全 文 ：第 30卷第 4期 大 连 海 洋 大 学 学 报 Vol．30 No．4
2 0 1 5 年 8 月 JOUＲNAL OF DALIAN OCEAN UNIVEＲSITY Aug ． 2 0 1 5
DOI:10．16535 / j．cnki．dlhyxb．2015．04．013 文章编号:2095－1388(2015)04－0417－05
萱藻中岩藻聚糖硫酸脂的提取工艺
优化及其保肝护肝作用
王庆钧，谷越，杨颖，汪秋宽，宋悦凡，何云海，任丹丹，丛海花
(大连海洋大学 食品科学与工程学院，国家海藻加工技术研发分中心，辽宁省水产品加工及综合利用重点实验室，辽宁 大连
116023)
摘要:岩藻聚糖硫酸酯是一种广泛存在于褐藻中的水溶性杂多糖，具有多种生物活性。为研究萱藻岩藻聚
糖硫酸脂的保肝护肝作用，以大连沿海的新鲜萱藻 Scytosiphon lomentaria为原料，利用复合酶解法提取萱藻
中的岩藻聚糖硫酸酯，并用正交试验法优化提取工艺。结果表明:复合酶解法的最佳工艺参数为酶加量
2. 95%、酶解温度 50 ℃、pH值 5. 5、酶解时间 60 min，在此条件下岩藻聚糖硫酸酯的提取率为 4. 28%;萱
藻岩藻聚糖硫酸酯对 CCl4 诱导的小鼠急性肝损伤的保肝试验显示，萱藻岩藻聚糖硫酸酯可显著抑制小鼠血
清中 AST、ALT、LDH活性和肝脏 MDA含量的升高，显著提高肝脏 GSH含量和 SOD活性。研究表明，萱
藻中岩藻聚糖硫酸脂具有显著的保肝护肝作用。
关键词:萱藻;岩藻聚糖硫酸酯;提取工艺;保肝护肝
中图分类号:Ｒ151 文献标志码:A
萱藻 Scytosiphon lomentaria 隶属于褐藻门，广
泛分布于中国辽东半岛到海陵岛之间的沿海地区，
属于温带性海藻［1］。萱藻藻体的生长方式为单条
丛生，每条长度为 15 ～ 70 cm，在幼体时藻体为实
心，长到成体时变成空心，藻体呈节状，是一种重
要的海藻资源［2］。
据报道，萱藻中含有岩藻聚糖硫酸酯［3－5］，岩
藻聚糖硫酸酯具有降血脂、抗肿瘤、抗凝血、抗氧
化、降血糖等多种生物活性物质［3－9］。本研究中，
采用正交试验法对萱藻中岩藻聚糖硫酸酯的提取工
艺进行优化，并研究其保肝护肝作用，旨在为萱藻
的高效综合利用提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
新鲜萱藻购自大连市黑石礁市场。清洁级昆明
小鼠购自大连医科大学动物实验中心。
纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶均购自上海蓝
季科技发展有限公司，山梨醇购自天津市光复精细
化工研究所，联苯双酯滴丸购自北京协和药厂。乙
醇为 95% (体积分数，下同)的食用乙醇，其他
试剂均为分析纯。谷草转氨酶 (AST)、谷丙转氨
酶 (ALT)、乳 酸 脱 氢 酶 (LDH)、丙 二 醛
(MDA)、超氧化物歧化酶 (SOD)、微量还原型谷
胱甘肽 (GSH)和蛋白定量测试盒均购自南京建
成生物工程研究所。
1. 2 方法
1. 2. 1 萱藻水分的测定 参照 GB /T 5009. 3—
2003［10］，采用直接干燥的方法测定水分含量。
1. 2. 2 岩藻聚糖硫酸酯提取工艺的优化 准确称
取萱藻，加入至萱藻干基 18 倍的水，用高速组织
捣碎机捣碎，使用纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶
(三者的质量比为 4 ∶ 3 ∶ 2)，在不同的加酶量、酶解
时间、pH和酶解温度下进行酶解，然后将其置于
沸水中抽提 2 h，降至室温后离心，得上清液。在
上清液中加入乙醇，至乙醇含量为 20%，离心，
去掉溶液中的絮状沉淀，得上清液;在该上清液中
加入乙醇，至乙醇含量为 60%，产生白色沉淀后，
收稿日期:2015－01－30
基金项目:国家自然基金面上项目 (31471610)
作者简介:王庆钧 (1989—) ，男，硕士研究生。E－mail:724688263@ qq. com
通信作者:汪秋宽 (1962—) ，女，教授。E－mail:wqk320@ dlou. edu. cn
