全 文 ：书第 43 卷 第 10 期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol． 43 No． 10
2015 年 10 月 JOURNAL OF NORTHEAST FORESTRY UNIVERSITY Oct． 2015
1)转基因生物新品种培育重大专项(2014ZX08009 － 003 －
002) ;国家自然科学基金项目(31270663)。
第一作者简介:罗朝兵，男，1991 年 10 月生，省部共建森林培育
与保护教育部重点实验室(北京林业大学) ，硕士研究生，E － mail:
13366181512@ 163． com。
通信作者:张凌云，省部共建森林培育与保护教育部重点实验室
(北京林业大学) ，教授。E － mail:lyzhang@ gmail． com。
收稿日期:2015 年 4 月 10 日。
责任编辑:潘 华。
青杄 CYP1 基因的克隆与表达1)
罗朝兵 鞠丹 刘中帅 张凌云
(省部共建森林培育与保护教育部重点实验室(北京林业大学) ，北京，100083)
摘 要 以青杄(Picea wilsonii)的 cDNA 文库为模板，根据青杄基因 PwCYP1 的 EST 序列设计引物，通过
RACE － PCR方法获取 PwCYP1 的全长 cDNA 序列。生物信息学分析表明:PwCYP1 全长 cDNA 为 962 bp，编码框
为 516 bp组成，编码一个 171 氨基酸的多肽，Protparam工具预测蛋白的分子量约为 17． 98 kDa，理论等点为 8． 34。
组织特异性试验表明，PwCYP1 在青杄花粉中的表达量最高，种子中最少。花粉萌发试验显示，PwCYP1 在青杄花
粉萌发中表达量先下降，在后期表达量重新上调。在青杄种子萌发试验中，PwCYP1 表达量先下降，在第 4 天达到
最低值后表达量被上调。同时，PwCYP1 受脱落酸(abscisic acid，ABA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)、赤霉
素(Gibberellin，GA)、干旱和盐胁迫的诱导且表达量上调，这些结果显示 PwCYP1 参与了发育及多种逆境胁迫和对
激素的响应过程。
关键词 青杄;亲环素蛋白;CYP1 基因;植物激素
分类号 S791
Cloning and Expression Analysis of CYP1 from Picea wilsonii / /Luo Chaobing，Ju Dan，Liu Zhongshuai，Zhang
Lingyun(Key Laboratory of Forest Silviculture and Conservation of the Ministry of Education，Beijing Forestry University，
Beijing 100083，P． R． China)/ / Journal of Northeast Forestry University，2015，43(10) :14 － 20．
The full length cDNA of PwCYP1 was obtained by RACE PCR method based on the full length cDNA library of Picea
wilsonii and EST fragment of PwCYP1． Bioinformatic tools were applied for predicting PwCYP1． The full length cDNA of
PwCYP1 was 962 bp and the ORF was 516 bp which encoded 171aa． The theoretical molecular weight of PwCYP1 was 17． 98 kDa
with isoeletric point of 8． 34． By the tissue-specific expression experiment，the expression level PwCYP1 in pollen was the
highest among all tissues and the expression level in seed was the lowest． By pollen germination assays，the expression of
PwCYP1 was dropped down to a nadir at the 24th hour and then increased． During seed germination，the expression of Pw-
CYP1 was decreased，peaked on the 4th day and then increased． The expression of PwCYP1 was significantly induced by
abscisic acid，methyl jasmonate，gibberellin，drought and salt stress． PwCYP1 has a potential function in development and
responding to stresses and phytohormone treatments．
Keywords Picea wilsonii;Cyclophilins protein;CYP1;Phytohormone
亲环素是一类能与环孢霉素特异结合的蛋白家
族，广泛存在于生物体中，具有肽基脯氨酸顺反异构
酶活性，参与蛋白的修饰、折叠等过程［1］。早在
1984 年，亲环素 A 就已经在生物体中发现并纯
化［2］，且已证明其在动物体内病毒感染进程起到重
要的调节作用［3］。近年来在植物体内也发现亲环
素的存在。植物体亲环素基因具有一般亲环素的功
能外，还参与植物生长发育、光合作用及胁迫应答等
过程。例如，有研究表明拟南芥 CYP38 在光系统 II
(PSII)复合体的装配过程和维持其稳定性起到重要
的作用，突变体植株矮小且对高光超敏，植物因 PSII
受损而无法正常合成光和产物，进而影响植株的生
长发育［4］;拟南芥 CYP71 则通过与组蛋白 H3 互作，
且参与 H3K27 的甲基化进程，cyp71 突变植株发育
