全 文 ：舟山黄海葵兴奋性毒素ＡＸ－１的分离纯化
及鉴定△
①
杨林１，荣明强２，刘少华１，章晨１，石戈１，王日昕１，赵盛龙１，廖智１＊
（１．浙江海洋学院，海洋生物资源及分子工程实验室，浙江 舟山，３１６００４；
２．湖南师范大学，蛋白质化学教育部重点实验室，湖南 长沙，４１００８１）
摘　要：目的 从舟山黄海葵（ＡｎｔｈｏｐＬｅｕｒａ　ｘａｎｔｈｏｇｒａｍｍｉｃａ）的刺细胞中分离纯化多肽类毒素分子并进行功
能鉴定。方法 通过反复冻融法以及多步高效液相色谱分离技术从舟山黄海葵毒素中分离到一种新型多肽类
毒素，进行质谱鉴定和三维结构模拟，并运用膜片钳技术检测海葵毒素多肽对大鼠背根神经节（ＤＲＧ）细胞的
河豚毒素－敏感型（ＴＴＸ－Ｓ）和河豚毒素－不敏感型（ＴＴＸ－Ｒ）钠离子通道的影响。结果 获得由４８个氨基酸组
成，相对分子质量为５０１８．２的多肽毒素分子，命名为ＡＸ－１，含３对二硫键；三维结构模拟表明该毒素多肽的
结构以反平行β－折叠片以及ｌｏｏｐ结构为主，该毒素能抑制大鼠背根神经节细胞的钠离子通道的失活并显著
增加钠离子通道的电流。结论 ＡＸ－１是一种兴奋性多肽毒素，可作为潜在的强心肽药物。
关键词：海葵；海葵毒素；ＡＸ－１；钠离子通道
中图分类号：Ｑ９５９．１３５．１，Ｒ９９　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１００２－３４６１（２０１２）０２－００２５－０９
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ　ｔｏｘｉｎｓ　ＡＸ－１　ｆｒｏｍ
Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ　ｘａｎｔｈｏｇｒａｍｍｉｃａｉｎ　Ｚｈｏｕｓｈａｎ
ＹＡＮＧ　Ｌｉｎ１，ＲＯＮＧ　Ｍｉｎｇ－ｑｉａｎｇ２，ＬＩＵ　Ｓｈａｏ－ｈｕａ１，ＺＨＡＮＧ　Ｃｈｅｎ１，ＳＨＩ　Ｇｅ１，ＷＡＮＧ　Ｒｉ－ｘｉｎ１，
ＺＨＡＯ　Ｓｈｅｎｇ－ｌｏｎｇ１，ＬＩＡＯ　Ｚｈｉ　１＊
（１．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，
Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｏｕｓｈａｎ３１６００４，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ），
Ｈｕｎａｎ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１００８１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｓｏｌａｔｅ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｙ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｔｏｘｉｎ　ｆｒｏｍ　ｓｔｉｎｇｉｎｇ　ｃｅｌｓ　ｏｆ　Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ　ｘａｎｔｈｏｇｒａｍ－
ｍｉｃａｉｎ　Ｚｈｏｕｓｈａｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅａｓｔ　Ｃｈｉｎａ　Ｓｅａ　ａｎｄ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｉｔｓ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｔｏｘｉｎ　ｗａｓ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｂｙ
ｒｅｐｅａｔｅｄ　ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｍｕｌｔｉ－ｓｔｅｐ　ＨＰＬＣ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ
ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＡＸ－１ｏｎ　ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ（ＴＴＸ－Ｓ）ａｎｄ　ｔｅｔ－
ｒｏｄｏｔｏｘｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ（ＴＴＸ－Ｒ）ｓｏｄｉｕｍ　ｉｏｎ　ｃｈａｎｎｅｌｓ　ｉｎ　ｒａｔ　ｄｏｒｓａｌ　ｒｏｏｔ　ｇａｎｇｌｉｏｎ（ＤＲＧ）ｃｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ
ｂｙ　ｐａｔｃｈ－ｃｌａｍｐ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｔｏｘｉｎ　ｎａｍｅｄ　ＡＸ－１ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ　ｘａｎｔｈｏ－
ｇｒａｍｍｉｃａ．ＡＸ－１ｃｏｎｓｉｓｔｓ　ｏｆ　４８ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ，ｗｉｔｈ　ｔｈｒｅｅ　ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　ｂｏｎｄｓ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ　ｏｆ
５０１８．２．Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｍｏｄｅｌｉｎｇ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ＡＸ－１ｗａｓ　ｍａｉｎｌｙ　ａｎｔｉ－
５２
中国海洋药物杂志２０１２年４月第３１卷第２期 Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍａｒ　Ｄｒｕｇｓ，２０１２Ａｐｒｉｌ，Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．２
