全 文 ：生 物 技 术 2012 年 22(3)
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青杄 PSAK的克隆及生物信息学分析
李长江，曹一博，张凌云*
(北京林业大学 森林培育与保护教育部重点实验室，北京 100083)
摘要:目的:获取青杄的 PSAK全长 cDNA序列，对其进行生物信息学分析，并鉴定其在青杄各组织中相对表达量。方法:以
多年生青杄(Picea wilsonii)的 cDNA 文库为模板，通过 RACE PCR 的方法获取 PSAK 的末端序列，经过与 EST 序列拼接得到
PSAK基因的 cDNA 全长序列。通过特异引物将其克隆在 pEASY － T1 载体上，基于其氨基酸序列，利用 DNAMAN、ExPASy、
SWISS － MODEL等工具对其进行生物信息学分析，进行了半定量 RT － PCR与 RT － qPCR 实验来检测其在 mRNA 水平的组织表
达情况。结果:青杄 PSAK基因编码 140 个氨基酸，蛋白分子量为 14. 23kDa，理论等电点为 10. 29。蛋白的 C 端有较为保守的结
构域，与拟南芥、烟草等物种具有较高的相似性。PwPSAK主要在青杄的针叶与茎中进行表达。结论:成功获取了 PwPSAK 的单
克隆并进行了生物信息学分析，为青杄中 PSAK后续的功能研究提供理论依据。
关键词:青杄;光系统Ⅰ;PSAK;RACE;克隆;生物信息学;RT － PCR
中图分类号:Q785 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2012． 03． 54
Cloning and Bioinformatic Analysis of PSAK from Picea wilsonii
LI Chang － Jiang1，CAO Yi － bo1，ZHANG Ling － yun1*
(1 Key Laboratory of Forest Silviculture and Conservation of the Ministry of Education，Beijing Forestry University，Beijing 1000 83，China)
Abstract:Objective:This research is to attain the full length cDNA of PSAK gene，obtain the bioinformatic information of PwPSAK and i-
dentify the relative expression level in different organs of Picea wilsonii. Method:The full length cDNA of PSAK was obtained by rapid
amplification of cDNA ends (RACE)PCR assays based on the conserved EST of PSAK and cDNA library of Picea wilsonii. Then we used
the specific primers to clone the ORF into pEASY － T1 vectors. Several tools such as DNAMAN，ExPASy and SWISS － MODEL were used
for bioinformatic analysis of PwPSAK. The tissue expression level of PSAK in Picea wilsonii was exmamined by RT － PCR and RT － qPCR
technique. Result:The results showed that PwPSAK，which encoded 140aa and the theoretical pI /MW were 10. 29 /14. 23kDa，was highly
conserved with other plants in its C terminal. PwPSAK was mainly expressed in needles and stems. Conclusion:The clone of PwPSAK was
successfully obtained and this can provide the foundation for further functional research.