离心得到沉淀，即为岩藻聚糖硫酸酯粗产品。将得
到的岩藻聚糖硫酸酯粗产品加水溶解，在溶液中加
入乙醇至乙醇含量为 30%，溶液中产生少许不溶
物，离心除去不溶物，得上清液;再加入乙醇，至
乙醇含量为 70%，溶液中有白色沉淀产生时，用
无水乙醚洗涤沉淀，经冷冻干燥得白色粉末即为岩
藻聚糖硫酸酯粗提物［11］。
1. 2. 3 硫酸根和多糖含量的测定 采用盐酸水
解－硫酸钡重量法测定硫酸根含量［12］，采用苯酚－
硫酸法测定多糖含量［13］。
1. 2. 4 岩藻聚糖硫酸酯对四氯化碳 ( CCl4 ) 诱导
的小鼠急性肝损伤的保护作用 将 60 只体质量为
(18±2)g的清洁级雌性昆明小鼠，随机分为 6 组:
空白对照组、CCl4 模型组、联苯双酯阳性对照组
［剂量为 300 mg /(kg·d)］、萱藻岩藻聚糖硫酸酯
(F)低剂量组［100 mg /(kg· d) ］、F 中剂量组
［300 mg /(kg·d) ］、F 高剂量组［500 mg /(kg·
d) ］，每组放 10 只小鼠。连续 10 d 给小鼠饲喂基
础饲料，然后对阳性对照组和 F 剂量组小鼠进行
灌胃，每只每天灌胃规定剂量。末次灌胃 2 h 后，
给空白对照组小鼠腹腔注射植物油，给其他 5组小
鼠按 10 mL /kg (体质量)的剂量腹腔注射含 0. 4%
CCl4 的植物油溶液
［9］。小鼠禁食 24 h 后，从眼球
取血，脱颈处死小鼠，取肝脏称重。血液经 3000
r /min离心 15 min 得到上清，用试剂盒测定 AST、
ALT、LDH活性。肝脏取相同部位约 0. 3 g，加入
冰生理盐水进行匀浆，配制成 10%肝组织匀浆液，
剩余的肝脏放入甲醛中浸泡，制成肝切片后用显微
镜进行观察。用试剂盒测定肝脏匀浆液中的 GSH、
MDA、SOD值，并计算肝脏指数:
肝脏指数=肝脏质量 (mg) /体质量 (g)。
1. 3 数据处理
试验数据以平均值 ±标准差表示。用 SPSS
17. 0软件进行单因素方差分析，用 Duncan 法进行
多重比较，显著性水平设为 0. 05，极显著性水平
为 0. 01。
2 结果与分析
2. 1 萱藻水分
利用直接干燥法测得新鲜萱藻的水分含量为
(90. 62±0. 003)%。
2. 2 萱藻中岩藻聚糖硫酸酯提取工艺的优化
在料液比为 1 ∶ 18 (质量比)的萱藻水提取液
中，加入纤维素混合酶，以岩藻聚糖硫酸酯的提取
率 (提取率 = 岩藻聚糖硫酸酯 /原料干质量 ×
100%)、硫酸根含量为指标，设计 4因素 3水平的
正交试验 L9(3
4)，正交试验设计方案及试验结果
见表 1和表 2。
表 1 正交试验因素水平表
Tab. 1 Factor and level table in an orthogonal test factors
水平
level
因素 factors
A
酶加量 /%
quantity of
enzyme
B
温度 /℃
temperature
C
pH值
pH value
D
时间 /min
time
1 2. 65 45 5. 5 40
2 2. 95 50 4. 5 50
3 3. 25 55 5. 0 60
表 2 萱藻中岩藻聚糖硫酸酯提取的正交试验设计方案及
试验结果
Tab. 2 Orthogonal experimental design and results of the
fucoidan extraction from seaweed Cytosiphon Io-
mentaria
试验号
No．
A /% B /℃ C D /min
提取率 /%
extraction
yield
SO2－4
含量 /%
content
1 1(2．65) 1(45) 1(5．5) 1(40) 2．22 25．89
2 1 2(50) 2(4．5) 2(50) 3．20 22．83
3 1 3(55) 3(5．0) 3(60) 5．14 19．62
4 2(2．95) 1 2 3 4．00 21．88
5 2 2 3 1 5．86 18．82
6 2 3 1 2 4．98 18．89