①△基金项目：浙江省科技厅面上科研农业项目（２００９Ｃ３２０２２）
　作者简介：杨林，女，硕士研究生
＊通讯作者：廖智，男，副教授 Ｔｅｌ：１３４５４０６６４４８；Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉａｏｚｈｉ＠ｚｊｏｕ．ｅｄｕ．ｃｎ；
DOI:10.13400/j.cnki.cjmd.2012.02.002
ｐａｒａｌｅｌβ－ｓｈｅｅｔｓ　ａｎｄ　ｌｏｏｐｓ．Ｉｔ　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｓｏｄｉ－
ｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ　ｃｕｒｒｅｎｔ　ｉｎ　ｒａｔ　ｄｏｒｓａｌ　ｒｏｏｔ　ｇａｎｇｌｉｏｎ　ｃｅｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＡＸ－１ｗａｓ　ａｎ　ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｔｏｘｉｎ，
ａｎｄ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｃａｒｄｉａｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｄｒｕｇ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｓｅａ　ａｎｅｍｏｎｅ；ｓｅａ　ａｎｅｍｏｎｅ　ｔｏｘｉｎ；ＡＸ－１；ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ
　　海葵又名海菊花，属于腔肠动物门（Ｃｏｅｌｅｎ－
ｔｅｒａｔａ）、珊瑚虫纲 （Ａｎｔｈｏｚｏａ）、六放珊瑚亚纲
（Ｈｅｘａｃｏｒａｌｉａ），目前已报道的超过１０００种，其中
中国约占１０％。海葵主要通过刺细胞分泌毒液捕
食鱼、贝类、桡足类、甲壳类动物以及蠕虫，其毒液
中富含各种多肽成分，是目前生物毒素研究的重
要内容，也是海洋药物开发的主要来源之一。海
葵毒素包括神经毒素和细胞毒素，目前已经从约
４０种海葵中分离到超过３００种毒素多肽分子，主
要包括钠离子通道毒素，钾离子通道毒素，酸敏感
质子通道毒素，海葵溶细胞毒素以及酶抑制剂等，
其中海葵钠离子通道毒素是一类相对分子质量为
３－５ｋＤ的多肽分子，通常含有３～４对二硫键，目
前已鉴定的海葵钠离子通道毒素超过５０种［１］，由
于海葵钠离子通道毒素专一性强，活性特殊，是海
葵毒素中最令人感兴趣的研究对象，也是研究钠
离子通道结构与功能以及钠离子通道相关疾病的
主要工具试剂和潜在的药物［２－３］。
舟山黄海葵（ＡｎｔｈｏｐＬｅｕｒａ　ｘａｎｔｈｏｇｒａｍｍｉ－
ｃａ）属于海葵科，侧花海葵属，其体内富含多种毒
素分子，是研究肽类毒素的结构与功能，进行海洋
生物药物开发的理想对象。对舟山黄海葵进行反
复冻融法提取粗毒液，采用丙酮分级沉淀，结合反
相高效液相色谱，从舟山黄海葵中分离到一种相
对分子质量５０１８．２Ｄａ的毒素多肽，由４８个氨基
酸残基组成，命名为ＡＸ－１；通过氨基酸序列分析、
空间结构模拟、以及对大鼠背根神经节细胞的钠
离子通道的作用等，初步研究了ＡＸ－１的结构与功
能，为深入了解ＡＸ－１的活性机制以及将来的药物
研发提供参考。
１　仪器试剂与材料
１．１　仪器
高效液相色谱仪（Ｗａｔｅｒｓ　６００Ｅ）；冷冻离心
机；纯水仪（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）；冷冻干燥机；基质辅助激
光解吸电离飞行时间质谱（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）质谱
（Ｖｏｙａｇｅｒ－ＤＥＴＭＳＴＲ　ＢｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｉｔｒｙＴＭ　ｗｏｒｋｓｔａ－
ｔｉｏｎ，美国 Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司）；ＥＰＣ９膜片
钳放大器 （Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｄ　Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ，德国 ＨＥＫＡ
公司）；Ｐｒｏｃｉｓｅ　４９１－Ａ型蛋白质测序仪（美国 ＡＢＩ
公司）。
１．２　试剂
丙酮（ＡＲ，国药集团化学试剂有限公司，批号
Ｔ２０１００２２５），氯化铯（ＡＲ，国药集团化学试剂有限
公司，批号Ｔ２００９０１５２），氟化铯（ＡＲ，国药集团化
学试剂有限公司，批号 Ｔ２０１００５４６），氢氧化铯
（ＡＲ，国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司，批 号
Ｔ２０１００８７６），氯化钠（ＡＲ，上海生物工程有限公
司，批号ＸＺ０７２０Ｂ５０１１Ｚ），氯化钙（ＡＲ，上海生物
工程有限公司，批号 ＬＺ０７１３Ｓ５０１０Ｊ），氯化镁
（ＡＲ，上 海 生 物 工 程 有 限 公 司，批 号
ＧＢ１２１４Ｂ２０１０Ｊ），α－氰基－４－羟基－肉桂酸 （ＨＰＬＣ
Ｇｒａｄｅ，Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ），三氟乙酸 （ＨＰＬＣ
Ｇｒａｄｅ，Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ），胶原酶（蛋白质组学
级，Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ），胰蛋白酶（蛋白质组学
级，Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ，批 号 ５６Ｃ８６３５），乙 腈
（ＨＰＬＣ　Ｇｒａｄｅ，ＭＥＲＫ　Ｌｔｄ．Ｃｏ，批号ＬＥＣ０Ｋ０４）。
１．３　材料
舟山黄海葵（ＡｎｔｈｏｐＬｅｕｒａ　ｘａｎｔｈｏｇｒａｍｍｉ－
ｃａ）采自浙江舟山朱家尖海域，采集后在实验室以
洁净海水在２５℃条件下通气饲养；
２　实验方法
２．１　海葵粗毒的提取
