全 文 ：ISSN 0582-9879
生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报
ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA 1999 , 31(6):715-717 CN 31-1300/Q
收稿日期:1999-04-09　　接受日期:1999-06-25
＊国家自然科学基金资助项目 , No.39430020
＊＊联系人:Tel , 0531-8564429;Fax , 0531-8565234;e-mail:
gaopj@life.sdu.edu.cn
研究简报
裂褶菌纤维二糖脱氢酶吸附纤维素性质＊
方　靖　高培基＊＊
(山东大学微生物技术国家重点实验室 , 济南 250100)
摘要　　纤维二糖脱氢酶(CDH)可以吸附棉花 、微晶纤维素和酸处理纤维素 , 4 min 便都达到平衡。与纤维素酶明
显不同 , 该酶的 Sca tchard 吸附曲线都是一条直线 , 为典型的单结合位点模型(one-binding-site model)。观察到 pH
值 、温度 、乙二醇和 NaCl对 CDH 吸附微晶纤维素有影响 , 并进行了讨论。
关键词　　纤维二糖脱氢酶;纤维素吸附;纤维素;纤维素酶
　　纤维二糖脱氢酶(cellobiose dehydrogenase ,
CDH), 以前又称纤维二糖氧化酶(cellobiose oxi-
dase), 由一些可降解木质纤维素的丝状真菌生
成[ 1 ,2] 。CDH 氧化纤维二糖 、纤维寡糖和纤维素 ,
并可以还原多种电子受体 , 如 cyt C 、二氯酚靛酚 、
Fe
3+及 O2 等。CDH 还原 Fe3+和 O2 , 生成的 Fe2+
和H2O2 , 发生 Fenton反应生成强氧化性的羟基自
由基 。CDH 还可以还原苯氧自由基抑制它们的聚
合[ 1 ,3 ,4] 。据此 , 人们推测 CDH 在木质纤维素的降
解中可能起作用:生成羟基自由基氧化降解木质纤
维素;还原木素降解中间产物苯氧自由基 , 阻止其
再聚合 , 进而促进木素降解 。
和纤维素酶一样 , CDH 也吸附纤维素 。纤维素
酶吸附水不溶的纤维素是其水解纤维素的重要步
骤 , 这使酶的水解在底物表面进行 。但 CDH 吸附
纤维素的作用是什么还不知道 , 其吸附纤维素的特
点和机制亦知之甚少 。本文以木腐真菌裂褶菌
(Schizophyllum commune)AS 5.391 所产 CDH 为
对象 , 对该酶吸附纤维素的一些性质进行了研究 。
1　材料和方法
1.1　材料　　CDH 的制备及纯化见文献[ 3] 。棉
花纤维素(脱脂棉)和微晶纤维素(CF11 , Sigma),
在使用前均过 100 目筛 , 其结晶度分别为 82%和
66%。磷酸膨胀纤维素的制备按文献[ 3] , 结晶度
为 0。
1.2　酶活力的测定　　CDH活力测定和酶活力单
位定义见文献[ 3] 。
1.3　吸附实验　　100 mg 纤维素先经 50 mmol/L
pH 5.0 醋酸缓冲液 30 ℃浸泡 0.5 h 后 , 加入
CDH , 总体积为 2 ml , CDH的初始浓度为 20 ～ 230
mg/L 。上述混合物于 30 ℃振荡 30 min (150 r/
min)后 , 离心 (10 000 g , 10 min), 取上清液测
CDH 活力 , 以此计算上清液中 CDH 量。起始加入
的 CDH量与未吸附量的差值即为吸附纤维素上的
CDH 。选用以下缓冲液测定 pH 对 CDH 底物吸附
的影响:pH 5 , 醋酸缓冲液;pH 6 ～ 8 , 磷酸缓冲液;
pH 9 , 甘氨酸-NaOH 缓冲液。研究有机溶剂的影响
时 , 50 mmol/L pH 5.0的醋酸缓冲液中加入不同
浓度乙二醇。NaCl的加入用来测定离子强度对吸
附的影响。CDH 吸附纤维素达到平衡所需时间的
测定如下:在 30 ℃50 mmol/L pH 5.0醋酸缓冲液
中 , CDH吸附纤维素 , 测定不同吸附时间的吸附情
况 。实验结果均为 3次实验数据的平均值。
2　结果和讨论
2.1　CDH吸附纤维素动力学　　纯化的 CDH 的
比活力为 11.5 μmol·L-1·min-1·mg-1 , 每一活力
单位相当于 0.087 mg 的CDH 。CDH 吸附纤维素是
一个很快的过程 , 在 4 min内便都达到平衡(图 1)。
Samejima 等 报 道 , 相似 条 件下 Phanerochaete
chrysosporium 的 CDH 吸附结晶纤维素时约需 30
min达到平衡 , 在吸附结晶度为零的纤维素时达到
吸附平衡所需时间至少 3 h[ 5] 。在吸附纤维素上 ,
来源不同的这两种 CDH 存在差异 。
Fig.1　Time course o f CDH binding to different cellulose
○, cot ton cellulose;□, microcrystalline cellulose;
△, phosphate-sw ollen cellulose.