7 3(3．25) 1 3 2 3．00 20．20
8 3 2 1 3 7．08 15．97
9 3 3 2 1 4．70 20．06
k1 3．52 3．07 4．76 4．26
k2 4．95 5．38 3．97 3．73
k3 4．93 4．94 4．67 5．41
Ｒ 1．43 2．31 0．79 1．68
k1 22．78 22．66 20．25 21．59
k2 19．86 19．21 21．59 20．64
k3 18．74 19．52 19．55 19．16
Ｒ 4．04 3．45 2．04 2．43
由表 2可知，以岩藻聚糖硫酸酯提取率为指标
时，由 Ｒ 值得知，各因素的影响能力依次为酶解
温度 ＞ 酶解时间 ＞ 酶加量 ＞ pH，最优组合为
A2B2C1D3;以 SO
2－
4 含量为指标时，由 Ｒ值得知，
各因素的影响能力依次为酶加量＞酶解温度＞酶解
时间＞pH，最优组合为 A1B1C2D1。
从 9 组正交试验中得出提取率最优组为 8 号，
即 A3B2C1D3， SO
2－
4 含 量 最 优 组 为 1 号，即
814 大 连 海 洋 大 学 学 报 第 30卷
A1B1C1D1。试验结果与用极差分析得到的理论值
结果不一致，因此，分别对 A2B2C1D3、A1B1C2D1
和实际的最优组 A3B2C1D3、A1B1C1D1 进行验证试
验，结果见表 3。
表 3 萱藻中岩藻聚糖硫酸酯提取的正交试验验证结果
Tab. 3 Verification test of the fucoidan extracting in an or-
thogonal experiment
试验组
test group
岩藻聚糖硫酸酯提取率 /%
fucoidan sulfate extraction yield
SO2－4 含量 /%
SO2－4 content
A2B2C1D3 4. 28 26. 04
A1B1C2D1 2. 74 27. 50
A3B2C1D3 6. 81 16. 22
A1B1C1D1 3. 16 24. 09
从表 3 可见:提取率最高的组为 A3B2C1D3，
为 6. 81%，但是在此条件下 SO2－4 含量较低;SO
2－
4
含量最高的组为 A1B1C2D1，为 27. 50%，但是在此
条件下提取率不高;综合考虑，A2B2C1D3组的提
取率和硫酸根含量都接近最高值，所以确定
A2B2C1D3 组为最优组。因此，本试验中条件下，
确定萱藻中岩藻聚糖硫酸酯的最佳提取工艺:料液
比为 1 ∶ 18，纤维素酶混合酶酶加量为 2. 95%，酶
解温度为 50 ℃，pH 为 5. 5，酶解时间为 60 min，
在此条件下，岩藻聚糖硫酸酯的提取率为 4. 28%，
SO2－4 含量为 26. 04%。
2. 3 萱藻中岩藻聚糖硫酸酯对 CCl4 造成的急性肝
损伤小鼠生化指标的影响
2. 3. 1 小鼠血清中 AST、ALT、LDH活性 从表 4
可见:注射 CCl4 后，与空白对照组相比，模型组
小鼠血清中 AST、ALT 和 LDH 活性均极显著升高
(P＜0. 01) ，说明 CCl4 对小鼠的肝脏造成了破坏，
建模成功;与模型组相比，灌胃岩藻聚糖硫酸酯的
各剂量组和联苯双酯阳性组小鼠血清中的 AST、
ALT和 LDH 活性均极显著下降 (P＜0. 01)，但各
剂量组与联苯双脂阳性组之间均无明显差异 (P＞
0. 05)。
表 4 小鼠血清 AST、ALT、LDH活性的变化 (n=10)
Tab. 4 Changes in ALT，AST and LDH activities in mice serum (n=10) U /L
组别 group 剂量 /(mg·kg－1·d－1) 谷草转氨酶 AST 谷丙转氨酶 ALT 乳酸脱氢酶 LDH
空白对照组 — 36. 28±9. 50Aa 23. 33±11. 76Aa 35. 18±25. 19Aa
CCl4 模型组 — 115. 8±45. 14Bb 108. 5±44. 03Bb 184. 7±82. 25Bb
联苯双酯阳性组 300 37. 05±17. 94Aa 43. 72±25. 68Aa 71. 94±29. 68Aa