取实验室饲养的海葵（约３５０ｇ），用去离子水
冲洗净，浸在总体积５００ｍＬ双蒸水中，迅速在
－８０℃条件下冷冻，１２ｈ后，取出冷冻的海葵，在室
温下解冻，待全部融化后，再次将样品放置在－８０℃
冷冻１２ｈ，再在室温下充分融化，上述步骤重复
２～３次。将融化后的海葵样品用纱布包裹对其进
行粗过滤，去掉海葵躯体等杂质，取其滤液；将滤
液置于高速冷冻离心机中，在４°Ｃ、１４　０００ｒ·
ｍｉｎ－１条件下，离心２０ｍｉｎ，取其上清液；重复离心
２次后，上清液即为海葵粗毒样品，置于４°Ｃ保存
６２
Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍａｒ　Ｄｒｕｇｓ，２０１２Ａｐｒｉｌ，Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．２ 中国海洋药物杂志２０１２年４月第３１卷第２期
备用。
采用丙酮分级沉淀法对海葵粗毒液进行初步
抽提。丙酮事先在－２０℃条件下进行预冷，之后在
海葵粗毒液中分别加入２０％，５０％，８０％的丙酮进
行分级沉淀，每一步所得沉淀在４℃、１２　０００ｒ·
ｍｉｎ－１条件下，离心１０ｍｉｎ，所得沉淀收集后冷冻
干燥，保存于－２０℃冰箱中备用。
２．２　海葵粗毒的高效液相层析分离
取８０％丙酮所得沉淀，样品以去离子水溶
解，经０．４５μｍ孔径滤头过滤后，采用反相高效液
相色谱进行分离。所有分离步骤均在 Ｗａｔｅｒｓ
６００Ｅ型高效液相色谱仪上完成，检测器为 Ｗａｔｅｒｓ
２４８７型紫外检测器，检测波长为２８０ｎｍ。
第一步：采用 ＸＢｒｉｄｇｅＴＭ　Ｃ８半制备型反相
柱（１０ｍｍ×２５０ｍｍ，美国 Ｗａｔｅｒｓ公司），洗脱液
分别为含０．１％ＴＦＡ（体积分数ψ）的水（Ａ液）以
及含０．１％ＴＦＡ（体积分数ψ）的乙腈（Ｂ液）；采用
线性梯度洗脱，３０ｍｉｎ内Ｂ液浓度由５％上升到
４５％；流速为２．５ｍＬ·ｍｉｎ－１，收集各洗脱峰经冷
冻干燥置于冰箱中保存备用。
第二步：对上述步骤中主要洗脱峰组分进行
进一步反相高效液相色谱分离，反相色谱柱为
２１８ＴＰ５４Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，Ｖｙｄａｃ公司），
洗脱液分别为含０．１％ＴＦＡ的水（Ａ液）和乙腈（Ｂ
液）；采用线性梯度洗脱，５０ｍｉｎ内，Ｂ液从２０％上
升到４０％，流速为１ｍＬ·ｍｉｎ－１，收集各洗脱峰经
冷冻干燥后进行相对分子质量检测。
２．３　海葵毒素ＡＸ－１的鉴定
利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）质谱 （Ｖｏｙａｇｅｒ－ＤＥＴＭＳＴＲ　Ｂｉｏ－
ｓｐｅｃｔｒｏｍｉｔｒｙＴＭ　Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ，美国 Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ－
ｓｙｓｔｅｍｓ公司）测定毒素多肽的精确相对分子质
量。采用线性阳离子模式；Ｎ２光源３３７ｎｍ；离子
加速电压为２０　０００Ｖ。基质为α－氰基－４－羟基－肉
桂酸（α－ｃｙａｎｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙ－ｃｉｎｎａｍｉｃ　ａｃｉｄ，ＣＣＡ），通
过以下方式制备样品：取１μＬ样品液加入到９μＬ
ＣＣＡ的５０％乙腈饱和溶液（含０．１％ＴＦＡ），混匀
后取１μＬ点样，室温干燥后进行质谱测定，相对
分子质量以内标法进行校正。
毒素多肽的氨基酸序列测定采用Ｅｄｍａｎ降
解法在美国 ＡＢＩ公司的Ｐｒｏｃｉｓｅ　４９１－Ａ型蛋白质
测序仪上进行。采用仪器配备的标准程序测序，
测５０个循环，在线反相高效液相色谱检测并结合
氨基酸标准图谱判断氨基酸种类，最终准确读出
所测样品的氨基酸序列。
通过ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／＃ｐｒｉ－
ｍａｒｙ在线分析毒素多肽的理论相对分子质量和
等电点，多肽序列同源性分析利用ＢＬＡＳＴ软件在
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）进
行；序列比对分析利用软件ＣｌｕｓｔａｌＷ　１．８３在（ｈｔ－
ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｂｅｅ．ｍｓｕ．ｓｕ／ｃｌｕｓｔａｌ／）进行；
海葵毒素多肽的空间结构利用结构模拟软件
ＥＳｙＰｒｅｄ３Ｄ ［４］，以 来 自 黄 海 葵 的 毒 素 Ａｎ－
ｔｈｏｐｌｅｕｒｉｎ－Ａ（Ａｐ－Ａ）的空间结构 （ＰＤＢ 编号：
１ＡＨＬ）为模板，对其进行空间结构模拟，获得舟山
黄海葵毒素多肽的主链空间结构。
２．４　海葵毒素多肽的功能分析
采用全细胞膜片钳技术分别检测海葵毒素多
肽对大鼠背根神经节（ＤＲＧ）细胞的河豚毒素－敏
感型（ＴＴＸ－Ｓ）和河豚毒素－不敏感型（ＴＴＸ－Ｒ）钠
离子通道的影响。钠电流记录通过放大器ＥＰＣ９
（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｄ　Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ，德国 ＨＥＫＡ公司）进行；
计算机记录和分析系统采用Ｐｕｌｓｅ＋Ｐｕｌｓｅｆｉｔ　８．０
软件；数据分析分别用ｃｌａｍｐｆｉｔ软件 （Ａｘｏｎ，美
国）以及Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ软件（Ｓｉｇｍａ，美国）进行。
大鼠ＤＲＧ细胞分离。挑选出生４周左右、质
量约为１４０～２００ｇ的ＳＤ大鼠，麻醉后断颈处死，
从其脊椎中挑取背根神经节。神经细胞转入含有
１５ｍＬ消化液的指管中，用消化液（胶原酶１．５６
ｍｇ、胰蛋白酶０．６６ｍｇ）酶解２０～３０ｍｉｎ（３４℃下、
１１０ｒ·ｍｉｎ－１）。酶解后的ＤＲＧ细胞放入３７℃恒
温培养箱（５％ ＣＯ２）中，培养３～４ｈ后用于记录
钠离子通道电流。
全细胞膜片钳记录。倒置显微镜下选择细胞
膜较为光滑、细胞质均匀的 ＤＲＧ 细胞，在室温
２０～２５℃条件下进行膜片钳实验。测定ＤＲＧ细
胞钠电流的细胞外液（单位 ｍｍｏｌ·Ｌ－１）为：３０
