全 文 ：第 28卷第 7期
2009年 7月
水 产 科 学
F ISH ERIES　SCIENCE Vol.28 No.7Jul.2009
抗生素抑制农杆菌的效果及
对条斑紫菜生长发育的影响
王　萍1 , 成 锋2 , 滕亚娟1 , 李信书1 , 许星鸿1
(1.淮海工学院海洋学院 江苏省海洋生物技术重点建设实验室 ,江苏
连云港　222005;2.百奥生物技术(南通)有限公司 ,江苏　南通　226010)
摘　要:用头孢霉素和卡那霉素抑制农杆菌(LBA4404 和 EHA105)生长 ,同时测定在液体培养条件下
条斑紫菜组织块对 2 种抗生素的敏感性 , 以期找到适合用于农杆菌介导条斑紫菜遗传转化的脱菌剂及
农杆菌转化用于条斑紫菜的可行性。试验结果表明 , 2 种抗生素对2 株农杆菌菌株有较强的抑制作用 ,
对条斑紫菜叶状体组织块的生长作用效果不同 ,头孢霉素≥300 mg/ L 抑制叶状体组织块长度的增加 ,
而卡那霉素≥400 mg/ L 对组织块的增长有一定的促进作用。头孢霉素对条斑紫菜的发育抑制作用较
卡那霉素更大。在培养液中添加头孢霉素≥300 mg/ L 或卡那霉素质量浓度≥600 mg/ L 组织块不能
发育形成丝状体。头孢霉素和卡那霉素可作为农杆菌介导条斑紫菜遗传转化的抑菌剂 , 使用较适宜的
质量浓度分别为 200 mg/ L 和 400 mg/ L。
关键词:条斑紫菜;农杆菌;抗生素;生长与发育
中图分类号:S968.431 文献标识码:A 文章编号:1003-1111(2009)07-0405-04
收稿日期:2008-07-04;　修回日期:2008-09-12.
基金项目:江苏省海洋生物技术重点建设实验室开放课题(2005H S011);淮海工学院引进人才科研启动基金资助项目
(KK01073).
作者简介:王萍(1957-),女 ,教授 ,博士 ,研究方向:植物基因工程;E-mail:y pw ang@yah oo.com .cn.
　　紫菜(Prophy ra)是一种重要的经济海藻 ,它富
含大量的矿物质元素和维生素 ,具有较高的营养价
值和医药价值 ,是我国重要的出口创汇产品 。北起
辽宁省 ,南至海南省均有紫菜的分布 ,南方为坛紫
菜(P .hai tanensis),北方为条斑紫菜(P .yezoen-
sis)[ 1] 。20世纪 90年代起 ,先后在南通﹑浙江﹑福
建﹑连云港等沿海地区爆发了大规模的紫菜病
害[ 2] ,特别是腐烂病害和白化病害比较严重 ,造成
了严重的经济损失。针对紫菜养殖业中出现的品
种退化﹑品质下降以及病害等情形 ,许多科研工作
者对紫菜进行了一系列有目的的遗传改良 ,如进行
了紫菜突变体的选育工作[ 3-6] 。随着基因工程与分
子生物学技术的日趋成熟完善 ,大型海藻遗传转化
的报道相继出现 。秦松等[ 7-8] 对海带(Laminaria
japonica)的遗传转化进行了研究 , 用基因枪将
GUS基因导入海带和裙带菜(Undaria pinnati f i-
da)细胞中得到瞬时表达;又利用基因枪将 β-半乳
糖苷酶基因导入裙带菜雄配子体中 ,使其得到稳定
的表达。匡梅等[ 9] 用基因枪将外源 GUS 基因导入
4种红藻的组织切块中得到了瞬时表达 。紫菜的遗
传转化研究仅见电穿孔法转化报告基因的报
道[ 10-13] 。
本研究旨在探讨两种抗生素及浓度对农杆菌
(Agrobacterium)菌种的抑制效果及条斑紫菜叶状
体组织块对不同抗生素的敏感性 ,以期找到既可抑
制农杆菌的生长 ,又不影响紫菜组织块正常生长发
育的适宜抗生素种类及浓度 ,为进一步用农杆菌介
导法对紫菜进行遗传转化的抗性筛选奠定基础 。
1　材料与方法
1 .1　农杆菌菌株与抑菌试验
农杆菌 EHA105 、LBA4404两个菌株(本室保
存)用 YEP 液体培养基在全温振荡培养箱中 170
r/min ,28 ℃恒温中活化后 ,涂布于分别加入不同抗
生素种类及质量浓度的固体培养基中(28 ℃)培养。
头孢霉素和卡那霉素各设 6 个质量浓度:0 、50 、
100 、200 、300 、400 、500 mg/L ,观察加入不同抗生素
及不同质量浓度后平板上农杆菌菌落形成情况 。
DOI :10.16378/j.cnki .1003-1111.2009.07.012
1.2　条斑紫菜的准备
条斑紫菜叶状体 2006年 4月取自连云港港湾
内养殖区 ,在实验室用海水洗去附着在其表面上的
杂物 ,将基部的假根和边缘的生殖细胞去除 ,只保
留营养细胞部分 ,在消毒海水中用毛笔反复刷洗数
遍 ,再用无菌海水清洗干净 ,剪成 1 mm ×1 mm 的
组织块备用。
1.3　条斑紫菜对抗生素的敏感性试验
头孢霉素设 6 个质量浓度:0 、50 、100 、300 、
500 、700 mg/L ,卡那霉素设 6个质量浓度:0 、100 、
200 、400 、600 、800 mg/L。每个处理浓度 3次重复 ,
