全 文 ：菌 物 系 统 1 9( l) :10 7一 1 1 0 , 200 0
几如e o sy s te m a
裂褶菌产纤维二糖脱氢酶条件优化及
部分酶学性质研究 `
方靖 刘稳 高培基
(山东大学微生物技术国家重点实验室 济南 2 50 10 0)
摘 要 研究 了裂褶菌 及 hl : op 柳 llu m co ~ un e A s 5
.
39 1 产纤维二糖脱氢酶的条件 。 该酶是
诱导酶 , 棉花是最好的诱导底物 。 培养基中加人唬拍酸钠缓冲液和土温 80 利于酶的合成 。 而
木素相关物质黎芦醇或愈创木酚对酶的生成没有影响 。 该酶在 p H 3 . 5一 10 . 5 和 45 ℃ 以下保持
稳定 , 其最适作用温度为 30 ℃ , 最适 p H 为 4 . 5 。 z n , 十 和 A g 十对该酶活性有很大的抑制作用 , 而
叠氮化钠和氰化钾对酶活力没有影响 。
关键词 : 裂褶菌 , 纤维二糖脱氢酶 , 酶的合成 , 酶性质研究
中图分类号 : Q 93 9 , 7 文献标识码 : A 文章编号 : 100 7一 35 15 (20 00 ) 0 1刁 10 7一 1 10
纤维二糖脱氢酶 ( C e n o ib os e eD hy dr og e n as c , C D峋由可降解木质纤维素的丝状真菌
合成 ( E ir k s s o n e r a l . , 19 9 3 : A n d e r 19 9 4 : aF n g e r a l . , 19 9 7 ) , 以前 又称纤 维二 糖氧化酶
( C e l l o b i o s e O x id as e
,
C B O )
。
C D H 是一胞外黄素血红素蛋 白 。 它可以氧化纤维二糖和纤
维寡糖 , 甚至还可以氧化纤维素 (K r e m e r an d W o o d 19 9 2 a) 。 以纤维二糖为电子供体 , 该
酶可以还原多种电子受体 , 象细胞色素 c , 二氯酚靛酚 , eF , 十 及 0 2等 ( E ir ks s on o t al . , 19 93 ;
A nd
e r , 19 4)
0
C D H 被认为可以通过还原 eF , 十 和 0 2生成 eF nt on 试剂来氧化降解纤维素
(K r e m er a n d W
o o d
,
19 9 2 b)
。 同时 , 该酶还可以还原木素相关的醒和苯氧 自由基 , 这样可
以阻止木素酶氧化木素时生成的 自由基的再聚合反应 . 因此 C D H 被认为可能在木素降
解中起重要作用 ( A cr ih b a ld e z a z . , 19 9 7 ) 。
c D H 的作用受到重视 , 但酶产量较低 。 我们研究了裂褶菌及h招op hy lu m co
~
ne 合成
C D H 的影响因素 , 在原基础上大大提高了酶产量 。 并对该酶的部分酶学性质进行了研究 。
1 材料与方法
1
.
1 菌种及培养条件
裂褶菌 反h 陀之琴〕彻 lu 川 阳m m un o A S . 391 液体种子培养基的组成为 2% 的葡萄糖和 0 . 5% 的酵母膏 ,
p H S
.
0 ; 发酵基本培养基 的组成 (L 一 ’ ) : 109 脱脂棉 花 , 2 9 (N H礴 ) ZS q , l g K H ZOP 4 , o
.
3 ggM s q
·
7城o,
o
·
0 8 9 aC a
Z,
s m gnZ s o
;
’
7乓 o , l · s m g Mn s q ’ 4代 0 , l · s m g C o C I: ’ 6乓o , s m g eF s q ’ 7代 o , 0 · 19酵母膏和 o . l m g V B I , p H S . o 。
L Z 培养方法
种子制备 : 从菌种斜面挖取 2 块直径约为 I c m 的菌丝块接种到种子培养基中 (3 0 m l三角瓶中装 25 m l) ,
巾 基金项 目 : 国家自然科学基金 ( 3 94 30 0 2 0) 及山东大学微生物技术国家重点实验室资助项 目
DOI : 10. 13346 /j . mycosystema . 2000. 01. 022
0 18菌 物 系 统 9 1卷
用接种钩打碎 , 28 ℃下摇瓶 ( 12 0 r / m i n) 培养 60 小时 。 两瓶 上述液体种子接种到产酶培养基中 (40 Om l 于
I L 三角瓶中 ) , 2 8℃下摇瓶 (1 2 0 r / m i n )培养 .