2.2　不同条件对CDH吸附微晶纤维素的影响　　
纤维素酶吸附纤维素常用 Langmuir 公式表示:qad
=kp·qmax/(1+kp·q)。其中 , qad表示吸附的酶量
(每克纤维素吸附酶的毫克数 , mg/g), q 为未吸附
的酶量(每毫升溶液中酶的毫克数 , mg/ml)。k p 是
常数 , qmax表示酶的最大吸附量。加入少量酶时 ,
其中的大部分会很快吸附到纤维素上 , 溶液中未吸
附酶的浓度很低 , k p·q的值可以忽略不计 , 则上式
可简化为:qad=kp·qmax或 qad=α·qmax 。其中 , α为
分配系数(distribut ion coefficient), 是衡量酶与纤维
素亲和力的尺度 。
CDH 对纤维素的吸附亦符合 Langmuir 公
式[ 3] 。所用 CDH 在实验 pH 值和温度范围内保持
稳定[ 3] , 在 50%的乙二醇溶液中 0.5 h 内活力仅损
失1%。因此 , 该条件下据酶活力计算酶蛋白质量
并反映酶对底物的吸附可以说明问题 。温度 、pH
值 、NaCl和乙二醇对 CDH 吸附微晶纤维素的影响
结果见表 1 , 并分析如下:(1)吸附温度升高 , CDH
的 qmax提高 , 但α值降低。温度升高使酶分子运动
加剧 , 使酶的结合位点更多地暴露 , 从而加大吸附
量。对于酶与底物的亲和力减小 , 从量热学的角度
来看 , 这可能是温度变化引起蛋白质分子内旋转自
由度的变化 , 并对蛋白质的结构产生微扰作用 , 从
而影响酶与纤维素表面的亲和力。(2)随着 pH 值
增大 , CDH 的 qmax减小而 α值却提高。这可能是
pH的改变影响了酶分子内电荷分布和酶分子带电
荷数量的变化 , 从而引起酶分子构象的变化 , 构象
的改变影响了酶对底物的吸附。(3)乙二醇的加
入 , 大大降低酶的最大吸附量和底物亲和力 。有机
溶剂的加入将使酶分子的极性基团内藏而疏水基团
暴露。可见 , CDH 对纤维素的吸附中 , 极性基团间
的相互作用可能起主要作用。NaCl 的加入却对
qmax和α值有一个正效应。根据这一结果 , 我们推
测在 CDH 吸附纤维素的过程中 , 它们之间的静电
作用可能不大 。若其相互作用以静电作用为主 , 那
么随着盐浓度的增加 , 电荷的屏蔽作用加强 , 酶与
底物的亲和力将下降 , 而结果却与此相反 。结合乙
二醇对 CDH 底物吸附的影响 , 我们认为 , 在吸附
过程中 , 酶和底物表面的水合度(degree of hydra-
tion)可能会影响CDH 对纤维素的吸附。
Table 1　Effects of parameters on CDH binding to microcrys-
talline cellulose
Condi tions qmax/ m g·g -1 α/ ml·g -1
Temperature / ℃
1 0.38 41
15 0.62 30
30 1.10 17
pH
5 1.10 17
6 0.80 18
7 0.64 14
8 0.30 24
9 0.22 40
c(NaC l)/ mol·L-1
0 1.10 17
0.5 1.33 52
1.0 1.48 75
1.5 1.70 86
2.5 1.79 111
3.0 2.04 120
Ethylene glycol / %
0 1.10 17
25 0.15 12
50 0.10 11
2.3　CDH 吸附模型　　常用 Scatchard吸附曲线
(qad/ q对qad作图)来研究酶吸附底物的模式。若该
曲线是一条直线 , 表明吸附为单结合位点模型(one-
binding-si te model)[ 6] 。CDH 吸附上述 3种纤维素
所作的 Scatchard曲线都呈直线关系(图 2)。因此 ,
CDH 对纤维素的吸附可能属于单结合位点模型。
然而 , 纤维素酶吸附纤维素所作的 Scatchard曲线
并不呈直线关系 , 纤维素酶对纤维素的吸附似乎更
适合于多结合位点模型(multiple-binding-site mod-
el)[ 6] 。这点上 , CDH 与纤维素酶存在明显不同。
许多真菌纤维素酶(包括一些细菌纤维素酶)有
一个共同的分子结构特征 , 即由一个催化域
(catalytic domain)和一个底物结合域(cellulose-bind-
ing domain , CBD)中间通过一个短肽连接起来 ,
CBD位于酶的 C 末端或 N 末端[ 7] 。大多真菌纤维
素酶的 CBD由 33 ～ 35个氨基酸构成 , 而且有一定
的保守性 。但是 , CDH 的纤维素底物结合域的本质
却一无所知。从 P .chrysosporium 的 CDH 序列分
析来看 , 无论是 C端还是 N 端 , 都没有相似于纤维
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素酶 CBD 的序列结构 。Henriksson 等认为 P .
