全 文 ：第 6期
文章编号: 1008－830X(2010)06－0566－06
舟山黄海葵杀虫活性多肽的初步研究
刘少华，杨 林，章 晨，王日昕，廖 智
（浙江海洋学院海洋科学学院，海洋生物资源及分子工程实验室，浙江舟山 316004）
摘 要：通过多维高效液相色谱结合动物实验，从舟山黄海葵粗毒中筛选了多种具有强杀虫活性以及低哺乳动物活性
的杀虫肽，其分子量约在 2~5 kDa之间，在 100 μg/kg体重浓度下对脊尾白虾以及黄粉虫幼虫具有强且快速的麻痹、致死活
性，对小鼠毒性较弱。上述研究结果表明舟山黄海葵是一个研究和开发杀虫肽的宝库，同时也为从舟山黄海葵毒素中进一步
筛选杀虫肽并深入研究其杀虫机理奠定了基础。
关键词：舟山黄海葵; 海葵毒素; 杀虫肽; 高效液相色谱
中图分类号：R931.77 文献标识码：A
Purification of Peptides with Insecticidal Activity from
the Venom of Sea Anemone Anthopleura xanthogrammica
LIU Shao-hua, YANG Lin, ZHANG Chen, et al
(Marine Science School, Laboratory of Marine Biological Source and Molecular Engineering,
Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316004, China)
Abstract：Here several peptide toxins exhibiting molecular weight ranging from 2-5 kDa was isolated
from the sea anemone Anthopleura xanthogrammica. Purification of the peptide was achieved by a multistep
chromatographic procedure monitoring its strong paralytic activity on ridgetail white prawn (Exopalaemon
carinicauda (Holthuis)) , mealworms(Tenebrio molitor) and mouse(Mus musculus). The paralitic or lethalic effect
of toxins on ridgetail white prawn and mealworm are very similar, also are more active on ridgetail white prawn
and mealworms than mouse. Toxicities against prawn is about 200 μg/kg. Given the close evolutionary rela－
tionship between crustaceans and insects, these peptides can be considered as insecticidal lead compounds in
the development of insecticides. It also laid the foundation for purifying more insecticidal peptide from Antho－
pleura xanthogrammica and studying its mechanism.
Key words: Anthopleura xanthogrammica; sea anemon toxin; insecticidal peptide; HPLC
节肢动物害虫分布于世界的各个角落，破坏了世界上 20%~40%的农作物[1]。我国是世界上农业生物灾
害频繁发生的国家之一。多年来，我国农业害虫的防治主要依赖化学农药，不仅造成环境污染，而且引发害
浙江海洋学院学报(自然科学版)
Journal of Zhejiang Ocean University(Natural Science)
第 29卷 第 6期
2010年 11月
Vol．29 No．6
Nov.,2010
收稿日期：2010-08-15
基金项目：浙江省科技厅面上科研农业项目(2009C32022）
作者简介：刘少华（1989-），男，浙江舟山人，研究生, 研究方向: 蛋白质结构与功能. E-mail：liushaohua080@139.com
通讯作者：廖智，博士，副教授. E-mail：liaozhi@zjou.edu.cn
浙江海洋学院学报(自然科学版) 第 29卷
虫产生抗药性和农产品农药残留超标等严重问题。此外，节肢动物害虫还能传播多种人类疾病[2]，我国同
时也是世界上自然疫源性疾病最多的国家之一。由于昆虫对现存的某些化学杀虫剂形成抗药性以及对于
开发新型无污染杀虫剂的更高要求，迫使人们分离更为高效、安全、经济及与环境相容的杀虫剂化合物。如
今世界许多国家从蛇毒、蝎毒、蜘蛛毒、海洋和植物等天然生物资源中筛分和鉴定各种有效生理活性成分，