Key words:Picea wilsonii;PS Ⅰ;PSAK;RACE;clone;bioinformatic;RT － PCR
收稿日期:2012 － 02 － 21;修回日期:2012 － 04 － 05
作者简介:李长江(1988 －) ，男，在读硕士研究生，研究方向:植物分子
生物学，Email:lichangjiang1030@ 126. com。* 通讯作者:张凌云(1973
－) ，女，副教授，研究方向:植物发育与生殖生物学，发表论文 30 余
篇。
0 引言
PSAK(photosystem Ⅰ reaction center subunit K)是绿色植
物光系统Ⅰ(photosystem Ⅰ)反应中心蛋白 K 亚基，是组成光
系统Ⅰ(PS Ⅰ)复合体的重要组成部分［1］。1991 年在聚球
藻［2］和黄瓜［3］中就鉴定了包括 PSAK 在内的组成 PS Ⅰ复合
体的各个基因。Ozawa S和 Onishi T等在海藻中证明 PSAK与
PSAG参与增强捕光复合体Ⅰ(LHC Ⅰ)与 PS I 反应中心联
系，从而增强光系统Ⅰ的稳定性［4］。拟南芥的研究表明，psak
功能缺失的突变体光能利用率明显降低，植物体将合成更多
的叶绿素 a /b和反应中心色素 P700 的以满足植物体对光能
的需要［5］。典型的 PSAK 分子量一般在 13kDa 左右，有两个
跨膜的 α －螺旋结构域，拓扑学的实验表明，跨膜行为是不依
赖 SRP(Signal Recognition Particle)而趋于自发的［6］。在大麦
的研究中表明，PSAK与 PSAG 在进化上可能由同一个基因编
码而来［7］。越来越多的研究证明了 PSAK 在稳定 PS Ⅰ反应
中心、参与能级跃迁和电子传递、联系 LHCⅠ与反应中心等起
到重要的作用［8 － 11］。
青杄又名青皮云杉，是中国特有的一种针叶植物，对比较
恶劣的环境(干旱、高温、潮湿等)有较强的适应能力，也是我
国比较广泛的经济作物［12］。由于木本植物的生活史较长，且
受到组培条件、突变体较难获得等条件的限制，针叶植物的分
子生物学水平的研究相对较少。本文以多年生青杄和三年生
4
2012 年 22(3) 生 物 技 术
青杄幼苗为材料，以其 cDNA文库为模板，根据其 EST 的保守
序列设计引物，通过 5 － RACE 与 3 － RACE 实验获取青杄
PSAK的末端序列，再经过序列拼接获取其全长 cDNA 序列。
并利用生物信息学的方法对其编码的氨基酸序列进行分析，
预测其理化性质、二级结构、三级结构等。同时进行半定量
PCR与荧光定量 PCR，鉴定其在青杄的各个组织中的表达情
况。本文将对 PwPSAK 的进一步研究，特别是针叶植物光和
作用机制研究奠定基础，同时也为生产实践中筛选优质林木
资源、抗性育种等提供了理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验材料
多年生青杄的花粉、针叶及种子采集于中国科学院植物
研究所。通过 RT － qPCR 与半定量 RT － PCR 进行组织表达
实验中的青杄根、茎、叶取材于三年生幼苗。青杄 cDNA 文库
由 gateway技术构建，由 Invitrogen 公司完成。
1. 1. 2 实验试剂
Taq DNA 聚合酶、DL2000 购买于 TANGENG 公司，
pDONR222 载体购买于美国 Invitrogen 公司，反转录试剂盒购
买于 Fermentas公司，荧光定量 PCR 试剂盒购买于 KAPA 公
司，pEASY － T1 购买于全式金公司，其它试剂均购于 Promega
公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 RACE PCR获取 PwPSAK的末端序列
以多年生青杄 cDNA文库为模板，利用 PSAK的 EST序列
中特异引物与 pDONR222 两端的载体引物进行 5 － RACE 与
3 － RACE实验。
5 － RACE实验利用引物上游引物 5P － L 与下游引物 5P
－ R，3 － RACE 实验利用上游引物 3P － L 与下游引物 3P － R
进行扩增。通过 EST 片端与 5端、3端序列的拼接，得到了
PSAK的全长 cDNA序列。实验所需的引物见表 1。
1. 2. 2 生物信息学分析
利用 DNAMAN软件进行 PwPSAK的 cDNA序列编码框预
测及蛋白翻译。通过 NCBI (http:/ /www. ncbi. nlm. nih. gov /)
与 TRIR (http:/ /www. arabidopsis. org /)网站中的 BLASTn 与
BLASTp工具进行核酸序列与蛋白序列的同源性分析，用
CLUSTALX软件进行多序列比对，用 MEGA5 进行系统树的构
建;利用 ExPASy(http:/ /www. expasy. org / tools /)中的 Compute
pI /Mw 工具 (http:/ /web. expasy. org /compute_pi /)预测其等电
点和分子量，利用 ProtScale 工具 (http:/ /web. expasy. org /
