDNA of mixed Por-
phyra yezoensis was used as template
M. 表示 DNA分子质量标记 DL-5000; 1~3. SSU rRNA PCR扩增;
4~6. LSU rRNA PCR扩增
M shows the DNA molecular weight marker DL-5000; Lanes 1 to 3
are the SSU rRNA PCR products; Lanes 4 to 6 are the LSU rRNA
PCR products.
同样扩增出两条带, LSU rRNA 只扩增出了一条带,
片段大小与图 1中的相同。由图 4可以看出, 以 3个
个体 cDNA为模板扩增出来的 SSU和 LSU rRNA都
为单一条带。

图 4 以条斑紫菜单个个体 cDNA 为模板 PCR 扩增 SSU
和 LSU rRNA的电泳图
Fig.4 The electrophoresis image of SSU and LSU rRNA
fragments amplified by PCR. cDNA of Porphyra
yezoensis individual was used as template
M. 表示 DNA分子质量标记 DL-5000; 1~3. SSU rRNA PCR扩增;
4~6. LSU rRNA PCR扩增
M shows the DNA molecular weight marker DL-5000; Lanes 1 to 3
are the SSU rRNA PCR products of three individuals, respectively;
Lanes 4 to 6 are the LSU rRNA PCR products of three individuals,
respectively.

2.3 序列分析
序列比对发现, 扩增出来的 SSU rDNA 和 SSU
rRNA 相应长度的片段序列 (GenBank accession
number: KF501433 or KF501434) 是相同的 , LSU
rDNA 和 LSU rRNA 的扩增片段序列(GenBank ac-
cession number: KF501435) 也是相同的。用 BLAST
将 SSU rDNA 扩增出的两条带进行序列比对发现,
外显子序列相同, 内含子长度为 511bp, 其 5′ 和 3′
端的核苷酸序列分别为 AAC-和-ATGG, 插入位置外
显子的序列为 TCTGGTG-CCAGCAGCC, 如图 5 所
示。
将得到的 511bp 的内含子与 P. yezoensis
(GenBank accession number: AB013177) 上游 517bp
的内含子进行序列比对, 如图 6所示, 两者序列不是
完全相同的, 具有约 5%的差异。说明不同地理群的
条斑紫菜小亚基中内含子的核苷酸序列以及长度是
不同的。
将此 511bp的内含子序列与 NCBI中的 P.yezoensis
(GenBank accession number: AB013177)、P. suborbiculata
(GenBank accession number: AB013180)、P. dentata
(GenBank accession number: AB013183)、P. katadae
Marine Sciences / Vol. 39, No. 3 / 2015 15

图 5 SSU rDNA中内含子示意图
Fig.5 The schematic diagram of intron in SSU rDNA sequence

图 6 SSU rDNA上游内含子序列比对
Fig.6 Alignment of upstream intron sequences of SSU rDNA. The four conserved elements P, Q, R and S are marked by boxes

(GenBank accession number: AB013184)、P. tenera
(GenBank accession number: AB013175)、P. pseu-
dolinearis (GenBank accession number: AB013185)、
Porphyra sp. (GenBank accession number: AB013182)
SSU rDNA 上游内含子序列进行系统进化树构建 ,
能在一定程度上显现出不同种紫菜的亲缘关系 ,
如图 7。同时利用上述序列 SSU rDNA 外显子序列
构建系统树 , 如图 8。两个系统树显示出不同的系
统进化关系。
3 讨论
3.1 核糖体基因簇的同质性
以条斑紫菜混合叶状体基因组DNA为模板扩增
SSU rDNA 出现两条条带 , 但以单个个体基因组
DNA 为模板扩增却只出现一条带 , 条带出现了分
离。这种现象说明条斑紫菜核糖体基因簇中的每个
16 海洋科学 / 2015年 / 第 39卷 / 第 3期

图 7 根据 SSU rDNA上游内含子序列通过 ML法构建的
系统树
Fig.7 The maximum likelihood tree constructed based on
the upstream introns of SSU rDNA
节点数值为自展支持值, 小于 50%的值没有显示
The number in each node represents bootstrap support value. Only
bootstrap values greater than 50% are shown

图 8 根据 SSU rDNA外显子序列构建的系统进化树
Fig.8 The maximum likelihood tree constructed based on
the SSU rDNA exons
节点数值为自展支持值, 小于 50%的值没有显示
The number in each node represents bootstrap support value. Only
bootstrap values greater than 50% are shown.