并利用这些天然神经生物毒素构建新型的生物杀虫剂和抗病虫害植物体系。其中，海葵毒素由于其主要作
用对象为甲壳类动物因而在生物毒素来源的杀虫剂开发中受到重视。
海葵又名海菊花、海淀根，属于腔肠动物门 Coelenterata、珊瑚虫纲 Anthozoa、六放珊瑚亚纲 Hexacoral－
lia。其种类在 1 000种以上，而中国的海葵品种约占世界的 1/10。海葵主要通过刺细胞分泌毒液捕食鱼、贝
类、桡足类、甲壳类动物以及蠕虫，其毒液中富含各种毒素多肽成分，是目前生物毒素研究的重要内容。对
海葵毒素多肽的研究自 20世纪 70年代开始，目前已经从约 40 种海葵中分离到超过 300种毒素多肽分
子，根据分子量以及生物学功能的不同, 可以分为海葵溶细胞毒素(分子量约 20 kDa) 以及海葵多肽类神
经毒素( 分子量 3~7 kDa) 两大类[3]。鉴于节肢动物与甲壳动物存在进化同源性，海葵毒素多肽对昆虫也具
有毒害作用，其中有很多是对昆虫有特异杀伤作用而对哺乳动物低毒性的分子，因此，海葵毒素是一个理
想的杀虫肽存储库[4]。
舟山黄海葵 Anthopleura xanthogrammica为海葵科侧花海葵属动物，分布于我国东海沿岸以及日本沿
海等，其身体表面有很多纵行的疣突，体壁上有小孔，体内的毒丝可由小孔伸出孔外。黄海葵自古以来就作
为一种中药，具有收敛固涩、杀虫等药效。笔者通过多维色谱层析结合脊尾白虾 Exopalaemon carinicauda、
黄粉虫 Tenebrio molitor幼虫以及小鼠体内试验，从舟山黄海葵粗毒中分离纯化了 7种具有强杀虫活性和
低哺乳动物毒性的多肽分子并进行了初步鉴定，为从中筛选杀虫肽分子并深入研究其作用机理奠定了基
础。
1 材料与方法
1.1 材料
舟山黄海葵采自舟山市朱家尖海域，采集后在实验室以海水、25 ℃饲养 12 h，之后取出海葵，以去离
子水冲洗干净，迅速冷冻于-80 ℃备用。脊尾白虾购于舟山市本地菜场，黄粉虫幼虫来自本实验室保存。
1.2 海葵粗毒的提取
以反复冻融法提取海葵粗毒样品。海葵样品整体浸入 1 000 mL去离子水（含 15 mL 0.5 M EDTA,
300 μL 2 mg/mL抑肽酶），经-80 ℃冷冻 1 h后置于 4 ℃融化，待其充分融化后再次置于-80 ℃冷冻 1 h，
之后再置于 4 ℃融化。通过这种反复冻融的方法使海葵刺细胞破裂并释放其毒素，以纱布过滤去掉海葵躯
体，剩余溶液于 4 °C、20 000 ×g离心 20 min。取上清液即海葵粗毒样品，置于 4 °C保存待用。
1.3 海葵毒素的分离
采用高效液相色谱对舟山黄海葵粗毒样品进行分离纯化，所有分离步骤均在 Waters 600E高效液相
色谱仪上完成，检测器为Waters 2487紫外检测器，检测波长为 280 nm。
第一步：取粗毒样品，用 0.45 m针头过滤器过滤，上样高压分子筛柱 Sepax-100?（7.8×300 mm，Sepax
公司）采用去离子水洗脱，流速为 0.75 mL/min，收集各洗脱峰，经冷冻干燥后进行杀虫活性分析；
第二步：对上述步骤中具有杀虫活性的洗脱峰组分进行进一步反相高效液相色谱分离，反相色谱柱为
SunfireTM Prep C8（10×250 mm, Waters公司）半制备柱，洗脱液分别为含 0.1%TFA的水（A液）和乙腈（B
液），流速为 2 mL/min，洗脱梯度为 0~5% B，10 min；5%~45% B，30 min；45%~95% B，5 min。收集洗脱峰
经冷冻干燥后进行杀虫活性分析；
第三步：将第二步中具有杀虫活性的组分上样分析型反相柱 Waters SunFireTM C18 (4.6×250mm，
Waters公司)进行进一步分离，洗脱液分别为含 0.1%TFA的水（A液）和乙腈（B液），流速为 0.75 mL/min，
洗脱梯度为 0~5% B，10 min；5%~45% B，30 min；45%~95% B，5 min。收集洗脱峰冷冻干燥后进行杀虫活
性分析。
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1.4 杀虫活性检测
以脊尾白虾、黄粉虫幼虫以及小鼠为对象，上述分离纯化过程中的各洗脱峰经冷冻干燥后，称取少量
样品，溶解于 50 L无菌海水，以微量注射器注射水白虾和黄蜂虫幼虫并观察注射后动物的反应；另取健康
昆明种小鼠，通过腹腔注射方式进行毒素样品的活性测试。
1.5 毒素多肽的初步鉴定
采用 Tris-Tricine SDS-PAGE电泳试剂盒（购自北京天恩泽基因科技有限公司）进行毒素多肽的分子
量初步检测，其操作按照试剂盒说明书进行。
活性多肽的精确分子量利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）（Voyager-DETM STR
BiospectromitryTM workstation，Applied Biosystems公司）进行测定。采用线性阳离子模式；N2光源 337 nm；离
子加速电压为 20 000 V。基质为 α-氰基-4-羟基-肉桂酸（CCA，sigma公司），通过以下方式制备样品：取