ＮａＣｌ，２５Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ，１．８ＣａＣｌ２，５ＫＣｌ，１ＭｇＣｌ２，
５ＣｓＣｌ，９０ＴＥＡ－Ｃｌ，５ＨＥＰＥＳ，ｐＨ为７．４。细胞
内液为：１３５ＣｓＦ，１０ＮａＣｌ，５ＨＥＰＥＳ，采用ＣｓＯＨ
调ｐＨ至７．４。
玻璃电极初始电阻为１．５～２．５ＭΩ。待电极
与细胞膜之间形成高阻抗的京欧（ＧΩ）封接后，补
电极快电容（ｆａｓｔ　ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）。然后将细胞钳制
７２
中国海洋药物杂志２０１２年４月第３１卷第２期 Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍａｒ　Ｄｒｕｇｓ，２０１２Ａｐｒｉｌ，Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．２
在－６０ｍＶ，给予一短而有力的负压，将钳制在电极
中的细胞膜迅速打破，再补偿细胞慢电容（Ｓｌｏｗ
ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）。形成全细胞记录模式后将细胞钳制
为－８０ｍＶ，细胞稳定４～６ｍｉｎ后开始记录电流。
３　结果
３．１　海葵毒素 ＡＸ－１的分离纯化及鉴定
采集的舟山黄海葵身体呈圆筒形，体柱上有
排列不规则的疣状突起，上宽下窄，辐射对称；上
端有一平的口盘，口盘边缘环生触手，由内向外
排成４列，排列式为１２、１２、２４、４８。海葵体经反
复冻融后，收集冻融液，经过滤、离心后，上清液分
别以２０％、５０％和８０％丙酮进行分级沉淀，其中，
８０％丙酮沉淀的样品经冷冻干燥去除丙酮后，重
新溶解于去离子水，上样反相高效液相色谱进行
分离纯化。
第一步高效液相色谱分离采用Ｃ８制备柱进
行，洗脱图谱见图１。由图１可见，海葵经反复冻
融后的提取物成分复杂，出峰时间集中在乙腈浓
度１５％～３５％之间。
“＊”号标注为所收集的主峰
Ｔｈｅ　ｍａｉｎ　ｐｅａｋｓ　ｃｏｌｅｃｔｅｄ　ａｒｅ　ｌａｂｅｌｅｄ　ａｓ“＊”
图１　８０％丙酮沉淀后舟山黄海葵粗毒经半制备型Ｃ８反相柱分离后的洗脱曲线
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ＡｎｔｈｏｐＬｅｕｒａ　ｘａｎｔｈｏｇｒａｍｍｉｃａ　ｖｅｎｏｍ　ｂｙ　ｓｅｍｉ－ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　ＸＢｒｉｄｇｅＴＭ　Ｃ８ｃｏｌｕｍｎ
（１０ｍｍ＊２５０ｍｍ，ｗａｔｅｒｓ）ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ　ｃｏｌｕｍｎ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　８０％ａｃｅｔｏｎｅ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
　　第二步高效液相色谱分离采用分析型Ｃ１８反
相柱，洗脱曲线见图２Ａ，收集主峰（图中“＊”号标
注）峰尖部分后经冷冻干燥进行质谱鉴定。
图２中收集的主峰经质谱检测，其精确相对
分子质量为５０１８．２Ｄａ，且纯度较高（见图２Ｂ）。
氨基酸序列测定采用Ｅｄｍａｎ降解法进行，序列分
析结果表明，该毒素多肽由４８个氨基酸残基组
成，其氨基酸序列为：ＧＧＶＰＣ　ＬＣＤＳＤ　ＧＰＳＶＲ
ＧＮＴＬＳ　ＧＩＩＷＬ　ＲＧＣＰＳ　ＧＷＨＮＣ　ＫＡＨＧＰ　ＴＩＧ－
ＷＣ　ＣＫＱ，该毒素多肽命名为 ＡＸ－１，其序列理论
相对分子质量为５０２５．７Ｄａ，等电点为８．３５，是一
种碱性蛋白。
序列同源性搜索结果表明，与ＡＸ－１序列同源
性最高的海葵毒素为来自海葵Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ　ｆｕｓ－
８２
Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍａｒ　Ｄｒｕｇｓ，２０１２Ａｐｒｉｌ，Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．２ 中国海洋药物杂志２０１２年４月第３１卷第２期
ｃｏｖｉｒｉｄｉｓ的毒素多肽 ＡＦＴ－ＩＩ；其次为来自海葵
Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ　ｅｌｅｇａｎｔｉｓｓｉｍａ的毒素 Ａｐ－Ｃ，来自海
葵Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ　ｅｌｅｇａｎｔｉｓｓｉｍａ的ＡＰＥ２－１，以及来
自Ａｎｅｍｏｎｉａ　ｖｉｒｉｄｉｓ的毒素 Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ－２；此外，
来自黄海葵Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ　ｘａｎｔｈｏｇｒａｍｍｉｃａ 的毒
素Ａｐ－Ａ，与本研究中的海葵毒素多肽ＡＸ－１序列
同源性也很高（见图３）。这表明上述海葵毒素均
来自同一祖先分子，且具有相似的结构与功能。
图２　Ａ：舟山黄海葵粗毒经Ｃ８反相柱分离后收集的主峰（图１中“＊”号标注）经分析型Ｃ１８进一步分离后的洗脱曲
线，图中“＊”号标注者为所收集的主峰；Ｂ：主峰经质谱鉴定，结果表明其相对分子质量为５０１８．２Ｄａ。舟山黄海葵毒素
多肽ＡＸ－１的分离纯化及质谱鉴定。
Ｆｉｇ．２　Ａ：ｔｈｅ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ｔｏｘｉｃ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｆｉｇ．１，ｄｅｎｏｔｅｄ　ｂｙ“＊”）ｃｏｌｅｃｔｅｄ　ａｂｏｖｅ　ｂｙ　ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　２１８ＴＰ５４Ｃ１８（４．