1
.
3 酶活力测定
C D H 活力的测定采用细胞色素 c 还原法 (aF ng 。 t al . , 1 9 97) 。
2 结果与讨论
2
·
1 S e o m m u n e 的产酶曲线
S c 口~
u n e 培养到第 3 天时才测到 C D H 的活力 , 培养到第 14 天时酶活出现峰值 , 据
此确定今后的培养时间为 14 天 。
2
.
2 培养条件对 S 。 o m m u n 。 产 C D H 的影响
.2 .2 1 培养基碳源和氮源对产酶的影响 以梭甲基纤维素 、 酸处理纤维素 、 微晶纤维素和
脱脂棉花为碳源 ( 1% , w / v) 时 , C D H 的活力分别为 1o u/ L , 28 u/ L , 62 u/ L , 和 78 u/ L 。 而
淀粉或木聚糖为碳源时 S 。 口m m un 。 不合成 C D H 。 可见 C D H 是一诱导酶 , 以纤维素为碳
源时 S 。 口~ un 。才合成 CD H
。 且随着纤维素底物结构的复杂性和结晶度的提高 , 诱导产
酶的能力亦越来越强 , 以高结晶度的棉花为最佳 。
分别以 ( N H {) ZS q , (N H礴 ) Z HP O 4 , (N H礴) 。C 6 H S O 7 , (N H礴 ) Z q 坟 0 6和 N H礴NO 3作为氮源
(0
.
2%
,
w /
v )时 , C D H 活力分别 为 7 6 u / L , 8 9 u / L , 6 6 u / L , 6 l u / L , 和 4 6 u / L 。 其 中以
(N代 ) ZPH q 为最佳
。 以后的研究 中均以 ( N H乌) 2PH 0 4作为氮源 。
.2 .2 2 培养基起始 p H 值和不 同的缓冲体系对 C D H 合成 的影响 : 培养基起始 p H 为 4一 5
时利于 c D H 的生成 , 以 4 . 5 时产酶最高 。 当 pH 高于 5 . 5 时 c D H 的合成急剧下降 。 同时研
8 1 0 1 2 14 1 6
T i m e ( d )
图 1 培养基 p H 值的时间曲线 。 ( . )培养基 p 4H . 5 ,
不加唬拍酸钠 。 ( . )培养基加唬拍酸钠 ( 20 ~ ol 几 )
,
p H 4
.
5
.
R g
.
1 iT m e e o u rs e o f ht e PH v a lu e o f ht e m e id um
.
( . )
Iin it al P H o f 4万 w iht o u t ad d i it o n o f s cu c l n a te ; ( . )
Iin it al PH o f 4石 w iht a d d i it o n o f scu e i n a te (2 0 m m o l /L )
究 了基本培养基中加人不 同的缓冲体系
( Z onu
o l / L 培养基 p H 值为 4 . 5 )对 C D H
合成的影 响 。 发现不同的缓冲体系对酶
的生成影 响是较大的 。 培养基中加人醋
酸缓冲液 , 14 天后 C D H 活力为 1 1Zu/ L
加人柠檬酸缓冲液 , C D H 活力为 109 u /
L
, 加人酒石酸缓冲液 , C D H 活力为 1 14t
/ L
, 而人唬拍酸缓冲液时 , C D H 活力达
1 2 5 u / L
o
.5 c o m m u n e A S 5
.
39 1在培养过程
中培养基的 p H 变化 曲线见图 1 。 培养基
起 始 p H 为 4 . 5 且不加唬 拍酸钠 时 , 整个
培养过程 中 p H 的变化较大 。 若加人唬拍
酸钠 , 则整个培养过程 中 p H 变化则相对
较小 。 这大概是利于产酶的一个原因 。
2
.
