全 文 ：OEE1 (oxygen-evolving enhancer protein 1,
MSP, 33 kD蛋白) 是由核基因锰簇稳定外周蛋白
PsbO基因编码的定位于叶绿体的 33 kD蛋白, 结
合在类囊体膜内的光系统Ⅱ的外缘, 是与放氧关
系最为密切的外周蛋白, 在维持光系统Ⅱ复合体
的稳定方面发挥重要作用[1]. 自从 Yamamoto等第
一次从光系统Ⅱ膜上纯化出 OEE1蛋白之后[2], 对
该蛋白以及编码该蛋白的 PsbO基因的研究一直
都未停止过.
光合系统是对外界逆境响应最为敏感的部
分, 极易引发产生活性氧, 造成光合系统破坏, 出
现光抑制情况. Mn簇是否稳定对光系统Ⅱ光抑
收稿日期： 2012-02-24 ；修回日期： 2012-03-29
基金项目： 国家转基因生物新品种培育科技重大专项资助项目（2009ZX08009-062B）
作者简介： 刘亚静 (1987-), 女, 河北衡水人,硕士研究生,主要从事植物抗逆基因的克隆和功能研究, E-mail：liuyajing1987@126.com；*通
讯作者：张凌云（1973-）,女,北京林业大学森林培育学科副教授, 主要从事植物发育与生殖生物学研究, E-mail：lyzhang73@sohu.com.
青杄 PsbO基因 cDNA序列克隆及生物信息学分析
刘亚静, 李长江, 孙 帆, 张凌云*
(北京林业大学 森林培育与保护教育部重点实验室, 中国北京 100083)
摘 要： 利用 RACE技术从已有的青杄均一化 cDNA文库中克隆得到青杄（Picea wilsonii）PsbO 基因 cDNA 的全
长, 并用生物信息学的方法对该 cDNA 的核苷酸序列、氨基酸序列的相似性, 及编码蛋白 PwPsbO 的理化性质、
亲水性/疏水性、 二级和三级结构 , PwPsbO 基因进化树等进行了预测和分析 . 采用实时荧光定量 PCR（RT-
qPCR）技术, 测定了青杄不同组织中的 PsbO 基因的相对表达水平. 结果发现： 青杄 PsbO 基因编码 346 个氨基
酸, 预测相对分子质量为 36.6 kD, 理论 pI 值为 5.29, 属于可溶性蛋白. 二级和三级结构预测表明其含有较多
的 α 螺旋、β 折叠和随机卷曲结构. RT-qPCR 发现该基因在青杄针叶和茎中表达量最高 . 这些结果为青杄中
PsbO 基因的初步功能研究奠定了基础.
关键词： 青杄； PsbO 基因； RACE； 生物信息学
中图分类号： Q781 文献标识码： A 文章编号: 1007-7847(2012)03-0201-06
cDNA Cloning and Bioinformatic Analysis of PsbO Gene
from Picea wilsonii
LIU Ya-jing, LI Chang-jiang, SUN Fan, ZHANG Ling-yun*
（Key laboratory of Forest Silviculture and Conservation of the Ministry of Education, Beijing Forestry University, Beijing
100083, China）
Abstract：Full-length cDNA sequence of PsbO gene was acquired from normalized cDNA library of Picea
wilsonii by RACE methods. Prediction on physical and chemical properties, hydrophobicity, phylogenetic
tree, secondary and tertiary structure of amino acid were analyzed by bioinformatics. The relative expression
level of PwPsbO in different tissues using quantitative real time PCR (RT-qPCR) was measured. The results
showed that PwPsbO gene encodes 346 amino acids. Its molecular weight is 36.6 kD and the theoretical pI
is 5.29. It is a hydrophilic protein. The secondary and tertiary structure of PwPsbO is mainly composed of
alpha helix, random coil and extended strand. The higher expression level of PwPsbO was observed in needles
and stems. The aim of this study is to lay a foundation for the function of PsbO in Picea wilsonii.