培养在 20 ℃光照培养箱中(12L ∶12D), 每日观
察 、记录紫菜组织块的生长发育情况 ,每 7 d各处理
组补换一次培养液(含有相应种类与质量浓度的抗
生素),所得数据用 SPSS 15.0进行方差分析与差
异显著性测验。
2　结果与分析
2.1　抗生素对农杆菌的抑制效果
头孢霉素和卡那霉素抑制农杆菌的效果均十
分明显。当加入头孢霉素质量浓度为 100 mg/L
时 ,明显地抑制农杆菌菌株 LBA4404的生长 ,质量
浓度为 200 mg/L 时可抑制菌株 EHA105的生长。
卡那霉素对农杆菌 2个菌株的有效抑制质量浓度
为 400 ～ 500 mg/ L。
2.2　抗生素对条斑紫菜叶状体组织块生长的影响
2种抗生素对条斑紫菜叶状体组织块生长的影
响见图 1 、图 2。
图 1　头孢霉素对条斑紫菜组织块生长的影响
由图 1可见 ,条斑紫菜的组织块在加入头孢霉
素的培养液中培养 7 d时各浓度间的组织块大小相
似 ,培养 21 d时较高质量浓度(≥300 mg/ L)组织
块的长度明显低于对照和低质量浓度(≤100 mg/
图 2　卡那霉素对条斑紫菜组织块生长的影响
L）处理 ,经 F 测验 F =30.92(F0.01 =5 .06),表明在
培养液中添加头孢霉素对条斑紫菜的组织块长度
存在极显著的影响。多重比较结果表明 ,当培养液
中头孢霉素质量浓度≥300 mg/ L 时 ,紫菜组织块
生长受到明显的抑制 。
卡那霉素对条斑紫菜叶状体组织块生长也有
影响(图 2)。第 21 d条斑紫菜叶状体组织块的长
度方差分析结果表明 , F =12 .28(F 0.01 =5.06),即
条斑紫菜组织块的长度在不同卡那霉素浓度间存
在极显著差异。多重比较结果表明 ,卡那霉素低质
量浓度(≤200 mg/L)处理的条斑紫菜组织块生长
与对照组差异不显著 ,而高质量浓度(≥400 mg/L)
对紫菜组织块生长有一定的促进作用。
2 .3　抗生素对条斑紫菜叶状体组织块发育的影响
用显微镜跟踪观察条斑紫菜叶状体组织块在
加入各质量浓度抗生素后的变化 ,发现在培养初期
加入头孢霉素的培养液中组织块生长正常 ,当培养
一定时间后一些组织块细胞外观呈现圆形﹑长椭
圆形或不规则形 ,膨大光滑 ,色素体向中央集中 ,有
些组织块开始释放孢子。培养至12 d时 ,添加头孢
霉素质量浓度低于 100 mg/ L的组织块开始形成小
叶状体 ,随后几天内 ,其他质量浓度处理的组织块
相继也形成了小叶状体 。培养至 21 d 时所有的质
量浓度组均出现了小叶状体。培养 16 d时对照组
的组织块发育形成丝状体 ,随后 ,头孢霉素质量浓
度 50 ～ 100 mg/L 处理的组织块陆续出现丝状体 ,
但培养液中头孢霉素质量浓度超过 300 mg/L 时未
观察到形成丝状体 ,只出现了小叶状体。
在培养基中加入卡那霉素后培养初期组织块
生长正常 ,培养 9 d 时观察到对照组和 100 mg/L
质量浓度处理组组织块上出现了小叶状体 ,培养 21
d时各质量浓度处理的组织块均形成了小叶状体。
406 水　产　科　学 第 28卷
在培养过程中发现 ,对照组和卡那霉素质量浓度≤
400 mg/L 处理的组织块发育形成了丝状体 ,而卡
那霉素质量浓度≥600 mg/L 对条斑紫菜组织块形
成丝状体具有较强的抑制作用 ,不能形成丝状体。
试验中还观察到 ,条斑紫菜组织块在液体中培
养形成小叶状体有两种方式:一种方式是叶状体组
织块的营养细胞转化成单孢子囊后放散单孢子 ,单
孢子以两极萌发的方式形成小叶状体(图 3);另一
种方式是营养细胞发育成细胞团 ,细胞团发散出孢
子 ,然后孢子通过两极萌发的方式形成小叶状体
(图 4)。
3　讨论
头孢霉素是目前农杆菌介导的遗传转化中广
泛使用的抑菌抗生素 ,是一种繁殖期强效杀菌剂 ,
其作用机理为可与蛋白结合抑制转肽酶交联反应 ,
从而阻碍细胞壁粘肽的合成 ,使细菌的细胞壁缺
损 ,菌体高渗膨胀裂解 ,进而诱导粘肽水解酶激活
而溶菌[ 14] 。张松等[ 15]在研究抗生素对大白菜组织
培养形态发生的影响时发现头孢霉素有推迟芽和
根形态发生的作用 ,低浓度卡那霉素能严重抑制根
和芽的形态发生。在本试验中观察到头孢霉素和
卡那霉素对条斑紫菜叶状体组织块生长有不同的
影响 ,头孢霉素(≥300 mg/L)抑制叶状体组织块长
度的增长 ,而卡那霉素(≥400 mg/ L)对组织块的增
长有一定的促进作用 。两种抗生素对紫菜叶状体
组织块形成丝状体均有影响 ,头孢霉素的作用较卡
那霉素明显 ,在培养液中添加头孢霉素质量浓度超
过 300 mg/ L 时组织块不能发育转化成丝状体 ,而
添加卡那霉素质量浓度≥600 mg/L 时组织块才不
能形成丝状体。这暗示着条斑紫菜叶状体组织块
在形成丝状体方面对头孢霉素可能更敏感 。
在高等植物中农杆菌介导遗传转化时头孢霉
素是常用的脱菌剂 ,卡那霉素是常用的抗性筛选标
记 。由本试验可知 ,头孢霉素抑制农杆菌的有效质
量浓度为 100 ～ 200 mg/ L ,在培养条斑紫菜叶状体