不正常，出现顶端分生组织发育受阻，根系生长减缓
等［5］;拟南芥 CYP59 是具有多结构域的亲环蛋白，
能与 RNA聚合酶 II 最大亚基的 C 端互作，进而参
与转录的进程［6］。目前，Trivedi［7］等鉴定了 35 个拟
南芥亲环素基因，28 个水稻亲环素基因，并发现其
在多种逆境条件下响应。越来越多的证据表明亲环
素蛋白在植物的生长发育及形态建成、逆境生理、
mRNA进程、蛋白降解与信号转导中起到重要作用，
但人们对亲环素的功能依然知之甚少，且目前研究
材料仅限于模式植物和部分作物，关于木本植物中
亲环素特性及功能尚未见报道。
青杄(Picea wilsonii． Mast)属于松科(Pinaceae)
云杉属(Picea)植物，是一种耐寒冷、耐旱的多年生
木本针叶植物，广泛分布于亚热带和温带地区，是我
国重要的经济林植物［8］。本研究从青杄中克隆得
到一个 CYP 基因(命名为 PwCYP1) ，通过 RACE
PCR得到其全长 cDNA序列。利用 qRT － PCR等技
术分析了其在不同组织及发育时期的表达量及对各
种逆境的响应。本研究将对 CYP 基因家族的功能
研究、特别是其生殖生长的机制研究提供理论基础，
也为筛选优质林木抗性基因提供依据。
DOI:10.13759/j.cnki.dlxb.20150717.017
1 材料与方法
1． 1 试材与试剂
多年生青杄(Picea wilsonii)种子和花粉均采集
于中国科学院北京植物园，组织特异性表达试验使
用 3a 苗龄青杄幼苗。青杄 cDNA 文库由英潍捷基
公司利用 Gateway技术构建完成［9 － 10］。激素和逆境
处理试验使用 8 周苗龄青杄幼苗。青杄幼苗培养于
25 ℃室温，空气湿度 50%，光周期为 16 h 光照，8 h
黑暗的温室，培养基质为 V(营养土)∶ V(蛭石)=1∶
1混合，每周使用自来水充分浇灌 1 次。植物材料
经处理后液氮速冻于 － 80 ℃保存备用。
青杄 cDNA 文库载体为 pDONR222，由 Invitro-
gen公司提供。克隆载体为 pEASY － T1，购买自
Transgene公司。RNA 提取试剂盒(TRI pure Rea-
gent)购买于 AidLab公司，PCR Taq Mix、DNA Maker
(DL2000，DL15000)、荧光定量 PCR 试剂盒(SYBR
Green SuperReal Premix)购买于天根公司，反转录试
剂盒(Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)
购买于 Fermentas 公司。所用激素购买于 Sigma 公
司。其他试剂购买于 AMRESCO公司。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 RACE PCR获取目的基因 PwCYP1 的全长
利用青杄 cDNA 文库为模板，根据 PwCYP1 的
EST序列与 pDONR222 载体的序列设计引物，进行
RACE PCR。使用引物 5 － race － F 与 5 － race － R
扩增 5’方向序列，使用 3 － race － F 与 3 － race － R
扩增出 3’方向的序列。PCR 产物经琼脂糖凝胶回
收、连接 pEASY － T1、测序后获得 PwCYP1 的末端
序列，与 EST 序列拼接后获得 PwCYP1 的全长 cD-
NA序列。设计引物 CYP － F 与 CYP － R，经过 PCR
后得到开放阅读框完整的核酸序列，连接到 pEASY
－T1上，获得 PwCYP1单克隆。所用到的引物见表 1。
表 1 PwCYP1 克隆及组织表达分析所需要的引物
引物名称 核酸序列(5’－ 3’)
5 － race － F CAGTCTTAAGCTCGGGCCCCA
5 － race － R GCCTTCGAGTCCTTGCACAGCG
3 － race － F CGGTTCGACAACTACGGGAAGG
3 － race － R CTGCCAGGAAACAGCTATGAC
CYP － F ATGCCGAACCCCAAGGTTTAC
CYP － R GCTGACCGCAGTCAGCAATC
CYP － RT － F CTTTGAGATGACCGTCGGGGGC
CYP － RT － R TTTCCCGACGCCAATCTCACC
EF － 1α － F AACTGGAGAAGGAACCCAAG
EF － 1α － R AACGACCCAATGGAGGATAC
1． 2． 2 生物信息学分析
根据 PwCYP1 的全长序列，利用 DNAMAN推导
出 PwCYP1 的编码框确定其蛋白氨基酸的序列，蛋
白多序列比对运用 clustalx 软件和 Espript(http:/ /
espript． ibcp． fr /ESPript /ESPript /) ，系统树的构建利
用 MEGA5 软件，构树方法为邻位相连法(Neighbor
－ joining) ，bootstap 检测为 1 000 次。利用 Expasy
(www． expasy． org)中的 Compute pI /Mw 工具来计算
蛋白的理论等电点与分子量;利用 ProtScale 工具
(http:/ /web． expasy． org /protscale /)进行疏水性分
析;利用 ScanProsite(http:/ /prosite． expasy． org /)对
目的基因的结构域进行预测;利用 GOR4(http:/ /
npsa － pbil． ibcp． fr /cgi － bin /npsa_automat． pl?page
= npsa_gor4． html)进行蛋白的二级结构预测;利用
SWISS － MODLE(http:/ / swissmodel． expasy． org /)进
行蛋白的三级结构预测。
1． 2． 3 组织特异表达试验
用于试验的 3年生青杄的根、茎、针叶及青杄种子
及花粉总RNA的提取利用AidLab公司的植物RNA提
取试剂盒。RNA提取后经过电泳和分光光度法检测均
达到要求，运用 Fermentas公司的反转录试剂盒。均一
化浓度之后在 StepOnePlus Real Time RT －PCR仪器上
进行 qRT － PCR 来检测基因在不同组织的相对表达
量，所用特异引物为 CYP －RT － F与 CYP － RT － R，内