Key words：Picea wilsonii；PsbO；RACE；bioinformatics
（Life Science Research，2012，16（3）：201～206）
第 16 卷 第 3 期 生命科学研究 Vol．16 No．3
2012 年 6 月 Life Science Research Jun. 2012
生 命 科 学 研 究 2012 年
制产生活性氧的过程会产生重要影响. PsbO可
能直接影响 Cl-在光系统Ⅱ放氧反应中与活性位
点的结合或者作用的发挥[3]. 将 PsbO蛋白从膜上
去除会导致在低 Cl-浓度下 Mn簇 4个 Mn原子中
的 2 个从膜上脱落 [4]. 另有许多证据表明 PsbO
蛋白与 CP47之间存在结合, 保护 CP47免受限制
性蛋白酶的降解 , 去除 PsbO 蛋白以后 , CP43、
Cytb559的 α亚基易被胰蛋白酶剪切[4, 5]. 拟南芥
的 PsbO2涉及在高光条件下调节 D1蛋白的运转,
具有维持光系统Ⅱ的功能[6]. 因此, OEE1蛋白很
有可能参与光合放氧生物在光照胁迫时的保护机
制[5, 7].
杨传平等应用 SSH技术研究盐胁迫下柽柳
相关基因的表达情况, 获得了 36 个盐胁迫响应
基因, 其中就包括 PsbO蛋白基因[8]. Sugihara K 等
发现木榄在 500 mmol/L NaCl胁迫下 OEE1蛋白
表达的表达增强[9]. 这些研究表明 PsbO蛋白很可
能参与逆境条件下的胁迫响应过程. 最近, 有关
人员预测 PsbO 蛋白可能也发挥包括酶活性调
节、反应中心蛋白翻转的调控、类囊体膜结构的调
整等功能[10, 11], 这可能预示着 PsbO在其它更多方
面的新功能的发现.
本文以青杄为研究对象, 成功克隆得到青杄
中 PsbO基因的全长 cDNA, 利用生物信息学的方
法对该 cDNA核苷酸序列、氨基酸序列的相似性、
理化性质、亲水性/疏水性、二级和三级结构、进化
树等进行了预测和分析, 并用 RT-qPCR方法分析
了 PsbO基因在青杄不同组织中的相对表达水平,
旨在为进一步进行 PsbO基因的功能研究奠定科
学基础.
1 材料与方法
1.1 实验材料
多年生青杄（Picea wilsonii）的花粉和针叶,
由中科院植物所北京植物园提供. 供试花粉于室
温下自然风干, 贮藏于-20 ℃冰箱. 供试针叶用液
氮速冻, 贮藏于-80 ℃超低温冰箱. 用 Gateway技
术构建青杄 cDNA 文库 , 由英俊生物公司构建 .
两年生青杄的根、茎、叶用于进行 RT-qPCR实验.
Taq DNA 聚合酶、DL2000购买于中国 TAN-
GENG公司, pDONR222载体购买于美国 Invitro-
gen 公司, 反转录试剂盒购买于加拿大 Fermentas
公司, 荧光定量 PCR试剂盒购买于美国 KAPA公
司, pEASY-T1购买于中国全式金公司, 其它试剂
均购于美国 Promega公司.
1.2 实验方法
1.2.1 利用 RACE PCR获取 PwPsbO 基因的末端
序列
以多年生青杄 cDNA文库（本实验室已构建）
为模板 , 利用 PsbO 的 EST 序列中特异引物与
PDONR222两端的载体引物进行 5′-RACE与 3′-
RACE实验. 5′-RACE实验利用上游引物 5PR-L
与下游引物 5PR-R(见表 1), 3′-RACE实验利用上
游引物 3PR-L与下游引物 3PR-R(见表 1)进行扩
增. 通过 EST片端与 5′端、3′端序列的拼接, 得到
PsbO基因的全长 cDNA序列.
1.2.2 PwPsbO基因的生物信息学分析
利用 DNAMAN 软件进行 PwPsbO 的 cDNA
序列编码框预测及蛋白翻译. 通过 NCBI (http：//
www.ncbi.nlm.nih.gov/) 与 TRIR (http：//www.ara-
bidopsis.org/)网站中的 BLASTn与 BLASTp工具进
行核酸序列与蛋白序列的同源性分析 , 用
CLUSTALX 软件进行多序列比对, 用 MEGA5 进
行系统树的构建；利用 ExPASy (http：//www.ex-
pasy.org/tools/) 中的 Compute pI/Mw 工具 (http：//
web.expasy.org/compute_pi/) 预测其等电点和相对
分子质量 , 利用 ProtScale 工具 (http：//web.ex-
pasy.org/protscale/) 计算蛋白的疏水性图谱；利用
TMHMM 工具 (http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMH-
MM-2.0/) 预测蛋白是否跨膜；利用 SWISS-MODEL
工具来预测蛋白的二级和三级结构.