６×２５０ｍｍ，Ｖｙｄａｃ），“＊”ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ　ｔｈｅ　ｃｏｌｅｃｔｅｄ　ｐｅａｋ；Ｂ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｍａｓｓ　ｏｆ　ＡＸ－１ｗａｓ　５０１８．２．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡＸ－１
９２
中国海洋药物杂志２０１２年４月第３１卷第２期 Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍａｒ　Ｄｒｕｇｓ，２０１２Ａｐｒｉｌ，Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．２
“＊”标注的是完全一致的氨基酸残基。“＊”ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ　ｉｄｅｎｔｉｃａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ
图３　ＡＸ－１与其他海葵毒素多肽的所序列比对图
Ｆｉｇ．３　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ＡＸ－１ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　ｓｅａ　ａｎｅｍｏｎｅ　ｔｏｘｉｎ　ｐｅｐｔｉｄｅ
３．２　功能鉴定
采用全细胞膜片钳记录模式检测该毒素对大
鼠ＤＲＧ神经元电压门控钠通道的影响。将细胞
膜电位钳制在－８０ｍＶ，以５０ｍｓ的时程给予一测
试电压–１０ｍＶ，每隔５ｓ重复一次。如图４Ａ所
示，１μｍｏｌ·Ｌ－
１毒素能增加大鼠 ＤＲＧ 细胞的
ＴＴＸ－Ｓ钠通道电流约（１４９．２９±３５．２４）％，１０
μｍｏｌ·Ｌ－
１该毒素增大 ＴＴＸ－Ｓ 钠通道电流约
（３４０．７３±２９．７９）％，同时也能明显延缓 ＴＴＸ－Ｓ
钠通道的快速失活时间。在空白对照条件下，
ＴＴＸ敏感型钠电流在去极化５ｍｓ时几乎完全失
活，但加毒素后，去极化５ｍｓ时钠电流并未失活，
这表明海葵毒素 ＡＸ－１不仅能增加大鼠 ＤＲＧ细
胞上的ＴＴＸ－Ｓ钠电流强度，同时能延缓钠通道的
失活。海葵毒素ＡＸ－１对大鼠ＤＲＧ细胞的ＴＴＸ－
Ｒ型钠离子通道电流无明显影响，如图４Ｂ所示，
１０μｍｏｌ·Ｌ－１浓度的海葵毒素ＡＸ－１毒素仅微弱
抑制 ＴＴＸ－Ｒ 型钠离子通道的峰电流，对大鼠
ＤＲＧ细胞的ＴＴＸ－Ｒ钠通道失活没有影响。
图４　将细胞膜电位钳制在－８０ｍＶ，以５０ｍｓ的时程给予一测试电压－１０ｍＶ，每隔５ｓ重复一次。（Ａ）１μｍｏｌ·
Ｌ－１，１０μｍｏｌ·Ｌ
－１毒素能增大 ＴＴＸ－Ｓ钠通道电流同时也能延缓钠离子通道的失活。（Ｂ）１０μｍｏｌ·Ｌ
－１毒素对
ＴＴＸ－Ｒ钠电流无明显作用。海葵毒素ＡＸ－１对大鼠ＤＲＧ神经元钠通道的作用。
Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｃｌａｍｐｅｄ　ａｔ－８０ｍＶ，５０ｍｓ　ｉｎ　ｄｕｒａｔｉｏｎ，ｇｉｖｅｎ　ａ　ｔｅｓｔ　ｖｏｌｔａｇｅ　ｏｆ－１０ｍＶ，ｒｅｐｅａｔｅｄ　ｅｖ－
ｅｒｙ　５ｓ．（Ａ）ｂｏｔｈ　１μｍｏｌ·Ｌ
－１　ａｎｄ　１０μｍｏｌ·Ｌ
－１　ｔｏｘｉｎｓ　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ＴＴＸ－Ｓ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｕｒｒｅｎｔ　ａｎｄ　ｄｅｌａｙ　ｓｏｄｉｕｍ
ｃｈａｎｎｅｌ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．（Ｂ）１０μｍｏｌ·Ｌ
－１　ｔｏｘｉｎ　ｈａｄ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ＴＴＸ－Ｒ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｕｒｒｅｎｔ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＡＸ－１ｏｎ
ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌｓ　ｉｎ　ｒａｔ　ＤＲＧ　ｎｅｕｒｏｎｓ
　　在全细胞模式下，检测毒素对 ＤＲＧ细胞上
ＴＴＸ－Ｓ钠离子通道电流－电压曲线影响（Ｉ－Ｖ），以
研究毒素对钠离子通道开放的影响。细胞钳制电
位－８０ｍＶ，测试电压变化范围从－８０ｍＶ～＋５０
ｍＶ，测试电压持续时间５０ｍｓ，跃迁步幅＋１０
ｍＶ。在没有加毒素对照条件下，ＴＴＸ－Ｓ钠通道
的起始激活电压为－３０ｍＶ，最大峰值电流激活
电压为－１０ｍＶ，逆转电位为＋２５ｍＶ左右。加
入１０μｍｏｌ·Ｌ
－１毒素后，ＴＴＸ－Ｓ钠通道的起始激
活电压为－４０ｍＶ，最大峰值电流激活电压为－２０
０３
Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍａｒ　Ｄｒｕｇｓ，２０１２Ａｐｒｉｌ，Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．２ 中国海洋药物杂志２０１２年４月第３１卷第２期
ｍＶ，（见图５Ａ），１０μｍｏｌ·Ｌ
－１的毒素使钠离子通
道Ｉ－Ｖ曲线往超极化方向漂移１０ｍＶ，同时也增
加钠通道Ｉ－Ｖ曲线锋值电流幅度。电导曲线同样
显示（见图５Ｂ），１０μｍｏｌ·Ｌ
－１毒素能使钠通道的
激活往超极化方向漂移。
３．３　空间结构分析
通过序列比对，发现舟山黄海葵毒素多肽
ＡＸ－１与Ａｐ－Ａ的序列相似性较高，且 Ａｐ－Ａ的溶
液结构已被解析，因此，以 Ａｐ－Ａ 分子结构为模
板，采用结构模拟软件ＥＳｙＰｒｅｄ３Ｄ，对ＡＸ－１进行
空间结构模拟。ＡＸ－１的模拟空间结构见图６。由
图６可见，ＡＸ－１采取了与 Ａｐ－Ａ 类似的主链结
构，其结构中包含三段反平行β－折叠片，分别为３－
５号，２１－２４号以及４６－４７号氨基酸残基构成的肽
段；由三段反平行β－折叠片连接分子中的２个大
的环（ｌｏｏｐ），分别为６－２０号以及２５－４５号氨基酸
残基所在肽段。
图５　细胞钳制电位－８０ｍＶ，测试电压变化范围从－８０ｍＶ～＋５０ｍＶ，测试电压持续时间５０ｍｓ，跃迁步幅＋１０