1 mL 样品液加入到 9 mLCCA（含 0.1%TFA）的 50%乙腈饱和溶液，混匀后取 1 mL点样，室温干燥后测定，
并采用内标法校正。
2 结果
舟山黄海葵粗毒样品经分子筛分离后可收集 12个洗脱峰，命名为 GF1~12（图 1），经注射脊尾白虾以
及黄粉虫幼虫，发现其中 GF2以及 GF3毒性最强，在 200 μg/kg体重浓度下注射后可导致脊尾白虾以及
黄粉虫幼虫产生抽搐并迅速死亡；而同等浓度下小鼠腹腔注射后导致小鼠出现瘫软，呼吸困难等症状。
收集 GF2和 GF3号峰，合并后上样 C8半制备型反相 HPLC进一步分离，洗脱曲线如图 2所示，共收
集 12个组分，分别命名为 R1~12。所有组分经冷冻干燥后进行动物毒性测试，结果表明 R1，R3，R5~10以
及 R11具有较强活性（图 3），同时，对 R1~12进行了 Tris-Tricine SDS-PAGE电泳检测，结果表明 R1~R8
的分子量范围均在 10 kDa以下，而 R9~R12的分子量范围在 10 kDa以上（图 3）。
我们选择 R5~R8以及 R11等 5个具有较强毒性的组分上样分析型 C18反相柱进行进一步分离，分
离结果如图 4所示。经进一步分离后，共收集 7个组分，分别命名为 R5-1，R6-1，R7-1，R7-2，R8-1，R8-2
以及 R11-1。质谱结果表明，这 7个多肽分子量在 2~5kDa之间（图 5）。毒性检测表明，这 7种多肽在 100
μg/kg体重浓度下对脊尾白虾以及黄粉虫幼虫均具有强致死活性，在注射后 1 min内可导致实验动物抽
搐、痉挛并迅速死亡；同等浓度下对小鼠无致死活性，但可引起小鼠出现瘫软症状。
图 1 海葵粗毒经 Sepax-100A觷分子筛分离的图谱
以去离子水为洗脱液，共收集 12个洗脱峰，分别命名为 GF1~12.
Fig.1 Sepax-100A觷 gel filtration of peptide
Sample, the crude extract from AnthopLeura xanthogrammica. eluting
solvent,double distilled water; flow rate, 0.75mL/min; column, 7.8×300
mm; fractions collected is labeled from GF1 to GF12.
图 2 GF2+GF3号峰经 C8反相柱分离后的图谱
洗脱组分的收集以粗下划线标注，共收集 12个组分，分
别命名为 R1~12.
Fig.2 Reverse-phase HPLC of fraction GF2+GF3
obtained from the above gel filtration
Sample, toxic fractions obtained by gel filtration; column,
SunfireTM Prep C8（10×250 mm,); elution solvent, linear
gradient of acetonitrile in 0.1% TFA; flow rate, 1ml/min.
fractions collected were labeled.
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图 3 GF2+GF3号峰经 C8反相柱分离后，各洗脱峰的 Tris-Tricine SDS-PAGE电泳检测图谱
A:R1~R7组分的电泳检测图谱；B: R8~R12的电泳检测图谱。“＋＋”代表对水白虾以及黄粉虫幼虫具有强致死毒性，
“＋”代表对水白虾以及黄粉虫幼虫具有较弱的毒性，“－代表未检测到毒性.
Fig.3 Tris-Tricine SDS-PAGE of the fractions obtained from the above RP-HPLC SunfireTM Prep C8（10×250 mm
(A) Fraction R1 to R7;(B) Fraction R8 to R12;“++”. Strong lethalic effect on prawn and mealworms;“+”,mild lethalic effect on
prawn and mealworms;“-”, no lethalic effect on prawn and mealworms.
图 4 R5~R8以及 R11经 C18反相分离后的图谱
经动物毒性检测，收集 7个活性组分，分别命名为 R5-1, R6-1, R7-1, R7-2, R8-1, R8-2和 R11-1.
Fig.4 Reverse-phase HPLC of toxic fractions obtained from the above RP HPLC SunfireTM Prep C8（10×250 mm）. column,
SunfireTM Prep C18（4.6×250 mm,); elution solvent, linear gradient of acetonitrile in 0.1% TFA; flow rate, 1ml/min. toxic fractions
collected were labeled.