参基因为青杄延伸因子蛋白 EF －1α［11］，引物为 EF －
1α －F与 EF －1α －R(表 1)。试验进行 3次重复。
1．2．4 逆境与激素响应试验
逆境与激素响应试验参考［12 － 13］方法，并将处理
的激素处理时间和浓度加以调整。具体处理方法如
下:将 8周苗龄的青杄幼苗根浸入激素溶液分别处理
3、6 和 12 h，以水为对照。试验中使用的激素包括
ABA、吲哚 － 3 －乙酸(indole － 3 － acetic acid，IAA)、
GA、MeJA、水杨酸(Salicylic Acid，SA)和油菜素内酯
(brassinolide，BR) ，浓度均为 100 nmol·L －1。干旱试
验中，将 8周苗龄的青杄幼苗置于温室中无水培养 4
周，对照组正常培养;盐胁迫试验中，实验组每天分别
喷施 5 mL 2%、4%、6%的 NaCl溶液，处理 4周，对照
组用清水处理。将 8周苗龄的青杄幼苗放于清水中，
分别放置于 45、4 ℃环境中，对照组置于室温条件，分
别处理 0、0． 5、1、3、6、12 h后，取样后液氮速冻置于 －
80 ℃备用。机械损伤响应试验中，用镊子将 8周苗龄
青杄幼苗的叶片损伤后，分别于 0，0． 5，1，2，3 h取样，
对照组正常培养。过氧化氢(H2O2)响应试验中，将 8
周苗龄青杄幼苗放置于 5% H2O2 溶液中，分别于 0，
1，3，6和 12 h 取样。分别提取青杄幼苗和各组织总
RNA后进行反转录、qRT － PCR 等试验检测各组织
PwCYP1的表达量变化。试验进行 3次重复。
1． 2． 5 种子萌发试验
种子萌发试验采用水培法［14］。将吸水滤纸铺
51第 10 期 罗朝兵，等:青杄 CYP1 基因的克隆与表达
在培养皿中，将春化 1 个月的青杄种子分散放入湿
润的滤纸上培养，保持滤纸湿润，在室温条件(25
℃)下进行萌发试验。将培养皿置于 25 ℃光照培养
箱中，光周期为 16 h光照 /8 h 黑暗，培养 12 d，分别
在培养 0、2、4、6、8、10、12 d 时采样，液氮速冻后置
于 － 80 ℃保存，用于 PwCYP1 基因在种子不同萌发
时期表达量分析。所有试验进行 3 次重复。
1． 2． 6 花粉萌发试验
花粉萌发试验参照［11］方法:将保存于 －80 ℃的青
杄花粉取出，放在 －20 ℃中 24 h，再放于 4 ℃中 2 h以
复苏其活力后进行萌发试验。花粉的液体培养基由
12%蔗糖、0． 01%硼酸、0． 03%硝酸钙与 5 mmol·L －1柠
檬酸 －磷酸缓冲液组成(pH =5． 8)。取花粉置于培养
基中 200 r /min，28 ℃摇床中培养，分别在培养 0、2、6、
12、18、24、30、36 h后取样，液氮速冻置于 －80 ℃保存，
用于检测 PwCYP1表达量。进行 3次重复试验。
1． 2． 7 缺素处理试验
将正常生长条件下的 3 年生青杄幼苗移至不含
有机物料的土壤中，正常浇水 4 周，直到青杄幼苗严
重枯萎，顶芽不能继续生长。对照植株正常培养。提
取 RNA，检测 PwCYP1表达量。进行 3次重复试验。
2 结果与分析
2． 1 PwCYP1 的 cDNA克隆
利用青杄 cDNA文库为模板，根据 PwCYP1(登
录号为 KT210442)的 EST序列与 pDONR222载体的
序列设计引物，进行 RACE PCR。PwCYP1 全长 cD-
NA为 962 bp，编码框为 516 bp 组成，编码一个 171
氨基酸的多肽，Protparam工具预测蛋白的分子量约
为 17． 98 kDa，理论等点为 8． 34。分子式为 C799H1248
N216O238S9，甘氨酸(Gly)量最多为 15． 8%，缬氨酸
(Val)为 11． 1%，赖氨酸量为 7． 6%。蛋白不稳定指
数为 15． 71，表明蛋白比较稳定。
2． 2 多序列比对及系统发育树分析
运用 NCBI的 BLAST工具检索 PwCYP1 的同源
基因，发现绿豆(Vigna radiate)、陆地棉(Gossypium
hirsutum)、火炬松(Pinus taeda)、蓖麻(Ricinus com-
munis)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)等物种中的
同源基因，利用 ClustalX 软件对 PwCYP1 及其同源
基因进行多序列比对，结合软件 Mega5． 0 构建系统
发育树，结果发现:火炬松(Pinus taeda)的一个基因
(登录号 EF532602)与 PwCYP1 高度同源，被归为一
簇(图 1)。多序列比对结果发现，CYP 蛋白在不同
物种间有非常高的相似性(图 2)。
其中 VrCYP1 登录号为 BAB82452;GhCYP1 登录号为 GQ292530;PtC-
YP1 登录号为 EF532602;RcCYP1 登录号为 AJ245940;AtCYP19 － 1
登录号为 NP_179251。
图 1 青杄 PwCYP1 进化树分析
多序列比对中的保守序列分别标记为黑色(相似性 = 100%) ，灰色(相似性 ＞ 75%) ，白色(相似性 ＞ 50%)。
图 2 不同物种 CYP蛋白多序列比对
61 东 北 林 业 大 学 学 报 第 43 卷
2． 3 二级结构和三级结构预测
运用 GOR4 工具预测 PwCYP1 的二级结构，结
果发现蛋白主要有 α －螺旋(6． 43%)、延伸链结构
(33． 33%)与无规则卷曲(60． 23%)组成。运用
SWISS － MODEL工具预测蛋白的三级结构，结果如
图 3，可以预测为球状蛋白，疏水位点与亲水位点在
蛋白表面均匀分布。
图 3 PwCYP1 二级结构和三级结构
2． 4 PwCYP1 的表达分析
2． 4． 1 PwCYP1 的组织表达特异性分析
通过半定量 RT － PCR 与 qRT － PCR 试验检测
PwCYP1 在青杄各组织的表达模式，结果发现 PwC-
YP1 在青杄的各组织中均有表达，但在花粉中表达
量最高(表 2)。
表 2 PwCYP1 在青杄各组中的相对表达量
植物器官 PwCYP1 平均 Ct 值 β － actin平均 Ct 值 △Ct △△Ct 2 －△△Ct
根 26． 63 ± 0． 11 21． 56 ± 0． 09 5． 07 ± 0． 06 0 1． 00