1.2.3 利用 RT-qPCR 进行 PwPsbO 基因的组织
表达分析
利用 Aidlab公司 RNA提取试剂盒提取两年
生青杄的根、茎、叶与多年生青杄的种子和花粉的
RNA. 利用 Fermentas 公司的 RevertAidTM First
Strand cDNA Synthesis Kit 合成双链 cDNA. 根据
PwPsbO的 CDS设计特异引物 QRT-L、QRT-R (见
表 1). 选用青杄 EF-1α基因为内参基因, 并设计
引物 EF-1α-L和 EF-1α-R(见表 1). 利用 KAPA公
司的 SYBR FAST qPCR Kit（ABI prismTM）在 ABI
StepOnePlus实时荧光定量 PCR仪进行 RT-qPCR
实验, 分析 PwPsbO在青杄 5种不同组织中的相
对表达情况.
2 结果
2.1 通过RACE实验获取 PwPsbO的 cDNA全长
对 5′RACE和 3′RACE实验获取的片段进行
202
第 3 期 刘亚静等：青杄 PsbO基因 cDNA序列克隆及生物信息学分析
图 1 PwPsbO 的核苷酸序列和氨基酸序列
氨基酸序列用单个字母表示, 下划线标记为转录起始密码
子 ATG 和转录终止密码子 TGA； 氨基酸碳末端用星号表
示, PolyA 信号用黑体表示.
Fig.1 Nucleotide sequences and deduced sequence of a-
mino acid residues of PwPsbO
The amino acid residues are indicated by a single letter
code. A potential translation initiation codon (ATG) and a
termination codon are underlined； the C terminal of se-
quence of amino acid residues is marked with asterisk； the
potential polyadenylation signal sites are marked in bold.
测序,并且将测序结果与 EST片段拼接获取 cDNA
全长 (图 1). 设计引物 PsbO-L与 PsbO-R, 用 PCR
扩增 PwPsbO 的编码区 , 将片段连接 pEASY-T1
载体上酶切和测序进行鉴定.
2.2 PwPsbO 的氨基酸组成与理化性质分析
应用 DNAMAN 对 PwPsbO 的全长 cDNA 序
列进行分析发现：PwPsbO的全长 cDNA共 1 260
bp, 在 54 bp 出现起始密码子 ATG, 在 1 092 bp
处发现终止密码子 TGA, 在 1 248 bp 处出现
PolyA 尾巴, 编码区由 1 041 bp 核酸组成 , 编码
346个氨基酸（核苷酸和氨基酸序列见图 1）. 应
用 Compute pI/Mw 工具预测相对分子质量为 36.6
kD, 理论 pI值为 5.29.
2.3 PwPbsO 推导的氨基酸序列的的疏水/亲水
性分析
氨基酸的疏水性和亲水性是氨基酸的固有特
性, 蛋白结构的稳定性在很大程度上依赖于氨基
酸的疏水特性. 我们利用 ProtScale工具 (http：//
web.expasy.org/protscale/)计算蛋白的疏水性图谱,
对 PwPbsO 蛋白的疏水性和亲水性进行了分析 .
发现第 159位的赖氨酸（Lys）、160位天冬酰胺酸
（Asn）、163 位的脯氨酸（Pro） 疏水性最差是-
2.467, 79 位的丙氨酸（Ala）疏水性最强是 2.256.
大部分的氨基酸属于亲水性氨基酸 , 因此预测
PwPbsO为可溶性蛋白（见图 2）.