个体转录单元的序列都是相同的。核糖体 DNA中很
多序列拷贝是协同进化的[11-12]。协同进化受到基因
转换和不均等交叉互换的影响 [13-15], 使核糖体基因
簇保持同质性。这种同质性对于生物体的生存是必
需的, 并对系统学的研究具有重要意义。基因簇中编
码区是高度保守的, 因为它的转录产物直接参与形
成核糖体。突变无疑对核糖体的形成以及发挥作用
相当不利。
3.2 条斑紫菜核糖体具有多样性
本研究发现同一种群的条斑紫菜核糖体具有多
样性, 有的个体 SSU rRNA中具有内含子, 有的个体
中却没有。由此推测, 在 RNA前体形成成熟的 RNA
过程中 , 内含子被切除 , 或者内含子序列仍被保留
在成熟的 RNA 中, 只是它不会影响小亚基的空间结
构, 对核糖体的形成以及行使功能上没有很大的作
用。在紫菜的栽培和繁育过程中, 该内含子可能会缺
失 , 因此种群中一些个体该序列丢失 , 而一些个体
却保留着这段序列, 而且能够遗传给后代, 因此, 核
糖体基因簇便具有了不同的类型。
以 cDNA为模板扩增 SSU rRNA, 仍然出现两种
不同的条带, 出现这种现象具有两种可能性: (1)核
糖体基因转录后加工成成熟的 RNA 的过程中, 内含
子不被切除, SSU rRNA中仍然具有这段序列; 本身
不具有此内含子的核糖体基因转录后也不具有这段
序列。(2)反转录过程中, 核糖体 RNA前体也被反转
录成了 cDNA, 因此该序列会被 PCR 扩增出来。这
两种可能将会在后续的研究中去探究。
在NCBI数据库中, 公布的条斑紫菜核糖体大亚
基的序列较少, 只能根据部分序列进行研究。由图 3
和图 4 可以看出, 大亚基的扩增条带为单一条带且
片段长度相同, 扩增部分为 LSU rDNA的 5′ 端序列,
由此可以得出条斑紫菜核糖体大亚基上游序列中不
含内含子。
3.3 SSU rRNA内含子分析
真核生物中的内含子一般为 I型内含子。I型内
含子有 9个碱基配对区(P1-P9)和由 P, Q, R, S四个保
守序列形成的保守核心区域[16]。I型内含子通过催化
一系列的转酯反应, 使自身从转录的 RNA 前体上剪
切掉[17]。
本文得到的条斑紫菜 SSU rRNA 内含子与
Kunimoto[18]测得的其他紫菜种的 SSU rRNA内含子
进行序列比对发现, 上游内含子的 5′和 3′端的核苷
酸序列都分别为 AAC-和 -ATGG, 插入位点为
TCTGGTG-CCAGCAGCC, 序列非常保守 , 这是它
们高度一致的特点。内含子序列分析发现, 此内含子
虽然有 I型内含子 P1中的外显子-内含子的碱基配对
区、U-G 对、3′剪切位点 G。但是 5′剪切位点并非 I
型内含子的 U 而是 G。此外, 除了保守区 Q 与 I 型
内含子的相同外, P、R 和 S 序列保守性较差。这些
特点与已经报道的内含子类型对应不起来 , 因此 ,
我们推测它可能是一种新型的内含子, 可能不具有
自我剪切的能力。
3.4 利用内含子进行系统进化研究的分析
在藻类分子生物学中, 研究者普遍认同 SSU 和
rbcL 基因可用于紫菜种间系统关系的研究[19, 20], 但
本文中的两个系统树的拓扑结构是有差异的, 图 8
中的 P. dentata是单独分出的, 图 7中 P. dentata优先
与 P. katadae聚类。出现这种现象的原因可能是 I型
内含子罕见的水平转移, 使得内含子和外显子的进
化速率不同步, 导致了利用 SSU 基因和内含子研究
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系统关系的结果不一致[21]。图 6 内含子序列比对显
示即使在同一物种不同个体间, 内含子的长度和核
苷酸序列亦有很大的差异, 日本学者 Eun-Jeong等[22]
的研究也充分反映了这个现象。因此, 内含子不太适
合种内的区分。但是内含子的长度、核苷酸序列在
不同种间又具有一定的特异性 [23], 因此可以根据这
一特点初步判定种、亲缘关系较远的亚种以及不同
地理群的紫菜。因此, 内含子的研究对于红藻的系统
分析具有重要的参考意义。
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Analysis of intron in SSU of Porphyra yezoensis
LI Xing-chen, XU Jia-jie, LIN Zhong-heng, SHEN Song-dong
(Cell Biology Department, School of Biology and Basic Medical Sciences, Medical College of Soochow
University, Suzhou City, Jiangsu Province, Suzhou 215123, China)
Received: May, 11, 2014
Key words: Porphyra yezoensis; ribosomal DNA; introns; homogeneity; phylogenetic development

Abstract: Fragments were amplified using primers designed on the basis of SSU and LSU rRNA gene sequences of
Porphyra yezoensis, respectively published in GenBank. Genomic DNA and cDNA of mixed or single Porphyra
yezoensis thallus were used as templates. After sequencing and analyzing these fragments, it is presumed that the
intron in SSU rRNA gene is not excised in the succedent processing after transcription, and intron was not discov-
ered in LSU rRNA gene. The intron which locates upstream in SSU rRNA gene is 511 bp. The location of intron is
the TCTGGTG-CCAGCAGCC exon sequence, and the 5′-end and 3′-end of the intron are AAC- and -ATGG, re-
spectively. The splicing site and conserved regions P, R and S of it are different from type I intron. Moreover, there
are differences in characteristics such as presence, location and structural feature of introns between individuals of
Porphyra yezoensis thallus. So it is not appropriate to use introns for classification between intra-species. However,
the length and nucleotide sequence of introns are specific in various species, which may provide references for dis-
crimination of red algae between inter-species and intra-species with distant relationship or different biogeography.

(本文编辑: 梁德海)