F低剂量组 100 37. 37±22. 91Aa 28. 89±2. 81Aa 66. 31±37. 69Aa
F中剂量组 300 39. 10±12. 29Aa 28. 28±9. 11Aa 57. 20±31. 47Aa
F高剂量组 500 36. 63±17. 30Aa 25. 61±13. 06Aa 56. 89±30. 06Aa
注:同列中标有不同大写字母者表示组间有极显著性差异 (P＜0. 01) ，标有不同小写字母者表示组间有显著性差异 (P＜0. 05) ，标有相同
小写字母者表示组间无显著性差异 (P＞0. 05) ，下同
Note:The means with different capital letters within the same column are very significantly different at the 0. 01 probability level，means with different
letters being significantly different at the 0. 05 probability level，and the means with the same letters within the same column are not significant differ-
ences，et sequentia
2. 3. 2 小鼠肝脏中 MDA、GSH 含量和 SOD 活性
从表 5 中可见，注射 CCl4 后，与空白对照组相
比，模型组小鼠肝组织中 MDA 含量和肝脏指数均
极显著升高 (P＜0. 01) ，GSH 含量显著降低 (P＜
0. 05) ，SOD活性极显著降低 (P＜0. 05) ，说明小
鼠肝脏遭到破坏，建模成功;与模型组相比，灌胃
岩藻聚糖硫酸酯的各剂量组和联苯双酯阳性组的
MDA含量和肝脏指数均有降低，除联苯双酯阳性
组、F低剂量组与模型组的肝脏指数无显著差异外
(P＞0. 05)，其余组均与模型组的 MDA含量及肝脏
指数有显著性差异 (P＜0. 05) ;SOD活性均显著升
高 (P＜0. 05) ，F低剂量组 SOD活性的升高效果好
于 F高剂量组和 F中剂量组，GSH 含量均有升高，
仅联苯双酯阳性组和 F 高剂量组与模型组有显著
性差异 (P＜0. 05)。这表明，萱藻岩藻聚糖硫酸酯
对小鼠肝脏有显著的保护作用。
综上所述，从萱藻中提取的岩藻聚糖硫酸酯可
以抑制脂质过氧化，具有一定抗氧化和清除自由基
的能力，可以提高 GSH 含量和 SOD 活性，具有显
著的保肝护肝作用。
2. 3. 3 小鼠肝脏的组织学观察 从图 1 可以看
出:空白对照组的肝小叶结构清晰，细胞完整，形
态正常，可见清晰的细胞核;CCl4 模型组的中央
静脉周围细胞出现大面积坏死，细胞破裂成条状，
细胞核消失，排列紊乱，说明小鼠肝脏遭到破坏，
建模成功;与模型组相比，F低剂量组中央静脉周
围的细胞坏死且明显减少，多数细胞完整，形态正
常，细胞排列整齐，联苯双酯阳性组和 F 中剂量
914第 4期 王庆钧，等:萱藻中岩藻聚糖硫酸脂的提取工艺优化及其保肝护肝作用
组、F高剂量组与空白对照组相近。从光学显微镜
下观察到的组织学形态可以得出，萱藻中的岩藻聚
糖硫酸酯对 CCl4 诱导的小鼠肝损伤具有显著的保
护作用。
表 5 小鼠肝脏MDA、GSH含量和 SOD活性的变化 (n=10)
Tab. 5 Changes in MDA and GSH contents，and SOD activity in livers of a mice (n=10)
组别
group
剂量 /
(mg·kg－1·d－1)
丙二醛 MDA /
(nmol·mg－1)
微量还原型谷胱甘肽 GSH /
(μmol·g－1)
超氧化物歧化酶 SOD /
(U·mg－1)
肝脏指数 /(mg·g－1)
hepatic－somatic index
空白对照组 — 12. 39±3. 01Aa 25. 63±1. 98Ab 7. 40±0. 44Bb 44. 72±4. 50Aa