ｍＶ。（Ａ）未加毒素和加入毒素后Ｉ－Ｖ曲线变化，１０μｍｏｌ·Ｌ
－１毒素使钠通道的Ｉ－Ｖ曲线往超极化方向漂移。（Ｂ）未
加毒素和加入毒素后电导曲线变化，１０μｍｏｌ／Ｌ毒素使钠通道的电导曲线往超极化方向漂移。海葵毒素 ＡＸ－１对钠
通道动力学影响。
Ｆｉｇ．５　Ｃｅｌ　ｈｏｌｄｉｎｇ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ－８０ｍＶ，ｔｅｓｔ　ｖｏｌｔａｇｅ　ｒａｎｇｅ　ｆｒｏｍ－８０ｍＶ～ ＋５０ｍＶ，ｔｅｓｔ　ｖｏｌｔａｇｅ　ｄｕｒａｔｉｏｎ　５０ｍｓ，ｔｈｅ
ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ｓｔｒｉｄｅ＋１０ｍＶ．（Ａ）Ｉ－Ｖ　ｃｕｒｖｅ　ｃｈａｎｇｅ　ａｆｔｅｒ　ａｄｄｉｎｇ　ｔｏｘｉｎ　ＡＸ－１，ｔｈｅ　Ｉ－Ｖ　ｃｕｒｖｅ　ｄｒｉｆｔ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ
ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　１０μｍｏｌ·Ｌ
－１　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ　ｔｏｘｉｎｓ．（Ｂ）Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ　ｃｕｒｖｅ　ｃｈａｎｇｅ　ａｆｔｅｒ　ａｄｄｉｎｇ　ＡＸ－１，ｔｈｅ　ｃｏｎｄｕｃｔ－
ａｎｃｅ　ｃｕｒｖｅ　ｄｒｉｆｔ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ　ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　１０μｍｏｌ·Ｌ
－１　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ　ＡＸ－１ｗａｓ　ａｄｄｅｄ．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ
ｓｅａ　ａｎｅｍｏｎｅ　ｔｏｘｉｎ　ＡＸ－１ｏｎ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ
“Ｎ”和“Ｃ”分别代表蛋白质的氨基端和羧基端；红色代表酸性氨基酸侧链，蓝色代表碱性氨基酸侧链。
“Ｎ”ａｎｄ“Ｃ”ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ　ａｎｄ　ｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｒｍｉｎａｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｄ　ｆｏｒ　ａｃｉｄｉｃ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｉｄｅ
ｃｈａｉｎ，ｂｌｕｅ　ｆｏｒ　ｂａｓｉｃ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｉｄｅ　ｃｈａｉｎ．
图６　舟山黄海葵毒素ＡＸ－１的模拟结构及其与黄海葵毒素Ａｐ－Ａ的结构比较
Ｆｉｇ．６　Ｔｏｘｉｎ　ＡＸ－１ｓｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　Ａｐ－Ａ　ｔｏｘｉｎ
１３
中国海洋药物杂志２０１２年４月第３１卷第２期 Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍａｒ　Ｄｒｕｇｓ，２０１２Ａｐｒｉｌ，Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．２
４　讨论
电压门控钠离子通道具有广泛的生理功能，
特别是在可兴奋细胞中介导了动作电位的发
放［５］。海葵毒素中富含各种针对电压门控离子通
道起作用的多肽分子，是筛选离子通道研究相关
工具试剂以及离子通道相关疾病的药物先导分子
的资源宝库［１］。目前已鉴定的海葵钠离子通道毒
素超过５０种，其中绝大多数毒素多肽的作用机制
在于抑制电压门控钠离子通道的失活，增加钠离
子内流，是一类兴奋性毒素多肽。海葵毒素中的
钠离子通道毒素以其高度特异性和较强的活性，
有助于发现和鉴定新型电压门控钠离子通道蛋
白、分析钠离子通道蛋白的结构与功能、研究钠离
子通道的组织特异性等［６］。
舟山黄海葵的毒液中富含多种活性物质，在
前期研究中，已从中发现和鉴定了部分具有杀虫
活性的多肽组分［７］。为进一步从中筛选具有特殊
药理作用的毒素多肽，采取丙酮分级沉淀结合反
相高效液相色谱分离，从中纯化到一种兴奋性钠
离子通道毒素，命名为 ＡＸ－１。ＡＸ－１的相对分子
质量为５０１８．２Ｄａ，由４８个氨基酸残基组成，含６
个半胱氨酸；通过比较其实际相对分子质量与理
论相对分子质量（５０２５．７Ｄａ），其差值为７Ｄａ，推
测序列中的６个半胱氨酸形成了３对二硫键（－
６Ｄａ）且其多肽的 Ｃ端为酰胺化（－１Ｄａ）所致。
ＡＸ－１在舟山黄海葵毒液中丰度较高，是８０％丙酮
沉淀成分中的主要毒素多肽，大约１ｋｇ舟山黄海
葵可提取约２０ｍｇＡＸ－１毒素多肽。通过比较ＡＸ－
１与其他海葵毒素多肽的氨基酸序列，我们发现，
ＡＸ－１与 ＡＦＴ－ＩＩ（来自 Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ　ｆｕｓｃｏｖｉｒｉ－
ｄｉｓ）、Ａｐ－Ｃ（来自 Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ　ｅｌｅｇａｎｔｉｓｓｉｍａ）、
ＡＰＥ２－１（来自Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ　ｅｌｅｇａｎｔｉｓｓｉｍａ）、Ｎｅｕ－
ｒｏｔｏｘｉｎ－２（来自Ａｎｅｍｏｎｉａ　ｖｉｒｉｄｉｓ）、以及Ａｐ－Ａ（来
自Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ　ｘａｎｔｈｏｇｒａｍｍｉｃａ）具有较高的序
列相似性，尽管上述几种毒素多肽来自不同种属
的海葵，但其较高的序列相似性表明它们均来自