茎 27． 03 ± 0． 05 21． 97 ± 0． 15 5． 06 ± 0． 04 －(0． 01 ± 0) 1． 01 ± 0． 09
叶 26． 79 ± 0． 07 21． 73 ± 0． 18 5． 06 ± 0． 08 －(0． 01 ± 0) 1． 01 ± 0． 07
花粉 27． 88 ± 0． 03 23． 99 ± 0． 23 3． 89 ± 0． 02 －(2． 18 ± 0． 09) 4． 53 ± 0． 12
种子 26． 14 ± 0． 06 20． 04 ± 0． 09 6． 10 ± 0． 03 1． 03 ± 0． 04 0． 49 ± 0． 05
注:表中数据为平均值 ±标准差。
2． 4． 2 PwCYP1 在青杄种子萌发过程中的表达
通过 qRT － PCR检测 PwCYP1 在青杄种子萌发
过程中表达模式，结果发现 PwCYP1 在青杄种子萌
发过程中表达量呈下降趋势，在第 4 天的时候降到
最低值后表达量略有上升，并在第 6 天之后表达量
维持在相对稳定数值(表 3)。
表 3 PwCYP1 在种子萌发不同时期的相对表达量
萌发时间 /d PwCYP1 平均 Ct 值 β － actin平均 Ct 值 △Ct △△Ct 2 －△△Ct
0(对照组) 27． 55 ± 0． 02 24． 12 ± 0． 01 3． 43 ± 0． 05 0 1． 00
2 27． 54 ± 0． 03 23． 61 ± 0． 08 3． 92 ± 0． 02 0． 49 ± 0． 03 0． 71 ± 0． 09
4 27． 36 ± 0． 08 22． 24 ± 0． 12 5． 12 ± 0． 05 1． 69 ± 0． 06 0． 31 ± 0． 02
6 27． 50 ± 0． 02 22． 99 ± 0． 03 4． 51 ± 0． 07 1． 08 ± 0． 12 0． 47 ± 0． 08
8 27． 47 ± 0． 06 22． 74 ± 0． 05 4． 73 ± 0． 03 1． 30 ± 0． 06 0． 41 ± 0． 03
10 27． 44 ± 0． 02 22． 73 ± 0． 08 4． 72 ± 0． 03 1． 29 ± 0． 09 0． 41 ± 0． 04
12 27． 51 ± 0． 06 23． 23 ± 0． 11 4． 28 ± 0． 09 0． 86 ± 0． 11 0． 56 ± 0． 03
注:表中数据为平均值 ±标准差。
2． 4． 3 PwCYP1 花粉不同发育时期的表达分析
在组织特异表达试验中已发现 PwCYP1 在花粉
中的表达量最高，因此利用 qRT － PCR方法检测在花
粉萌发后不同时期的相对表达量，结果发现青杄花粉
在萌发的 0 ～24 h 阶段 PwCYP1 表达量逐渐减低，在
24 h达到最低值后被上调至相对稳定值(表 4)。
2． 4． 4 PwCYP1 对逆境的响应
分别提取干旱处理 4 周后青杄幼苗的根、茎、针
叶 RNA反转录成 cDNA进行 qRT － PCR，结果表明，
经过干旱处理后根中 PwCYP1 的表达量较对照上升
4 倍左右，茎中 PwCYP1 的表达量上升 2． 5 倍，针叶
中表达量变化不明显(表 5) ;经过 2% NaCl 处理后
71第 10 期 罗朝兵，等:青杄 CYP1 基因的克隆与表达
根中 PwCYP1 的表达量上升 70 倍左右，茎中 PwC-
YP1 的表达量上升 100 倍，针叶中表达量上升 7 倍
左右，但随着 NaCl 浓度的上升，PwCYP1 的表达量
呈下降趋势(表 5) ;经过 45 ℃处理后 PwCYP1 的表
达量在 0． 5 ～ 1 h内先上升后下降，1 ～3 h内又上升，3
～12 h呈逐渐下降的趋势(表 6) ;机械损伤处理后
PwCYP1 的表达量先上升，1 h 上升至 2． 5 倍达到最
大值后表达量被下调至一稳定值(表 7) ;H2O2 处理
后，PwCYP1 的表达量在 0 ～ 1 h 内上升，1 ～ 12 h 内
下降，但变化不明显(表 8) ;冷(4 ℃)处理后 3 h，
PwCYP1 的表达量被抑制降低到 0． 4 倍，3 h 后表达
量被上调(表 9)。
表 4 PwCYP1 在花粉不同时期的相对表达量
萌发时间 /h PwCYP1 平均 Ct 值 β － actin平均 Ct 值 △Ct △△Ct 2 －△△Ct
0(对照组) 27． 55 ± 0． 02 24． 12 ± 0． 01 3． 43 ± 0． 05 0 1． 00
2 27． 38 ± 0． 03 23． 45 ± 0． 08 3． 92 ± 0． 02 0． 49 ± 0． 03 0． 71 ± 0． 09
6 27． 44 ± 0． 02 22． 73 ± 0． 08 4． 72 ± 0． 03 1． 29 ± 0． 09 0． 41 ± 0． 04
12 27． 34 ± 0． 02 22． 83 ± 0． 03 4． 51 ± 0． 07 1． 08 ± 0． 12 0． 47 ± 0． 08
18 27． 47 ± 0． 06 22． 74 ± 0． 05 4． 73 ± 0． 03 1． 30 ± 0． 06 0． 41 ± 0． 03
24 27． 48 ± 0． 08 22． 36 ± 0． 12 5． 12 ± 0． 05 1． 69 ± 0． 06 0． 31 ± 0． 02
30 27． 51 ± 0． 06 23． 23 ± 0． 11 4． 28 ± 0． 09 0． 86 ± 0． 11 0． 56 ± 0． 03
36 27． 79 ± 0． 05 23． 45 ± 0． 09 4． 34 ± 0． 11 0． 91 ± 0． 06 0． 53 ± 0． 11
注:表中数据为平均值 ±标准差。
表 5 PwCYP1 在盐、干旱处理下的表达模式
表达模式值
根
对照 干旱处理 盐处理
茎
对照 干旱处理 盐处理
叶
对照 干旱处理 叶盐处理
PwCYP1 平均 C t值 32． 56 ± 0． 11 30． 76 ± 0． 08 26． 65 ± 0． 03 31． 92 ± 0． 09 30． 92 ± 0． 23 27． 3 ± 0． 13 31． 38 ± 0． 08 31． 42 ± 0． 02 29． 91 ± 0． 12
β － actin平均 C t值 21． 91 ± 0． 13 21． 44 ± 0． 04 21． 33 ± 0． 09 21． 16 ± 0． 07 21． 57 ± 0． 04 22． 33 ± 0． 06 21． 68 ± 0． 13 20． 07 ± 0． 35 21． 15 ± 0． 22