2.4 PwPsbO基因与多种植物的序列比对及系统
进化树分析
我们将 PwPsbO 蛋白的氨基酸序列与拟南
芥、玉米、杨树、木榄、毛竹、葡萄等物种（表 2）的
序列进行了多序列比对, 发现 PwPsbO蛋白和其
他 PsbO蛋白类似, 含有较多的 α螺旋以及 β折
叠结构[12]（图 3）. 并用 MEGA5进行了系统树的构
建（图 4）. 结果发现, 青杄 PsbO基因和毛竹、玉米
的亲缘关系最近.
2.5 PwPsbO 的二、三级结构分析
我们利用 GOR4在线工具做了 PwPsbO蛋白
的二级结构预测, 发现该氨基酸序列含有 23.99%
的 α 螺旋结构（Alpha helix）, 21.97%的 β 折叠
（Extended strand）, 54.05%的随机卷曲（Random
coil）, 这个结果（见图 5）和以往的研究成果基本
类似, 但具体的结构尚需实验印证. 应用 SWISS-
MODEL工具来预测 PwPsbO 蛋白的三维结构也
得到了类似的结果（图 6）.
表 1 cDNA 克隆和 RT-qPCR 所用引物序列
Table 1 The primers used in the cDNA cloning and
RT-qPCR
Primers
5PR-L
5PR-R
3PR-L
3PR-R
QRT-L
QRT-R
EF-1α-L
EF-1α-R
PsbO-L
PsbO-R
Sequences
CAGTCTTAAGCTCGGGCCCCA
CAGCGCGGATCCTGTTGCGAGG
CCTCGCAACAGGATCCGCGCTG
CTGCCAGGAAACAGCTATGAC
ATGGCCGCGTCCCTCGCAACAG
AAGGCCCTTGAGAGGTTCGAGG
AACTGGAGAAGGAACCCAAG
AACGACCCAATGGAGGATAC
ATGGCCGCGTCCCTCGCAACAG
TCAATTTGTGCATACCATGGG
203
生 命 科 学 研 究 2012 年
图 3 不同植物的 PsbO 蛋白多序列比对结果
Fig.3 The multiple protein sequences alignment result
表 2 PwPsbO 的同源基因
Table 2 Homological genes of PwPsbO
图 2 PwPsbO 蛋白的疏水性分析图谱
Fig.2 Hydrophobic analysis of PwPsbO
ProtScale output for user sequenoe
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
-0.5
0
-1.0
-1.5
-2.0
-2.5
Sc
or
e
Position
50 100 150 200 250 300
Hphob. / Kyte & Doolittle
Species
Arabidopsis thanliana
Populus trichocarpa
Bruguiera gymnorhiza
Zea mays
Phyllostachys edulis
Vitis vinifera
Nicotiana benthamiana
Accession
AT5G66570
AT3G50820
XP_002310188
AB043960
ACG31595
ABV57472
XP_002274796
AAX53163
Gene
AtPsbO1
AtPsbO2
PtPsbO
BgPsbO
ZmPsbO
PePsbO
VvPsbO
NbPsbO1
E value
e-126
e-125
0
0
3e-180
2e-97
0
0
204
第 3 期
图 8 PwPsbO 基因在两年生青杄的相对表达情况
Fig.8 Transcript accumulation of PwPsbO in 2-year-old
trees
图 7 青杄各组织 RNA 提取结果
Fig.7 The result of RNA of five tissues in Picea wilsonii
图 6 由 SWISS-MODEL 工具预测的 PwPsbO 蛋白的三
级结构
Fig.6 The tertiary structure of protein PwPsbO present-
ed by SWISS-MODEL
图 4 不同植物间 PbsO 基因系统树
Fig.4 Polygenetic tree of PbsO about 8 kinds of differ-
ent plants
BgOEP1
NbPSBO1
VvPSBO1
AtPSBO1
AtPSBO2
PwPSBO1
ZmOEP1
PePSBO
0.02
50 100 150 200 250
图 5 PwPsbO 蛋白的二级结构预测图
紫色代表随机卷曲, 红色代表 α 螺旋结构, 蓝色代表 β 折叠.
Fig.5 The secondary structure of protein PwPsbO presented by GOR4
The part of purple/red/blue represent the random coil/ alpha helix/ extended strand.