组织块的培养液中加入≥300 mg/L 头孢霉素时降
低组织块的生长速度 ,同时也抑制组织块发育形成
丝状体 ,因此 ,在条斑紫菜进行农杆菌介导的遗传
转化时可用头孢霉素作为农杆菌的脱菌剂 ,较适宜
的质量浓度为 200 mg/ L。卡那霉素抑制农杆菌的
有效质量浓度为 400 ～ 500 mg/ L ,而条斑紫菜叶状
体组织块对卡那霉素不太敏感 ,在质量浓度≤400
mg/ L 下不会抑制组织块的生长与发育 。因此 ,卡
那霉素不仅可作为抗性筛选标记 ,也可作为农杆菌
介导条斑紫菜转化的脱菌剂 ,适宜的质量浓度为
400 mg/L。
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The Effect of Antibiotics Inhibiting Agrobacterium and the Influence on
the Growth and Development in Laver Porphyra yezoensis
WANG Ping1 ,CHENG Feng2 ,T ENG Ya-juan1 ,LI Xin-shu1 , XU Xing-hong 1
(1.School of Marine Science &Techno lo gy ,H uaihai Institute of Techno lo gy , Jiang su Key Labo rato ry of
Marine Bio techno lo gy , Lianyungang 222005 , China;2.Biomics Bio technologies(Nantong)Co.Ltd.,
Nantong 226010 , China)
Abstract:Cefo taxime and kanamycin sulfate w ere used to inhibi t the g row th o f Agrobacterium(LBA4404
and EHA105)and the sensitivi ty of thallus o f laver Porphyra yezoensis cultured in the liquid media to tw o
kinds of antibio tics w ere measured in orde r to investig ate the bacteria-elimination agent w hich mediated
genet ic t ransfo rmation in the laver via Agrobacterium-medium and to veri fy the feasibility.T he resul ts
show ed tha t the tw o kinds of antibio tics had a strong inhibit ion on the grow th of Agrobacterium and a dif-
ferent inf luence on the g row th of thalli.Cefotaximes above 300 mg/L inhibited the leng th of thallus and
kanamycin sulfate above 400 mg/L promo ted the g row th of thallus.The effect of cefo taximes on inhibi-
ting the development of the thallus in the laver w as bigg er than that o f kanamycin.Conchocelis did no t de-
velop and form in media wi th cefo tax imes above 300 mg/L or kanamycin sul fate above 600 mg/ L.Cefo-
taximes and kanamycin sulfate w ere used for genet ic t ransfo rmation of the laver as an inhibitor via
Agrobacterium-medium.The appropriate concentration of cefo tax imes and kanamycin sulfate w as 200 mg/
L and 400 mg/L , respectively.
Key words:Porphy ra yezoensis ;Agrobacterium;antibiot ics;g row th and development
(责任编辑:小　舟)
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