△C t 11． 66 ± 0． 12 9． 32 ± 0． 06 5． 32 ± 0． 06 10． 76 ± 0． 08 9． 35 ± 0． 13 4． 97 ± 0． 09 9． 70 ± 0． 11 9． 35 ± 0． 18 8． 76 ± 0． 17
△△C t 0 －(2． 14 ± 0． 03)－(6． 34 ± 0． 03)－(0． 90 ± 0． 11)－(2． 31 ± 0． 05)－(6． 69 ± 0． 03)－(1． 96 ± 0． 13)－(2． 31 ± 0． 05)－(2． 9 ± 0． 02)
2 －△△Ct 1． 00 4． 44 ± 0． 57 81． 01 ± 0． 91 1． 87 ± 0． 13 4． 94 ± 0． 34 103． 26 ± 9． 35 3． 89 ± 0． 56 4． 94 ± 0． 55 7． 46 ± 1． 23
注:表中数据为平均值 ±标准差。
表 6 PwCYP1 在热激(45 ℃)处理下的表达模式
处理时间 /h PwCYP1 平均 Ct 值 β － actin平均 Ct 值 △Ct △△Ct 2 －△△Ct
0(对照) 24． 76 ± 0． 07 19． 29 ± 0． 04 5． 47 ± 0． 06 0 1． 00
0． 5 24． 47 ± 0． 09 19． 88 ± 0． 03 4． 59 ± 0． 05 －(0． 88 ± 0． 03) 1． 84 ± 0． 09
1． 0 27． 52 ± 0． 00 20． 31 ± 0． 07 7． 21 ± 0． 04 1． 74 ± 0． 09 0． 30 ± 0． 01
3． 0 25． 73 ± 0． 03 21． 16 ± 0． 07 4． 57 ± 0． 05 －(0． 90 ± 0． 11) 1． 87 ± 0． 08
6． 0 25． 27 ± 0． 07 19． 85 ± 0． 02 5． 42 ± 0． 04 －(0． 05 ± 0． 08) 1． 03 ± 0． 11
12． 0 24． 55 ± 0． 04 18． 67 ± 0． 05 5． 87 ± 0． 04 0． 40 ± 0． 05 0． 76 ± 0． 09
注:表中数据为平均值 ±标准差。
表 7 PwCYP1 在机械损伤处理下的表达模式
处理时间 /h PwCYP1 平均 Ct 值 β － actin平均 Ct 值 △Ct △△Ct 2 －△△Ct
0(对照) 25． 57 ± 0． 03 21． 91 ± 0． 05 3． 66 ± 0． 04 0 1． 00
0． 5 26． 22 ± 0． 02 22． 84 ± 0． 03 3． 38 ± 0． 04 －(0． 28 ± 0． 03) 1． 21 ± 0． 11
1． 0 27． 49 ± 0． 11 24． 88 ± 0． 06 2． 61 ± 0． 08 －(1． 05 ± 0． 04) 2． 07 ± 0． 15
2． 0 24． 67 ± 0． 01 20． 77 ± 0． 03 3． 90 ± 0． 02 0． 24 ± 0． 02 0． 85 ± 0． 09
3． 0 26． 17 ± 0． 07 22． 55 ± 0． 04 3． 62 ± 0． 04 －(0． 04 ± 0． 09) 1． 02 ± 0． 12
注:表中数据为平均值 ±标准差。
表 8 PwCYP1 在 H2O2 处理下的表达模式
处理时间 /h PwCYP1 平均 Ct 值 β － actin平均 Ct 值 △Ct △△Ct 2 －△△Ct
0(对照) 24． 90 ± 0． 03 23． 36 ± 0． 05 1． 54 ± 0． 04 0 1． 00
1 25． 56 ± 0． 02 24． 68 ± 0． 06 0． 87 ± 0． 04 －(0． 67 ± 0． 09) 1． 59 ± 0． 06
3 24． 88 ± 0． 11 23． 69 ± 0． 03 1． 19 ± 0． 08 －(0． 35 ± 0． 12) 1． 28 ± 0． 12
6 25． 56 ± 0． 01 24． 25 ± 0． 06 1． 31 ± 0． 02 －(0． 23 ± 0． 06) 1． 17 ± 0． 11
12 24． 32 ± 0． 07 22． 78 ± 0． 13 1． 55 ± 0． 09 0． 01 ± 0． 07 0． 10 ± 0． 02
注:表中数据为平均值 ±标准差。
81 东 北 林 业 大 学 学 报 第 43 卷
表 9 PwCYP1 在冷(4 ℃)处理下的表达模式
处理时间 /h PwCYP1 平均 Ct 值 β － actin平均 Ct 值 △Ct △△Ct 2 －△△Ct
0(对照) 24． 47 ± 0． 10 20． 91 ± 0． 01 3． 70 ± 0． 06 0 1． 00
1 25． 33 ± 0． 02 21． 83 ± 0． 02 3． 57 ± 0． 04 －(0． 03 ± 0． 00) 1． 02 ± 0． 02
3 23． 68 ± 0． 15 19． 54 ± 0． 13 4． 76 ± 0． 14 1． 15 ± 0． 11 0． 45 ± 0． 15
6 24． 52 ± 0． 04 20． 46 ± 0． 02 4． 08 ± 0． 03 0． 48 ± 0． 05 0． 72 ± 0． 08
12 25． 32 ± 0． 02 21． 39 ± 0． 03 3． 83 ± 0． 02 0． 22 ± 0． 03 0． 86 ± 0． 11
注:表中数据为平均值 ±标准差。
2． 4． 5 PwCYP1 对缺素以及不同外源激素处理的响应
经过缺素处理 4 周后的 3 年生青杄幼苗，分别
提取根、茎、叶 RNA，反转录成 cDNA 进行 qRT －
PCR。结果表明缺素处理后 PwCYP1 在根、茎、针叶
中的表达量均下降，且在根中表达量下降 7 倍左右，
茎和针叶中均下降 2 倍(表 10)。不同外源激素处
理结果显示，ABA，IAA，MeJA，SA 处理 3 h 后 PwC-
YP1 的表达量上升到最大值，而在 3 ～ 12 h 内，PwC-
YP1 的表达量被抑制;GA处理后前期 PwCYP1 的表
达量变化不明显，到 12 h时大幅度提高;BR 处理后