protscale /)计算蛋白的疏水性图谱;用 TMHMM 工具 (http:/ /
www. cbs. dtu. dk /services /TMHMM － 2. 0 /)预测蛋白是否跨
膜;利用 SWISS － MODEL工具来预测蛋白的三维结构。
1. 2. 3 组织表达实验
利用 Aidlab公司的植物 RNA 提取试剂盒提取三年生青
杄的根、茎、叶与多年生青杄的种子和花粉的 RNA，通过 Fer-
mentas公司的 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit合成
双链 cDNA，根据 PwPSAK的 CDS设计特异引物 RT － L，RT －
R(表 1) ，以 EF － 1α 作为内参基因［13］，进行 RT － PCR 实验。
利用 KAPA公司的 SYBR FAST qPCR Kit(ABI prismTM)在 ABI
StepOnePlus实时荧光定量 PCR 仪进行 RT － qPCR 实验，分析
其在各自组织的表达情况。
表 1 cDNA克隆所用引物序列
Table 1 The primers used in the cDNA cloning
引物 序列
5P － L CAGTCTTAAGCTCGGGCCCCA
5P － R AGGGTGCCACTGAATGGGCTGA
3P － L TCAGCCCATTCAGTGGCACCCT
3P － R CTGCCAGGAAACAGCTATGAC
RT － L ATGGCAGCAAAGGCAATGATCT
RT － R ACTGATACATGGATGGGCAGCA
EF － 1α － L AACTGGAGAAGGAACCCAAG
EF － 1α － R AACGACCCAATGGAGGATAC
PSAK － L ATGGCAGCAAAGGCAATGATCT
PSAK － R TTATATGGCACCAATGGCCTTG
2 结果
2. 1 通过 RACE实验获取 cDNA全长
通过 3 － RACE与 5 － RACE实验获取的片段进行测序，
将测序结果与 EST片段进行拼接获取 cDNA全长 (图 1)。通
过 DNAMAN 对全长 cDNA 序列的分析可知，全长 cDNA 共
691bp，于 78bp出现起始密码子 ATG，在 498bp 处发现终止密
码子 TAA，664bp处发现 PolyA 尾巴。设计引物 PSAK － L 与
PSAK － R，PCR扩增目的基因的编码区，将片段连接 pEASY －
T1 载体上，通过酶切和测序进行鉴定。全长 cDNA 已登录
GeneBank，登录号为 JQ677991。
2. 2 生物信息学分析
2. 2. 1 氨基酸组成与理化性质分析
编码区有 420bp核酸组成，编码 140 个氨基酸(图 1) ，由
Compute pI /Mw 工具预测分子量为 14. 23kDa，理论 PI 值为
10. 29。TMHMM工具预测其有两个跨膜区域，ProtScale 工具
分析蛋白的疏水性，在 129 位氨基酸(Gly)疏水性最强为
2. 689，101 位丝氨酸［14］］疏水性最弱为 － 1. 844，根据蛋白疏水
性图谱结合跨膜预测分析结果，可推测其含量大量疏水结构
的跨膜结构域。
利用 FoldIndex工具［15］来进行蛋白质固有无序化分析，结
果表明蛋白没有无序化特征，预测此蛋白具有很强的刚性结
构(图 3) ，在行使其功能时蛋白的构象不会发生改变。
2. 2. 2 多序列比对与进化树分析
通过在 NCBI与 TARI上的 Blastp工具对 PwPASK进行同
源检索，找到拟南芥、烟草、北美云杉等 8 种植物(表 2)的同源
蛋白序列。根据其编码的蛋白序列进行多序列比对，结果如
图 4 A，预测其 C端为主要的 PSAK 结构域，与其它各个物种
同源性较高。α1 与 α2 是两个螺旋结构;系统树分析结果表
明青杄中 PSAK 与北美云杉中的 ABK21864(GeneBank 登录
号)同源关系最近。
2. 2. 3 二级结构与三级结构预测与分析
利用 CFSSP(http:/ /www. biogem. org / tool /chou － fasman /)
工具对 PwPSAK的氨基酸序列进行二级结构分析，结果如图
5，利用 SWISS － MODEL 工具对 PwPSAK 的蛋白序列进行分
5
生 物 技 术 2012 年 22(3)
析，可以得到保守的 PSAK 结构域(有典型的 α1 与 α2 螺旋结
构) ，值得注意的是由于 N 端的大部分序列(1 ～ 60aa)在
SWISS － MODEL数据库没有同源性大于 30%的序列，故 N 端
的三级结构有待进一步研究。
图 1 PwPSAK的全长 cDNA序列及其蛋白氨基酸序列
Fig. 1 Nucleotide sequences and deduced sequence of amino acid residues of PwPSAK
图 2 蛋白疏水性分图谱
Fig 2 Hydrophobic analysis of PwPSAK
表 2 PwPSAK的同源基因
Table 2 Homological genes of PwPSAK
植物名称 登录号 基因名称 E value值