同一祖先分子。值得注意的是，ＡＸ－１与 Ａｐ－Ａ均
来自Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ　ｘａｎｔｈｏｇｒａｍｍｉｃａ，但 ＡＸ－１与
Ａｐ－Ａ在序列上存在９个氨基酸残基的差异，推测
可能是同一种属海葵由于地域分布不同而造成的
分子进化不同所致（ＡＸ－１来自舟山采集的黄海
葵，而Ａｐ－Ａ来自美国加州海域采集的黄海葵）。
海葵钠离子通道毒素根据其氨基酸序列差异
可分为３种类型，其中Ｉ型和ＩＩ型数量较多，其共
同特点在于氨基酸残基数目通常为４６～４９个，分
子中均含６个半胱氨酸并形成３对二硫键，连接
方式为Ｉ－Ｖ，ＩＩ－ＩＶ和ＩＩＩ－ＶＩ，但ＩＩ型海葵钠离子通
道毒素在Ｎ端具有Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ（Ｇｌｕ）序列，Ｃ端
具有Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ序列而区别于Ｉ型海葵钠
离子通道毒素［１］；ＩＩＩ型海葵钠离子通道毒素目前
仅发现５种，其特点在于由２７～３２个氨基酸残基
组成，分子中含８个半胱氨酸并形成４对二硫
键［１］。从ＡＸ－１的序列特征来看，其序列中含６个
半胱氨酸，且Ｎ端和Ｃ端不具有ＩＩ型海葵钠离子
通道毒素所具有的序列特征，因此，ＡＸ－１应该属
于Ｉ型钠离子通道毒素。根据毒素多肽结合于钠
离子通道蛋白的位点差异（共有６个结合位点），
可将各种作用于钠离子通道的毒素分为位点１毒
素 ～ 位点６毒素［８］，其中海葵钠离子通道毒素多
属于位点３毒素，其特征在于结合钠离子通道蛋
白的Ｓ３和Ｓ４结构域之间的连接肽段，抑制钠离
子通道的失活从而使钠离子通道保持在开放状
态，导致动作电位持续发放而造成猎物麻痹或痉
挛［９－１０］。根据膜片钳实验结果，ＡＸ－１能有效抑制
大鼠ＤＲＧ细胞的 ＴＴＸ－Ｓ钠离子通道的失活，增
加钠离子通道电流的峰值，且呈现剂量依赖性特
征；根据其电流－电压（Ｉ－Ｖ）曲线判断，ＡＸ－１可使
ＴＴＸ－Ｓ型钠离子通道电流的激活电压往超极化方
向漂移，其作用机制类似于如Ａｐ－Ａ等位点３钠离
子通道毒素［１１－１２］，推测 ＡＸ－１也是结合于钠离子
通道蛋白的位点３区域，但ＡＸ－１对钠离子通道电
流峰值的增加幅度比Ａｐ－Ａ要更大。
迄今已有超过５种作用于位点３的海葵钠离
子通道毒素被解析了空间结构［２］，这些毒素多肽
均采取了类似的结构模体，例如，Ａｐ－Ａ的结构中
包含四链反平行β－折叠，分别由残基２－４，２０－２３，
３４－３７和４５－４８组成，其间由三段Ｌｏｏｐ连接，第
一个Ｌｏｏｐ 环较长且具有很强的柔性，位于该
Ｌｏｏｐ中的残基Ａｓｐ７，Ａｓｐ９以及第三个Ｌｏｏｐ附
近的 Ｈｉｓ３９，Ｌｙｓ３７一起构成ＡｐＡ的活性位点［１３］，
在ＡｐＡ 与钠通道的结合过程中发挥着关键作用。
通过结构比较，我们发现，ＡＸ－１采取了和 Ａｐ－Ａ
类似的主链结构，其序列中 Ａｓｐ８，Ａｓｐ１０，Ｌｙｓ３６，
Ｈｉｓ３８的侧链在空间上的分布特征也与 Ａｐ－Ａ类
２３
Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍａｒ　Ｄｒｕｇｓ，２０１２Ａｐｒｉｌ，Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．２ 中国海洋药物杂志２０１２年４月第３１卷第２期
似 （见图６），推测该区域同样是 ＡＸ－１的活性位
点。
通过上述研究，从舟山黄海葵毒素中分离并
鉴定了一种新型钠离子通道毒素ＡＸ－１，该毒素具
有典型的位点３钠离子通道毒素的功能特征与结
构特征，是一种兴奋性钠离子通道毒素多肽，对治
疗心力衰竭等药物的开发具有潜在价值。对其深
入的活性机制研究目前仍在进行中。
参考文献
［１］　Ｈｏｎｍａ　Ｔ，Ｓｈｉｏｍｉ　Ｋ．Ｐｅｐｔｉｄｅ　ｔｏｘｉｎｓ　ｉｎ　ｓｅａ　ａｎｅｍｏｎｅｓ：
ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｓｐｅｃｔｓ［Ｊ］．Ｍａｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，
２００６，８（１）：１．
［２］　Ｓｍｉｔｈ　ＪＪ，Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ　ＫＭ．．Ｓｉｔｅ－３ｓｅａ　ａｎｅｍｏｎｅ　ｔｏｘｉｎｓ：Ｍｏ－
ｌｅｃｕｌａｒ　ｐｒｏｂｅｓ　ｏｆ　ｇａｔｉｎｇ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｉｎ　ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｓｏ－
ｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌｓ［Ｊ］．Ｔｏｘｉｃｏｎ，２００７，４９（２）：１５９．
［３］　Ｎｏｒｔｏｎ　ＲＳ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｏｆ
ｓｅａ　ａｎｅｍｏｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｔｈａｔ　ｉｎｔｅｒａｃｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ
［Ｊ］．Ｔｏｘｉｃｏｎ，１９９１，２９（９）：１０５１．
［４］　Ｌａｍｂｅｒｔ　Ｃ，Ｌ　ｏｎａｒｄ　Ｎ，Ｄｅ　Ｂｏｌｅ　Ｘ．ＥＳｙＰｒｅｄ３Ｄ：Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ
ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００２，１８
（９）：１２５０．
［５］　Ｇｏｌｄｉｎ　ＡＬ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ　Ｎａ＋ｃｈａｎｎｅｌｓ［Ｊ］．Ｊ
Ｅｘｐ　Ｂｉｏｌ，２００２，２０５（Ｐｔ５）：５７５．
［６］　Ｃａｔｔｅｒａｌ　ＷＡ．Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ　ｔｈａｔ　ａｃｔ　ｏｎ　ｖｏｌｔａｇｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｓｏ－
ｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌｓ　ｉｎ　ｅｘｃｉｔａｂｌｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅｓ［Ｊ］．Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｐｈａｒ－
ｍａｃｏｌ　Ｔｏｘｉｃｏｎ，１９８０，２０：１５．
［７］　刘少华，杨林，章晨，等，舟山黄海葵杀虫活性多肽的初步研
究［Ｊ］．浙江海洋学院学报，２０１０，２９（６）：５６６．
［８］　Ｃａｔｔｅｒａｌ　ＷＡ，Ｇｏｌｄｉｎ　ＡＬ，Ｗａｘｍａｎ　ＳＧ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｕｎｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．ＸＸＸＩＸ．Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　ｖｏｌｔａｇｅ－
ｇａｔｅｄ　ｉｏｎ　ｃｈａｎｎｅｌｓ：ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌｓ［Ｊ］．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｒｅｖ，
２００３，５５（４）：５７５．
［９］　Ｃａｔｔｅｒａｌ　ＷＡ．Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｓｃｏｒｐｉｏｎ　ｔｏｘｉｏｎ　ｔｏ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｓｉｔｅｓ
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌｓ　ｉｎ　ｆｒｏｇ　ｍｕｓｃｌｅ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ
ｏｆ　ｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｇｅｎ
Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９７９，７４（３）：３７５．
［１０］　Ｒｏｇｅｒｓ　ＪＣ，Ｙｕ　Ｑ，Ｔａｎｅｄａ　ＴＮ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｄｅｔｅｒｍｉ－
ｎａｎｔｓ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ａ－ｓｃｏｒｐｉｏｎ　ｔｏｘｉｎ　ａｎｄ　ｓｅａ　ａ－
ｎｅｍｏｎｅ　ｔｏｘｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｓ３Ｓ４ｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　ｌｏｏｐ　ｏｆ　ｄｏｍａｉｎ　ＩＶ
ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａ　ｃｈａｎｎｅｌ　ａ　ｓｕｂｕｎｉｔ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１９９６，２７１
（２７）：１５９５０．
［１１］　Ｂｅｎｚｉｎｇｅｒ　ＧＲ，Ｋｙｌｅ　ＪＷ，Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ　ＫＭ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｃａｒｄｉａｃ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｉｔｅ
３ｔｏｘｉｎ　Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒｉｎ－Ｂ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１９９８，２７３（１）：
８０．
［１２］　Ｔａｎａｋａ　Ｍ，Ｈａｉｕ　Ｍ，Ｙａｓｕｎｏｂｕ　ＫＴ，ｅｔ　ａｌ．Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅ－
ｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａ　ｘａｎｔｈｏｇｒａｍｍｉｃａ　ｈｅａｒｔ　ｓｔｉｍｕ－
ｌａｎｔ，ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒｉｎ　Ａ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７７，１６（２）：
２０４．
［１３］　Ｐａｌａｇｈｙ　ＰＫ，Ｓｃａｎｌｏｎ　ＭＪ，Ｍｏｎｋｓ　ＳＡ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎ－
ｓｉｏｎａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　ｃａｒｄｉａｃ　ｓｔｉｍｕ－
ｌａｎｔ　ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒｉｎ－Ａ ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，３４（１１）：
３７８２．
（收稿日期：２０１１－１０－２４）
本期封面为未知种名软体生物，图片由中国科学院上海药物研究所郭跃伟研究员提
供。
３３
中国海洋药物杂志２０１２年４月第３１卷第２期 Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｍａｒ　Ｄｒｕｇｓ，２０１２Ａｐｒｉｌ，Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．２