6 h后 PwCYP1 的表达量升高，到 12 h时 PwCYP1 的
表达量重新下调(表 11)。
表 10 PwCYP1 在缺素处理下的表达模式
表达模式值
根
对照 缺素处理
茎
对照 缺素处理
叶
对照 缺素处理
PwCYP1 平均 Ct 值 27． 29 ± 0． 02 30． 50 ± 0． 13 28． 42 ± 0． 05 29． 71 ± 0． 04 27． 74 ± 0． 09 28． 72 ± 0． 14
β － actin平均 Ct 值 24． 19 ± 0． 01 24． 56 ± 0． 05 24． 38 ± 0． 21 24． 77 ± 0． 35 24． 35 ± 0． 07 24． 66 ± 0． 03
△Ct 3． 10 ± 0． 05 5． 94 ± 0． 09 4． 04 ± 0． 13 4． 94 ± 0． 19 3． 39 ± 0． 08 4． 06 ± 0． 09
△△Ct 0 2． 84 ± 0． 08 0． 94 ± 0． 03 1． 84 ± 0． 04 0． 29 ± 0． 01 0． 96 ± 0． 03
2 －△△Ct 1． 00 0． 14 ± 0． 02 0． 52 ± 0． 13 0． 27 ± 0． 05 0． 82 ± 0． 25 0． 49 ± 0． 12
注:表中数据为平均值 ±标准差。
表 11 PwCYP1 在激素处理下的表达模式
处理时间 /h 激素 PwCYP1 平均 Ct 值 β － actin平均 Ct 值 △Ct △△Ct 2 －△△Ct
3 CK 25． 91 ± 0． 05 21． 61 ± 0． 15 4． 30 ± 0． 10 0 1． 00
ABA 25． 92 ± 0． 12 25． 21 ± 0． 21 0． 70 ± 0． 16 －(3． 60 ± 0． 03) 12． 1 ± 0． 13
JA 25． 90 ± 0． 09 25． 77 ± 0． 09 0． 13 ± 0． 09 －(4． 17 ± 0． 05) 18． 00 ± 0． 11
IAA 25． 95 ± 0． 24 25． 72 ± 0． 04 0． 22 ± 0． 04 －(4． 08 ± 0． 02) 16． 90 ± 0． 15
GA 25． 93 ± 0． 21 23． 56 ± 0． 13 2． 37 ± 0． 03 －(1． 93 ± 0． 06) 3． 82 ± 0． 08
SA 25． 95 ± 0． 08 24． 27 ± 0． 09 1． 68 ± 0． 06 －(2． 63 ± 0． 02) 6． 17 ± 0． 11
BR 25． 90 ± 0． 33 22． 37 ± 0． 11 3． 53 ± 0． 02 －(0． 77 ± 0． 08) 1． 71 ± 0． 05
6 CK 28． 06 ± 0． 25 21． 96 ± 0． 09 6． 10 ± 0． 15 0 1． 00
ABA 26． 34 ± 0． 18 22． 46 ± 0． 22 3． 88 ± 0． 10 －(2． 22 ± 0． 04) 4． 66 ± 0． 10
JA 25． 56 ± 0． 05 22． 02 ± 0． 15 4． 54 ± 0． 06 －(1． 56 ± 0． 03) 2． 95 ± 0． 08
IAA 27． 19 ± 0． 33 23． 54 ± 0． 05 3． 65 ± 0． 09 －(2． 45 ± 0． 05) 5． 45 ± 0． 08
GA 26． 23 ± 0． 08 22． 36 ± 0． 05 3． 87 ± 0． 16 －(2． 23 ± 0． 02) 4． 68 ± 0． 12
SA 27． 50 ± 0． 12 23． 63 ± 0． 04 3． 87 ± 0． 17 －(2． 23 ± 0． 06) 4． 68 ± 0． 07
BR 26． 71 ± 0． 03 22． 23 ± 0． 32 4． 48 ± 0． 04 －(1． 62 ± 0． 08) 3． 08 ± 0． 09
12 CK 26． 91 ± 0． 14 20． 33 ± 0． 09 6． 58 ± 0． 12 0 1． 00
ABA 27． 67 ± 0． 10 23． 32 ± 0． 18 4． 35 ± 0． 14 －(2． 23 ± 0． 04) 4． 69 ± 0． 11
JA 27． 52 ± 0． 06 21． 34 ± 0． 16 6． 18 ± 0． 11 －(0． 40 ± 0． 01) 1． 32 ± 0． 05
IAA 27． 27 ± 0． 15 19． 56 ± 0． 21 7． 71 ± 0． 18 1． 13 ± 0． 11 0． 46 ± 0． 03
GA 27． 68 ± 0． 25 23． 81 ± 0． 07 3． 87 ± 0． 16 －(2． 71 ± 0． 06) 6． 56 ± 0． 23
SA 27． 60 ± 0． 03 22． 35 ± 0． 05 5． 25 ± 0． 07 －(1． 33 ± 0． 04) 2． 51 ± 0． 15
BR 27． 66 ± 0． 08 21． 57 ± 0． 22 6． 10 ± 0． 14 －(0． 48 ± 0． 05) 1． 40 ± 0． 08
注:表中数据为平均值 ±标准差。
3 结论与讨论
本研究从青杄的 cDNA文库中克隆得到亲环素
基因 PwCYP1，经过生物信息学分析发现 PwCYP1
编码了一个包含 171 个氨基酸的蛋白，分子量约为
17． 98 KDa，包含多个 α －螺旋。多序列比对以及构
建系统发育树结果显示 PwCYP1 和 PtCYP1 聚为一
簇。由于青杄(Picea wilsonii)和火炬松(Pinus tae-
da)都属于松科，亲缘关系相对比较近，且两者在形
态学上也具有非常高的相似性，推测两物种在进化
上有相同的祖先。
以为的研究中证实植物类亲环素在植物生物
学、胁迫应答等过程发挥作用。例如，Sekhar［15］等
在木豆中分离得到一个亲环素基因 CcCYP，转基因
过表达于拟南芥中发现能增强多种逆境胁迫的抵御
能力;Kim［16］等研究发现过表达水稻亲环素基因
OsCYP20 － 2 于拟南芥和烟草中增强了转基因植株
抵抗非生物逆境胁迫的能力。本研究中，PwCYP1
91第 10 期 罗朝兵，等:青杄 CYP1 基因的克隆与表达
在干旱和 NaCl处理后，根和茎中表达量均大幅度升