拟南芥(Arabidopsis thaliana) AT1G30380 AtPSAK 6e － 32
澳洲浮萍(Wolffia australiana) ADU85605 WaPSAK 8e － 53
圆球绿藻(Prochlorococcus marinus)NP_893024 PmPSAK 0. 003
葡萄(Vitis vinifera) XP_002280687 VvPSAK 1e － 52
蓖麻(Ricinus communis) XP_002526607 RcPSAK 8e － 51
烟草(Nicotiana tabacum) AAP03873 NtPASK － X 5e － 52
豌豆(Pisum sativum) 3LW5_K Chain K 3e － 41
北美云杉(Picea sitchensis) ABK21864 Unnamed 9e － 96
图 3 蛋白固有无序化特征分析
Fig 3 Intrinsically disordered protein analysis of PwPSAK
2. 3 mRNA水平的组织表达
2. 3. 1 各组织 RNA的提取
以成年青杄种子、花粉及三年生苗为材料，用 Aidlab 公司
的植物 RNA提取试剂盒进行 mRNA的提取，电泳检测结果如
图 6，反转录成 cDNA后，进行 mRNA水平的组织表达实验。
2. 3. 2 半定量 RT － PCR与 RT － qPCR结果
以反转录的青杄各个组织(根、茎、针叶、花粉、种子)mR-
NA的 cDNA为模板，RT － L 与 RT － R 为引物，EF － 1α － L 与
6
2012 年 22(3) 生 物 技 术
EF － 1α － R 为内参基因引物进行半定量 RT － PCR 与 RT －
qPCR，两实验结果均比较一致，结果如图 7，表明 PwPSAK在各
个组织均有表达，但在针叶中表达量最大，茎中的表达量其
次。
图 4 A图为不同植物的 PSAK蛋白多序列比对结果，虚线代表未鉴定的结构域;B图为进化树分析结果;C 图为 PSAK 蛋白的保守三级结构(由
Antheprot 3D viewer输出)
Fig. 4 A shows the multiple protein sequencs alignment result and the dotted line represents the unidentified domain. B shows the evolutionary tree of PwP-
SAK. C presents the conserved PSAK domain of the PwPSAK. (The result was exported from Antheprot 3D viewer)
图 5 PwPSAK的二级结构分析
Fig. 5 Secondary structure analysis of PwPSAK
3 讨论
以青杄 cDNA文库为模板的 RACE 实验是基于 EST 保守
序列和 pDONR222 载体上特异的引物进行的，cDNA全长是由
PSAK的末端序列和 EST序列进行拼接而来，进而完成基因的
克隆，相比之下，要比传统的通过同源植物保守序列设计兼并
引物的方法更加便捷。由其编码的氨基酸可以看出，甘氨酸
(Gly)和丙氨酸(Ala)含量最多，为分别为 12. 9%，其次为
10. 9%的亮氨酸(Leu)和 10. 0%的丝氨酸(Ser) ，其分子式可
推导为 C623H1029N179O184 S8。二级结构预测表明此氨基酸含有
55. 0%的 α －螺旋结构，30. 0%的 β －折叠结构，其余则为无
规则卷曲结构，由于 PSAK在其它植物上的研究已证明是具有
两个跨膜的的 α －螺旋结构域，三级结构中预测的 α －螺旋结
7
生 物 技 术 2012 年 22(3)
图 6 青杄中各组织中的 RNA电泳图
Fig. 6 Agarose electrophoresis result of RNA from different tissues of Picea
wilsonii
图 7 PwPSAK在青杄各个组织的表达结果
Fig. 7 Expression level of PwPSAK in different tissues of Picea wilsonii
构则是跨膜的疏水区域。
多序列比对表明在不同的植物中 C 端(60 ～ 140aa)的
PSAK结构域较为保守，且由两个典型的 α －螺旋结构域，系
统发育树可以看出北美云杉的一个基因与青杄的 PSAK 高度
同源，无论从形态学还是在分子进化上都表明两物种有相同
的祖先。青杄 PSAK蛋白的 N端序列(1 ～ 60aa)与拟南芥、藻
类物种相比同源性较低，说明在分子结构与功能上和藻类、阔
叶植物存在一定的差异，进而推测针叶植物的 PS I 组成和机
制和其它植物存在一定差异性。
青杄属于木本裸子植物，对其 RNA 的提取尤为关键，对
于多年生的青杄来说，针叶、花粉和种子的 RNA 提取比较容
易完成，但根与茎木质化严重且茎外侧含有大量木栓组织，不
容易提取较高质量的 RNA，因此选择三年生的幼苗来提取根、
茎、叶的 RNA。组织表达所用的定量与半定量 RT － PCR所得
的结果一致，PSAK在青杄中主要在针叶和茎中表达。