CCl4 模型组 — 24. 82±5. 94Bb 14. 74±1. 77Aa 5. 80±0. 70Aa 51. 70±0. 44Bc
联苯双酯阳性组 300 17. 94±3. 59ABa 25. 42±7. 25Ab 6. 85±0. 31ABb 47. 47±1. 74ABabc
F低剂量组 100 19. 26±4. 06ABa 23. 04±6. 63Aab 7. 13±0. 56ABb 49. 48±0. 61ABbc
F中剂量组 300 18. 44±3. 22ABa 23. 55±1. 48Aab 6. 90±0. 58ABb 45. 88±3. 32ABab
F高剂量组 500 16. 83±5. 06ABa 24. 59±6. 13Ab 6. 95±0. 58ABb 44. 98±0. 76ABab
注:A为空白对照组;B为 CCl4 模型组;C为联苯双酯阳性组;D为 F低剂量组;E为 F中剂量组;F为 F高剂量组
Note:A，blank control group;B，CCl4 model control group;C，bifendate positive group;D，F low－dose group;E，F median－dose group;F，F
high－dose group
图 1 光学显微镜 (400×)下 CCl4 致肝损伤的肝组织切片照片
Fig. 1 A photomicrograph of (400×)injury liver induced by CCl4 under a light microscope
3 讨论
岩藻聚糖硫酸酯存在于海藻细胞的细胞壁基质
中，添加的纤维素混合酶主要用于分解细胞壁。萱
藻中富含果胶质、蛋白质，在浸提过程中会增加浸
提液的黏稠度［14］，使岩藻聚糖硫酸酯不易溶出。
针对岩藻聚糖硫酸酯的以上特点，本研究中优化了
萱藻中岩藻聚糖硫酸酯的提取工艺，得到最优条件
为料液比 1 ∶ 18，纤维素混合酶酶加量为 2. 95%，
酶解温度为 50 ℃，pH 为 5. 5，酶解时间为 60
min。在此条件下，岩藻聚糖硫酸酯的提取率为
4. 28%，SO2－4 含量为 26. 04%。
本试验中对 CCl4 造成的急性肝损伤小鼠模型
研究结果表明，岩藻聚糖硫酸酯能够显著抑制小鼠
血清中 ALT、AST、LDH活性的升高以及肝组织中
MDA 含量、肝脏指数的升高，提高小鼠体内的
SOD活性和 GSH 含量。与模型组相比，F 中剂量
组、F高剂量组小鼠肝脏指数显著降低，说明岩藻
聚糖硫酸酯显著降低了由 CCl4 造成的急性肝损伤，
根据小鼠肝损伤后的肝组织切片也可以得出此结
论。
ALT主要存在于细胞浆中，AST主要存在于细
胞浆的线粒体中。当细胞受到损伤时，ALT首先进
入血液中，当细胞严重损伤危及线粒体时，AST也
会进入血液中。LDH 是糖酵解过程中一种重要的
酶，任何原因引起的肝细胞损伤均可使 LDH逸出，
引起血清中 LDH活力增加。MDA 是膜脂过氧化的
终产物之一，其含量的高低可以作为考察细胞受到
胁迫严重程度的指标之一，它的主要伤害是导致膜
脂过氧化，损伤生物膜结构 (主要是细胞质膜) ，
使得细胞膜结构和功能受到损伤，改变膜的通透
性，从而影响一系列生理生化反应的正常进行。与
模型组相比，F 剂量组血清中 ALT、AST、LDH 活
性均显著降低，肝脏中 MDA 含量显著降低，说明
024 大 连 海 洋 大 学 学 报 第 30卷
岩藻聚糖硫酸酯显著降低了由 CCl4 造成的小鼠急
性肝损伤中肝细胞的损伤程度，并且降低了肝细胞
膜的损伤。SOD 是一种源于生命体的活性物质，
能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。
GSH为解除毒素的特效物质，是一种由三个氨基
酸组成的小分子肽，为动物体内重要的抗氧化剂和
自由基清除剂。与模型组相比，F 剂量组肝脏中
SOD和 GSH含量的显著升高，说明岩藻聚糖硫酸
酯可能是通过增强小鼠的抗氧化能力，抑制自由基
引起的脂质过氧化，从而保护肝脏免受损伤。
综上所述，萱藻中岩藻聚糖硫酸酯具有显著的