高，尤其是 2%的 NaCl处理后，PwCYP1 在根和茎表
达量分别上升 70 倍和 100 倍。显示 PwCYP1 参与
了青杄干旱和盐胁迫应答。不同激素处理后 PwC-
YP1 表达量也表现出不同程度的上调。其中，ABA
和 MeJA处理 3 h后 PwCYP1 的表达量达到最高，机
械损伤 1 h 后表达量达到最大值，表明 PwCYP1 能
响应 ABA 并参与了 MeJA 诱导的机械损伤应答。
Berardini等发现拟南芥 CYP40 不但对的营养生长
有重要的调控作用［17］，同时能与热激蛋白 HSP90
互作［18］。在本试验中，我们对青杄幼苗进行 45 ℃
处理后，PwCYP1 表达量发生明显变化，预示着 Pw-
CYP1 可能也参与了热激反应。
已有研究表明亲环素蛋白在植物各个器官都有
表达，并发挥着重要的作用。Lippuner［20］等在拟南
芥中发现 ROC1 与 ROC4 编码两个亲环素蛋白，其
中 ROC1 在拟南芥各个器官都有表达，而 ROC4 只
在能进行光和作用器官表达;Romano［21］等在 2004
年在拟南芥中已发现 29 种亲环素蛋白，普遍在各个
组织和器官中表达，参与了光合作用［22］、生物胁迫
响应［23］、花粉萌发［24］等一系列生理过程。Saito［25］
等发现 AtCYP1 主要在维管束与花中表达，AtCYP2
主要在幼叶中表达，显示了 CYP基因家族功能上的
多样性。本研究中，在青杄组织特异表达实验中，
PwCYP1 在各个组织均有表达，但在成熟花粉中表
达量最高，进一步试验证实在花粉萌发过程中 PwC-
YP1 的表达量逐步下降，在花粉管生长后期其表达
量维持在一定水平。相对于花粉中，虽然种子中表
达量不高，但在种子萌发过程中 PwCYP1 表达量呈
现同花粉萌发过程中相似的变化趋势，这些结果表
明 PwCYP1 参与了青杄花粉管生长和种子萌发过
程，随着花粉和种子萌发其表达量下降。
综上所述，青杄 PwCYP1 可能参与了青杄种子
萌发、花粉萌发等多种生理过程，并参与 ABA，Me-
JA，IAA等激素应答途径，是一个具有抗旱、抗盐、抗
热等潜在能力的抗逆基因。今后可以将该基因转入
模式植物拟南芥或其他经济植物，进一步研究其抗
逆功能，并探索其在植物中的抗逆机制。本研究将
为植物亲环素蛋白的进一步功能研究奠定基础，也
为未来筛选优良林木基因提供理论依据。
参 考 文 献
［1］ Stamnes M A，Rutherford S L，Zuker C S． Cyclophilins:a new
family of proteins involved in intracellular folding［J］． Trends in
Cell Biology，1992，2(9) :272 － 276．
［2］ Handschumacher R E，Harding M W，Rice J，et al． Cyclophilin:
a specific cytosolic binding 3 protein for cyclosporin A［J］． Sci-
ence，1984，226:544 － 547．
［3］ Zhou D，Mei Q，Li J，et al． Cyclophilin A and viral infections
［J］． Biochemical and Biophysical Research Communications，
2012，424(4) :647 － 650．
［4］ Fu A，He Z，Cho H S，et al． A chloroplast cyclophilin functions
in the assembly and maintenance of photosystem II in Arabidopsis
thaliana［J］． Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America，2007，104(40) :15947 － 15952．
［5］ Li H，He Z，Lu G，et al． A WD40 domain cyclophilin interacts
with histone H3 and functions in gene repression and organogenesis
in Arabidopsis［J］． The Plant Cell，2007，19(8) :2403 － 2416．
［6］ Gullerova M，Barta A，Lorkovic Z J． AtCyp59 is a multidomain
cyclophilin from Arabidopsis thaliana that interacts with SR pro-
teins and the C-terminal domain of the RNA polymerase II［J］．
RNA，2006，12(4) :631 － 643．
［7］ Trivedi D，Yadav S，Vaid N，et al． Genome wide analysis of Cy-
clophilin gene family from rice and Arabidopsis and its comparison
with yeast［J］． Plant Signaling and Behavior，2012，7(12) :1653
－ 1666．
［8］ 魏强，凌雪，张广忠，等．甘肃兴隆山主要森林类型凋落物累积
量及持水特性［J］．应用生态学报，2011，22(10) :2589 － 2598．
［9］ 李长江，曹一博，张凌云．青杄 PSAK的克隆及生物信息学分析
［J］．生物技术，2012，22(3) :4 － 9．
［10］ 张盾，刘亚静，李长江，等．青杄均一化 cDNA文库构建及 EST
序列分析［J］．生物技术通报，2012(6) :71 － 76．
［11］ Yu Y，Li Y，Huang G，et al． PwHAP5，a CCAAT-binding tran-
scription factor，interacts with PwFKBP12 and plays a role in pol-
len tube growth orientation in Picea wilsonii［J］． Journal of Ex-
perimental Botany，2011，62(14) :4805 － 4817．