最新的研究表明在海洋病毒(marine virus)基因组中具有
PSAK同源的基因［14］，各种植物的 PSⅠ与 PSⅡ的复合体模型
和结晶结构也不断被公布［1，16，17］，在烟草和拟南芥中研究发现
Y3IP1 与 Ycf3 蛋白参与到 PS Ⅰ各个亚基的组装过程［18］。这
对植物光合作用研究是巨大的进展，对于针叶植物的相关研
究，我们拭目以待。
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毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白基因克隆及序列分析
沙伟，于冰* ，刘卓
(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)
摘要:目的:该文首次从毛尖紫萼藓中克隆到泛素延伸蛋白基因的全长，为深入研究其功能打下基础。方法:提取植物的总
RNA，经反转录得到 cDNA，根据实验室得到的毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白基因的 EST序列设计引物，基于 3’RACE (Rapid Ampli-
fication of cDNA End )技术克隆得到全长序列，使用分子生物学软件进行序列分析。结果:获得了 cDNA 全序列，GenBank 登录
号为 JQ659260，序列全长为 673bp，开放阅读框为 471 bp，编码 156 个氨基酸残基。结论:通过 Blast P对其编码的氨基酸序列进
行比对结果显示:毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白与小立碗藓、北美云杉、葡萄、蓖麻、毛果杨、紫茎泽兰的泛素延伸蛋白的同源性均在
96%以上。
关键词:毛尖紫萼藓;泛素延伸蛋白基因;3’RACE 基因克隆;生物信息学
中图分类号:Q781;Q949 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2012． 03． 55
Cloning and Characterization of Ubiquitin Extension
Protein Gene in Grimmia pilifera
SHA Wei，YU Bing* ，LIU Zhuo
(College of Life Science and Agriculture Forestry，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China)
Abstract:Objective:Cloning the ubiquitin extension protein from Grimmia pilifera for the first time，that was the foundation for further
gene function study. Method:Total RNA was extracted from plant. Then reverse transeripted by M － MLV. According to the ubiquitin ex-
tension protein EST sequence of Grimmia pilifera to design primer. Using 3 ’RACE technology (Rapid Amplification of cDNA End)to am-
plification. Analysising sequence with the molecular biology software. Result:The full － length cDNA of ubiquitin extension protein gene is
673bp (GenBank Accession No. JQ659260) ，containing a 471bp open reading frame (ORF) ，encodes a residue of 156 amino
acids. Conclusion:The results by analysising the homology of encoded amino acid sequence show that，the deduced amino acid sequence
showed more than 96% similarity with the corresponding ubiquitin extension protein fragment of the Physcomitrella patens，Picea sitchensis，
Vitis vinifera，Ricinus communis，Populus trichocarpa，Ageratina adenophora. The sequence information of the fragment indicates that this is
the ubiquitin extension protein gene fragment.