28S
18S
root stem needles pollen seed
root stem needles pollen seed
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
Re
la
tiv
e
ex
pr
es
sio
n
2.6 PwPsbO基因在不同组织中的表达情况
分别提取青杄根、茎、叶、花粉、种子 5种组织
的总 RNA. 经过 1.2％琼脂糖凝胶电泳 (110 V, 15
min), 18 S和 28 S条带明显(图 7). 接下来我们对
所提取的 RNA 进行 OD260/280检测分析 , OD 值大
小介于 1.8～2.0之间, 说明提取的总 RNA纯度比
较好, 可以用于后续实验．
将上一步提取的各组织 RNA 通过加拿大
Fermentas 公司的 RevertAidTM First Strand cDNA
Synthesis Kit 合成双链 cDNA 试剂盒反转录为
cDNA. 利用 KAPA公司的 SYBR FAST qPCR Kit
（ABI prismTM）在 ABI StepOnePlus实时荧光定量
PCR仪进行 RT-qPCR实验. 设置阴性对照和空白
对照, 每次试验设置 3个重复, 得到 PsbO基因在
不同组织中表达情况的 RT-qPCR的结果（图 8）.
结果显示, PsbO基因在青杄的茎和叶中的表达量
最高.
3 结论与讨论
以青杄 cDNA文库为模板的 RACE实验是基
于 EST 保守序列和 pDONR222 载体上特异的引
物进行的, 因此 cDNA 全长是由 PsbO 的末端序
列和 EST序列进行拼接而来的, 进而完成基因的
克隆. 本研究成功获得了青杄 PsbO基因的cDNA
序列并推导出了它的氨基酸序列. 青杄 PsbO基
因的全长 cDNA共 1 260 bp, 包括 1 041 bp的完
整的 53 bp的 5′非翻译区 (5′site untranslated re-
gion, 5′-UTR), 368 bp的 3′非翻译区(3′-UTR)以及
刘亚静等：青杄 PsbO基因 cDNA序列克隆及生物信息学分析 205
生 命 科 学 研 究 2012 年
poly(A)尾巴. 青杄 PsbO基因编码 346个氨基酸,
预测相对分子质量为 36.6 kD, 理论 pI值为 5.29.
青杄 PsbO蛋白的二级结构预测表明此蛋白
含有 23.99%的 α螺旋结构（alpha helix）, 21.97%
的 β折叠结构（extended strand）, 54.05%的随机卷
曲结构（random coil）, 三级结构以无规则卷曲为
主, α 螺旋和 β 折叠主要分布在 PsbO 蛋白的外
围. 三级结构中形成了一个圆桶形的结构域, 可
以推测锰离子在该区域螯合. 这个结果和以往的
研究成果基本类似, 但具体的结构尚需实验印证.
目前已有研究使用小角度的 X射线观测了低分
辨率下野生型菠菜 PsbO蛋白. 该蛋白在溶解状态
时以单分子状态存在[13]. 这也和本研究预测的 Pw-
PsbO蛋白为可溶性蛋白一致.
最新的研究表明 psbo突变植物的光合系统
Ⅱ放氧复合体的稳定性存在多样缺陷. 真核生物
中的 PsbO蛋白可能通过与锰离子、钙离子以及
氯离子的联系影响光系统Ⅱ放氧过程的氧化还原
反应[14]. 目前已经在拟南芥、水稻、小麦、菠菜、烟
草、番茄等许多植物中发现 PsbO基因具有多个
拷贝的现象, 这说明 PsbO在响应高光胁迫过程
中, 可能存在一种通过调控 D1蛋白周转达到提
高植物抗性的机制, 而且有关研究也发现某些逆
境条件上调 PsbO基因的表达, 表明 PsbO基因可
能在提高植物抗逆性方面具有一定的作用. 我国
特有树种青杄（Picea wilsonii）是一种品质非常优
良的树种, 性强健、适应力强、耐阴性强、耐寒性
强, PsbO基因是否在逆境响应中发挥作用, 还需
要进一步研究. 本研究首次从中国特有树种青杄
中克隆得到了 PwPsbO基因的 cDNA 全长, 并应
用生物信息学的方法初步预测了该基因的一些性
质和结构方面的特征, 这对继续研究 PwPsbO如
何保持光系统Ⅱ的稳定性以及在逆境胁迫响应中
的功能等方面具有一定的意义.
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