chrysosporium 的 CDH 的纤维素结合域可能位于其
蛋白质序列的中间部分[ 8] 。而 S .commune 来源的
CDH 的序列目前还不知道。
CDH 吸附纤维素的作用是什么目前还不完全
清楚 。对于 CDH 吸附纤维素 , 我们认为可能有以
下作用:(1)可以使 CDH 生成的羟自由基最大限度
地靠近底物并氧化攻击之;(2)可以及时还原木素
酶氧化降解木素时产生的中间产物苯氧自由基 , 有
利于木素的降解。
Fig.2　Scatchard plo t of CDH adsorption onto cellulose
Adsorption of CDH to cellulose was carried out in 50 mmol/ L pH 5.0 acetate buffer at 30 ℃.(A)Adsorbed on cotton cellulose;(B)Adsorbed
on microcrystalline cellulose;(C)Adsorbed on phosphate-sw ollen cellulose.
参考文献(References)
1　Ander P.The cellobiose-oxidizing enzymes CBQ and CBO as related
to lignin and cellulose degradation—a review.FEMS Microbiol
Rev , 1994 , 13:297—312
2　Fang J , Qu Y B , Gao P J.Wide dist ribution of cellobiose-oxidizing
enzymes in w ood-rot fungus indicates a physiological importance in
lignocellulosics degradat ion.Biotechnol Tech , 1997 , 11:195—197
3　Fang J , Liu W , Gao P J.Cellobiose dehydrogenase from Schizo-
phyllum comm une:purification and study of some cataly tic , inact i-
vat ion , and cellulose-binding propert ies.Arch Biochem B iophys
1998 , 353:37—46
4　方　靖 , 刘　稳 , 高培基(Fang J , Liu W , Gao P J)纤维二糖脱氢
酶抑制酚型化合物聚合及促进木素降解的研究。生物化学与生
物物理学报(Acta Bioch imica et B iophysica S in ica), 1999 , 31
(4):415—419
5　Samejima M , Ohkubo T , Igarashi K , Isogai A , Kuga S , Sugiyama
J , Erik sson K E L.The behavior of Phanerochaete chrysosporium
cellobiose dehydrogenase on adsorption to crys talline and amorphous
cellulose.Biotechnol App l B iochem , 1997 , 25:131—141
6　Slid V , Stahlberg J , Pet tersson G , Johansson G.Ef fect of potential
binding site overlap to binding of cellulase to cellulose:a tw o-dimen-
sional simulation.FEBS Let t , 1996 , 378:51—56
7　Linder M , Teeri T T.The roles and function of cellulose-binding
domains.J B iotech nol , 1997 , 57:15—28
8　Henriksson G , Salumets A , Divne C , Pet tersson G.Studies of cel-
lulose binding by cellobiose dehydrogenase and a comparison w ith
cellobiohydrolase I.Biochem J , 1997 , 324:833—838
Adsorption on Cellulose of the Schizophyllum commune
Cellobiose Dehydrogenase
FANG Jing and GAO Pei-Ji＊
(The S tate Key Lab of Microbial Technology , Shandong Universi ty , Jinan 250100 , China)
Abstract　　Equilibrium of adsorpt ion of cellobiose dehydrogenase (CDH)of Schizophyl lum commune on cot-
ton cellulose , microcrystalline cellulose , and phosphate-swollen cellulose w as reached w ithin 4 min.The binding
isotherms of CDH adso rbed on the above substrates were a straight line in Scatchard plot analysis , indicating that
the binding fit ted to the one-binding-site model.It w as found that CDH adsorption onto microcry stalline cellu-
lose w as st rong ly affected by temperature , pH , NaCl , and ethylene glycol , respectively.
Key Words　　cellobiose dehydrogenase;cellulose binding;cellulose;cellulase
Received:April 9 , 1999　　Accepted:June 25 , 1999
＊C orresponding author:Tel, 86-531-8564429;Fax , 86-531-8565234;e-mail , gaopj@life.sdu.edu.cn
717Nov., 1999 方　靖等:裂褶菌纤维二糖脱氢酶吸附纤维素性质