保护肝脏作用，能显著降低由 CCl4 造成的急性肝
损伤，降低肝细胞和肝细胞膜的损伤程度，作用机
理可能是通过增强小鼠的抗氧化能力，抑制自由基
引起的脂质过氧化，从而保护肝脏免受损伤。确切
的作用机理还有待进一步探明。
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Optimization of extraction and hepatoprotective activity
of fucoidan from seaweed Scytosiphon lomentaria
WANG Qing－jun，GU Yue，YANG Ying，WANG Qiu－kuan，SONG Yue－fan，
HE Yun－hai，ＲEN Dan－dan，CONG Hai－hua
(College of Food Science and Engineering，National Ｒesearch and Development Branch Center for Seaweed Processing，Key Laboratory of Fishery Product
Processing and Utilization of Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China)
Abstract:Fucoidan as a soluble heteropolysaccharide widely found in brown seaweed was extracted and optimized
from fresh seaweed Scytosiphon lomentaria collected in Dalian coast in an orthogonal experiment by an enzymatic
method． The results showed that the optimal extraction with crude fucoidan yield of 4．28% was conducted under the
condition of the ratio of sample to water = 1 ∶ 18，the addition of combined enzyme at a rate of 2．95%，hydrolyzing
temperature of 50 ℃，pH value of 5．5，and reaction for 60 min． The protective effect of the fucoidan on acute liver
injury induced by CCl4 was studied in mice． It was found that the fucoidan from the seaweed had significant inhibi-
tion of the activities of glutamic－oxalacetic transaminase (AST)，alanine aminotransferase (ALT) ，and lactate de-
hydrogenase (LDH)and level of malondialdehyde (MDA)． The reduced glutathione (GSH)content and superox-
ide dismutase (SOD)activity were found to be significantly increased，indicating that fucoidan from Scytosiphon lo-
mentaria showed potential hepatoprotective effect．
Key words:Scytosiphon lomentaria;fucoidan;extracting technology;anti－liver damage
124第 4期 王庆钧，等:萱藻中岩藻聚糖硫酸脂的提取工艺优化及其保肝护肝作用