［12］ Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K． Anovelcis-acting element
in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought，
low-temperature，or high-salt stress［J］． The Plant cell，1994，6
(2) :251 － 264．
［13］ Yu Y，Zhang H，Li W，et al． Genome-wide analysis and envi-
ronmental response profiling of the FK506 － binding protein gene
family in maize(Zea mays L．) ［J］． Gene，2012，498(2) :212 －
222．
［14］ 李长江，孙帆，张通，等．青杄 PwPSAF的克隆与组织表达分析
［J］．林业科学，2013，49(10) :40 － 47．
［15］ Sekhar K，Priyanka B，Reddy V D，et al． Isolation and charac-
terization of a pigeonpea cyclophilin(CcCYP)gene，and its over-
expression in Arabidopsis confers multiple abiotic stress tolerance
［J］． Plant，Cell ＆ Environment，2010，33(8) :1324 － 1338．
［16］ Kim S K，You Y N，Park J C，et al． The rice thylakoid lumenal
cyclophilin OsCYP20 － 2 confers enhanced environmental stress
tolerance in tobacco and Arabidopsis［J］． Plant Cell Reports，
2012，31(2) :417 － 426．
［17］ Berardini T Z，Bollman K，Sun H，et al． Regulation of vegeta-
tive phase change in Arabidopsis thaliana by cyclophilin 40［J］．
Science，2001，291:2405 － 2407．
［18］ Earley K W，Poethig R S． Binding of the cyclophilin 40 ortholog
SQUINT to Hsp90 protein is required for squint function in Arabi-
dopsis［J］． The Journal of Biological Chemistry，2011，286:38184
－38189．
［19］ Smith M R，Willmann M R，Wu G，et al． Cyclophilin 40 is re-
quired for microRNA activity in Arabidopsis［J］． Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of Ameri-
ca，2009，106(13) :5424 － 5429．
［20］ Lippuner V，Chou I T，Scott S V，et al． Cloning and character-
ization of chloroplast and cytosolic forms of cyclophilin from Ara-
bidopsis thaliana［J］． The Journal of Biological Chemistry，1994，
269(11) :7863 － 7868．
［21］ Romano P G，Horton P，Gray J E． The Arabidopsis cyclophilin
gene family［J］． Plant Physiology，2004，134(4) :1268 － 1282．
［22］ Romano P G，Edvardsson A，Ruban A V，et al． Arabidopsis At-
CYP20 － 2 is a light-regulated cyclophilin-type peptidyl-prolyl
cis-trans isomerase associated with the photosynthetic membranes
［J］． Plant Physiology，2004，134(4) :1244 － 1247．
［23］ Daniel D R，Edson L F，Leonardo P B，et al． Eucalyptus ESTs
involved in mechanisms against plant pathogens and environmen-
tal stresses［J］． Summa Phytopathol，2010，36(4) :282 － 290．
［24］ Wang Y，Zhang W Z，Song L F，et al． Transcriptome analyses
show changes in gene expression to accompany pollen germination
and tube growth in Arabidopsis［J］． Plant Physiology，2008，148
(3) :1201 － 1211．
［25］ Saito T，Tadakuma K，Takahashi N，et al． Two cytosolic cyclo-
philin genes of Arabidopsis thaliana differently regulated in tempo-
ral-and organ-specific expression［J］． Bioscience，Biotechnolo-
gy，and Biochemistry，1999，63(4) :632 － 637．
02 东 北 林 业 大 学 学 报 第 43 卷