Key words:Grimmia pilifera;ubiquitin extension protein gene;3’RACE;bioinformatics
收稿日期:2012 － 02 － 14;修回日期:2012 － 05 － 04
基金项目:国家自然科学基金项目(“紫萼藓科植物耐旱特征及分子进
化的研究”，No. 31070180)资助
作者简介:沙伟(1963 －) ，女，黑龙江省齐齐哈尔人，教授，博士生导
师，从事植物学、植物遗传学方面研究，发表论文 130 余篇、专著 4 部，
Email:shw1129@ 263. net。* 通讯作者:于冰(1985 －) ，女，黑龙江省
齐齐哈尔人，在读硕士，从事植物遗传学方面研究，Email:yubingyc@
163. com。
0 引言
泛素是由 76 个氨基酸组成的高度保守的低分子量蛋白
质，广泛的存在于真核生物中［1］。泛素蛋白在真核细胞中主
要以两种形式存在:一种是多聚泛素基因(polyubiquitin
genes) ，由多个泛素单体头尾相连组成;另一种称为泛素延伸
蛋白(Ubiquitinextension protein) ，是由泛素单体 C －末端同核
糖体多肽构成的拓展肽［2］。泛素延伸蛋白又分成两种，一种
是 ubiquitin /L40 泛素延伸蛋白由 c 末端和 52 或 53 个氨基酸
的核糖体 L40 (ribosomal L40)多肽相融合;第二种是 ubiquit-
in /S27a泛素延伸蛋白是由 C末端和 76 ～ 78 个氨基酸的核糖
体 S27a(ribosomal S27a)多肽相融合［3］。泛素在蛋白质水解途
径中起着重要的作用，它可用来标记生物体内需要降解的蛋
白，参与细胞周期调整、细胞生长与凋亡、细胞信号感受、离子
通道、免疫应答、转录催化等多种重要的生命过程［4］。
毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)是种典型的旱生藓类，它属
于紫萼藓科(Grimmiaceae)中的紫萼藓属(Grimmia) ，有着非常
强的抗旱性［5］。目前，在紫萼藓科植物中关于泛素的研究尚
未见报道。为了进一步研究苔藓泛素基因与其他生物泛素基
因的同源性，以及泛素与苔藓植物抗逆性的关系，本文以毛尖
紫萼藓为材料，利用 3 RACE方法克隆其 cDNA 全长，采用生
物信息学方法对基因序列及蛋白特性进行分析。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验材料
毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)采集于黑龙江省五大连池。
选取长势较好的材料，用水冲洗干净后，经过 7 ～ 8d 室温培
养，用镊子取顶端绿色部分，迅速置于 － 80℃冰箱保存备用。
1. 1. 2 试剂
实验所用大肠杆菌 DH5α 为作者实验室保存;pMD － 18T
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