.2 3 土温 80 的影响 : 土温 8 0 对 C D H
的合成有明显的促进作用 。 .0 2% 的土温 80 对产酶最为有利 。 土温 80 可以提高细胞膜的
通透性 , 利 于 C D H 向胞外分泌 , 可以解除已合成的 C D H 在胞 内对酶基因转录或 m RN A 翻
方靖等 :裂褶菌产纤维二糖脱氢酶条件优化及部分酶学性质研究
译的阻碍 。
. . 2 24木素类化合物对 C DH合成的影响 :黎芦醇或愈创木酚 ( 1.5 1l l l lo l l /) L的加人对 C DH
的合成没有影响 。 上述物质为芳环化合物 , 是木素酶的底物 , 常用做木素模型物 。 但是它
们不能代表天然木素分子 。 因此 , C D H 的合成是否受天然木素分子的诱导还需要进一步
的研究 。
.2 .2 5 产 酶 条件优 化 : 通 过 以 上 初步 探索 , 对培养基 进行优化 (-lL ) : or g 脱脂棉花 ,
2 9 (N H 4 ) 2 lH, O
4,
l g K H Z p O 4
,
0
.
3 9 M g s q
·
7坟 O , o · 0 8 9 C aC 12 , s m g Z n s O 4 · 7乓 o ,
l
.
sm g Mn SO
4 ·
4代 O , l . s m g C o C 12 · 6坟 O , sm g eF s q · 7坟 O , 0 . 19 酵 母膏 , o . l m g
V B ;
,
.02 % 土温 80 , 20 m M / L 唬泊酸钠 , p 4H
.
5
。 该条件下 , 28 ℃培养 14 天 , CDH 活力达
1 4 0 u/ L
, 比未优化时提高近 80 % 。 这一结果与国外的最高水平 ( 14 1u/ )L 相 同 。
.2 3 C D H 的一些基本性质
c D H 在 p H 3 . 5一 10 . 5保持稳定 , 在 p H .4 0一 5 . 0 显示较高的催化活性 , 最适作用 p H 为
4
.
5
。 它对温度 比较敏感 , 50 ℃ 保存 1小 时活力 损失 约 50 % , 其最 适作用 温度 为 30 ℃ 。
nz
, +
、
A g
+ 及十二烷基磺酸钠强烈抑制 c D日 的活性 , 而叠氮化钠和氰化钾对 C D H 的活力
没有影响 (表 1 ) 。
表 1 金属离子和各种试剂对 C D H活力的影响 `
aT b l
e 1 E fe
e t o f m e alt 一o n s an d s o m e er ag e n st o n C D l l 朗 it v i yt
条件 浓度
C o n d i it o n C o cn e n t ar it o n (m m o l /L )
,乙二2戈口气曰哎Jr、é畔+gzH犷ósDS默
残余活力
趾 s id u a l a e it v i t y (% )
10 0
3 2
9 9
10 0
4 l
10 0
10 5
条件 浓度
C o dn i it
o n C o cn e n t ar it o n( m
o l / L )
残余活力
砒 s idual ac it v iyt (% )
8 8
7 8
9 7
10 5
0
10 1
9 8
八曰,一2CK+gAcoz
B a
-
Z n Z
gM
, +
C u Z
+
中
C D H 在含上述试剂的
*
C D H w as k e P t in
10 0 m m o l / L
10 0刀1 1110 1/ L
p H S
.
o 的醋酸缓冲液中 , 30 ℃放置 12 小时 , 然后测定残余 c D H 活力 .
P H S
.
0 ac e at et b u fe
r
a b o v e er ag e n st er s pe e it v e ly
.
hT
e n ht e er s id u al C l〕H ac it v iyt
a t
W a s
3 0 oC fo
r 12 h
.
hT
e b u fe
r s y s et m c o n面 n e d het
d e et n n l n e d
.
叠氮化钠和氰化钾是血红蛋白的抑制剂 , C D H 含血红素 , 却不受这两种化合物的抑
制 , 这可能与 C D H 分子中血红素基团的配位情况有关 。
【R E F E R E N C E S I
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P R O D U C T IO N B Y 及斗刀Z以只耳 1乞 L之屏 f C凸U
A N D S O M E P R O P E R T IE S O F T H E E N Z Y M E
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K E Y W O R D S
: 全 h七op 柳 lu m e o 刀 J” 之u n e , eC l lo b i o s e 氏h y d r o g e n as e , E nz y m e P r o d cu it o n , C h a 「a c te ir z a Uo n
会 讯
▲由中国菌物学会主办 、 福建省食用菌协会承办的 “全国第六届食用菌学术讨论会” , 拟定于 2 00 年 1 月中
旬在福建省福州市召开 。 会议将设主会场和分会场 ; 主会场设在福州市 , 以学术交流为主 , 分会场设在福建
古田 , 以研讨食用菌生产技术等方面的问题 , 并到食用菌生产基地参观 。 欢迎从事食用菌科研和生产的同
行届时参会 。
中国菌物学会