A B
7.7
32
25
14
3.5
7.7
32
25
14
3.5
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3 讨论
目前，海葵毒素是生物毒素来源的杀虫肽开发的主要研究对象，从海葵毒素中已经发现不少多肽毒素
对甲壳类动物具有特异的致死或麻痹作用，而对哺乳动物没有活性或者低毒性，其对甲壳动物所表现出的
选择性毒理作用使其有望成为开发杀虫肽的先导分子[4]，但该类多肽毒素的作用靶点尚不清楚，因为昆虫
细胞的培养难度较大，因而从细胞水平了解海葵毒素对昆虫的毒性机理尚存在不少困难。
目前，从海葵毒素中鉴定到的对甲壳类动物具有特异毒性的多肽分子已经超过 12种，例如, 来自海
葵 Anemonia erythraea 的 AETX III，由 59个氨基酸残基组成，序列中含 10个半胱氨酸，对蟹的半致死浓
度(LD50) 分别为 0.53 和 0.28 μg/kg体重，是目前发现的对甲壳类动物毒性最强的多肽分子 [5]；来自海葵
Stichodactyla gigantea 的 gigantoxin I，能快速麻痹蟹类，其半有效浓度(ED50) 为 215 μg/kg[6]；从海葵 An－
theopsis maculate 的毒素中分离到 2种对甲壳类具有特异毒性的分子，分别为 Am I和 Am II，其中 Am I
由 27 个氨基酸残基组成，对蟹类具有致死活性，其 LD50为 830 μg/kg，Am II 由 46个氨基酸残基组成，对
图 5 7种舟山黄海葵杀虫肽的质谱分析图
表明这些杀虫肽的分子量在 2~5 kDa之间.
Fig.5 Mass spectrometric analysis of target peptides
Revealed molecular masses of 5 027 and 5 043 Da indicating the occurrence of a single oxidated form as the major isolation product.
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蟹类具有麻痹活性，其 ED50为 420 μg/kg[7]；HONME 等[8]最近还从海葵 Stichodactyla haddoni 中分离到4
种新型多肽毒素，分别命名为 SHTX-I、II、III和 IV，其中，SHTX- 1 和 II 由 28个氨基酸组成，对蟹具有麻
痹作用，SHTX-III由 62个氨基酸组成，同样可以使蟹出现麻痹，同时还具有钾通道抑制活性，而 SHTX-IV
由 48个氨基酸组成，对蟹具有致死活性，同时具有钠通道抑制活性。
舟山黄海葵属于黄海葵的一种，对其毒素的研究目前尚不多见。我们的研究表明，舟山黄海葵的粗毒
对甲壳类具有较强的毒性，这可能与舟山黄海葵的食性有关，因为甲壳类动物通常是海葵的主要食物之
一，行动缓慢，通常营固着生活的的海葵必须要在短时间内迅速麻痹甲壳类猎物并致死或致瘫，因此，在进
化过程中，海葵发展了一套行之有效的毒素系统，可以用来捕获行动敏捷的甲壳类以及其它猎物。笔者的
研究结果表明，舟山黄海葵的粗毒在 200 μg/kg体重浓度下注射脊尾白虾后，在 1 min内即可导致实验动
物的麻痹、抽搐然后死亡；其对黄粉虫幼虫的毒性同样表现出快速的特征，这表明舟山黄海葵粗毒中富含
对节肢动物有毒性的分子，且毒性较强。通过采用多维高效液相色谱分离结合动物毒性实验，我们最终从
舟山黄海葵的粗毒中分离到 7种对脊尾白虾和黄粉虫幼虫具有杀伤作用的毒素多肽分子，在 100 μg/kg
体重浓度下可导致水白虾以及黄粉虫幼虫的快速致死作用，其对节肢动物的毒性较强；尽管这 7种毒素分
子在小鼠腹腔注射后也具有毒性，但相对毒性较弱，因此有望成为开发杀虫肽的先导分子。质谱分析表明，
这 7种舟山黄海葵毒素多肽分子量在 2~5 kDa左右，与已知的海葵杀虫肽分子量接近，均属于小肽分子，
目前，关于这 7种多肽毒素的序列分析以及毒性机制仍在深入进行中。上述研究结果表明，作为舟山海域
常见的一种黄海葵，舟山黄海葵毒素中富含各种毒素多肽，是一个研究和开发杀虫肽以及其它活性物质的
宝库。
致谢：感谢湖南师范大学生命科学院蛋白质化学研究室在实验过程中提供质谱分析数据！
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