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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
PCR技术在海洋生物多肽毒素研究中的应用
郑晓冬 李宝珠 彭超 高炳淼 朱晓鹏 陈心 长孙东亭 罗素兰
(海南大学热带生物资源教育部重点实验室 海南大学海口市海洋药物重点实验室，海口 570228)
摘 要: 随着 PCR反应技术的不断改进和完善，它们在现代科学研究、生产和生活检测中的应用也越来越广，并且极大
程度上促进了基因工程和蛋白质工程的快速发展。就 PCR技术在芋螺毒素、海蛇毒素、海葵毒素及水母毒素等海洋生物多肽
毒素基因克隆研究中的应用作简要介绍。
关键词: PCR技术 海洋生物多肽毒素 芋螺毒素 海蛇毒素 海葵毒素 水母毒素
Application of PCR in Marine Peptide Toxins
Zheng Xiaodong Li Baozhu Peng Chao Gao Bingmiao Zhu Xiaopeng Chen Xin Zhangsun Dongting Luo Sulan
(Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education，Hainan University，Key Lab for Marine Drug of Haikou，Haikou 570228)
Abstract: With the great improvement and development，polymerase chain reaction(PCR)has been widely applied in modern sci-
entific research，production and human life，which largely promotes gene engineering and protein engineering． This review mainly focus
on the application of PCR in gene cloning research of marine biologiealc toxins，such as conotoxins，sea snake toxins，anthoplerin toxins，
and jellyfish venom etc．
Key words: PCR Marine creature peptide Conotoxin Sea snake toxins Anthoplerin toxin Jellyfish venom
收稿日期:2011-01-11
基金项目:国家自然科学基金项目(30860368) ，重大新药创制国家科技重大专项课题(2009ZX09103-644) ，海南大学创新团队(hd09xm02)与重
点科研项目(hd09xm15)
作者简介:郑晓冬，女，硕士研究生，研究方向:海洋药物与生物技术;E-mail:dong2942@ 126． com
通讯作者:罗素兰，女，教授，博士生导师，研究方向:海洋药物与生物技术;E-mail:luosulan2003@ 163． com
海洋是生命的起源地，它占地球表面积的
71%，蕴藏着地球上 80%以上的生物物种。海洋生
物中蕴藏着大量结构新颖、生理活性和功能独特的
生物活性物质及其基因，这使海洋生物成为具有独
特功能和药用价值的生物活性物质的重要源泉。而
海洋生物毒素是海洋活性物质中研究发展最迅速的
领域之一，也是海洋新型药物研究的热点［1］。
海洋生物毒素种类多，分布广，结构奇特，活性
广泛且活性强。其中，由基因直接编码的多肽蛋白
毒素是天然海洋生物毒素中毒性最强的。比较具有
代表性的海洋多肽类毒素包括芋螺毒素、海蛇毒素、
海葵毒素、水母毒素和海胆毒素等。这些多肽毒素
具有毒性作用强烈、药效高和作用剂量小等特点。
由于天然的海洋生物毒素含量极低，而且它们均须
提取于海洋生物活体，但是传统的提取和分离纯化
生物活性物质的方法不仅费时、费力、产量小、纯度低
及资源耗量大，还会受到季节、产地和物种资源的限
制，这些都成为研究、应用和发展海洋生物毒素的限
制因素。加之提取毒素对海洋生物而言多为毁灭性
的，并且随着海洋多肽毒素研究的日益发展，每年有
成千上万的海洋生物因被用于采集活性成分或工艺
品开发而导致其许多种群数量急剧下降，这不仅打破
了原有的生态平衡，更甚者会导致某些物种的灭绝。
有幸的是，由于海洋肽类毒素是由基因编码产
生的，随着生物技术的发展，越来越多的科学家们着
力于用基因工程的手段发现更多的多肽毒素基因，并
借助人工化学合成、蛋白质重组表达、蛋白质化学、生
理学和药理学等技术方法合成和表达相应的多肽毒
素及研究其生理活性和分子生物学机理。此外，海洋
生物肽类毒素分子量相对较小，可以通过人工合成和
基因工程技术进行重组表达、大批量生产。因此，在
保存基因资源和保护生物资源的同时，发掘更多具有
2011 年第 7 期 郑晓冬等:PCR技术在海洋生物多肽毒素研究中的应用
应用价值的毒素及其基因，利用基因工程技术开发毒
素基因资源和应用有着重要和长远的意义。
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，
PCR) ，即 PCR反应技术，是由美国 Cetus 公司人类
遗传研究室的科学家 Mullis 于 1983 年发明的一种
能在生物体细胞外通过酶促合成反应快速扩增两段
已知序列之间的 DNA序列的方法，又称无细胞分子
克隆技术［2］。目前，PCR 技术已被广泛应用于分子
生物学、工业、农业、食品科学医药学和法医学等各
领域，而其技术本身也获得长足进步，可靠性不断提
高，因而具有更广阔的发展前景。
自 PCR技术诞生起至今 20 多年以来的不断发
展与进步，它已经成为基因工程技术的核心内容，以
及发现新基因、研究基因结构和基因表达调控不可
或缺的重要手段。
1 PCR技术简介
PCR反应的主要过程是，先在临近沸点的高温
下双链模板 DNA 变性形成两条单链 DNA，然后在
低温下引物与单链 DNA互补序列结合，最后在适温
下 DNA聚合酶以互补合成的 DNA 链为起点，以单
链 DNA 为模板并利用 4 种脱氧核苷三磷酸合成新
的 DNA互补链。在整个反应过程中，高温变性、低
温退火、适温延伸等 3 个步骤反复循环，每一循环中
所合成的新链，都可以作为下一循环中的模板。经
过数次循环后，特定 DNA序列的产量随着循环次数
呈指数增加。对于每一个特定的应用而言，需要对
PCR条件进行优化，以探索选择最佳的 PCR 条件，
获得高产率、高纯度的特异产物。
PCR技术发展至今，经过不断地改进和完善，
已经形成了多种以 PCR 基本原理为基础的不同方
法，并且广泛应用于不同的研究领域，具体见表 1。
表 1 各类主要 PCR方法及其比较
种类 模板 引物 特点 应用
普通 PCR［2］
反转录 PCR［3］(reverse tran-
sc-riptase-PCR，RT-PCR)
反向 PCR［2］
(inverse PCR，IPCR)
荧光定量 PCR技术［5］(Re-
al-time fluorescent quantita-
tive PCR，FQ-PCR)
巢式 PCR［6］(nested PCR，
nPCR)
cDNA 末端快速扩增［7］
(rapid amplification of cD-
NA ends，RACE)
基因组 DNA或 cDNA
以 RNA 为模板进行反转
录扩增获得的 cDNA
酶切后进行环化的环状
DNA分子
DNA或 RNA
DNA
以 RNA 为模板进行反转
录扩增获得的 cDNA
同模板完全或不完全互补
的寡核苷酸序列
通用引物和特异引物
与已知序列互补结合的寡
核苷酸序列
与已知序列互补结合的寡
核苷酸序列
需要两套引物
通用引物和特异引物
模板不受限制
以少量的 mRNA构建大容
量的 cDNA文库
对酶切和环化体系的条件
要求较高
在 PCR 反应体系中加入
一种荧光基团，可实时监
测产物量的变化
需进行两轮 PCR，第二套
引物依第一套引物扩增的
序列设计
扩增已知 cDNA 序列的 5
和 3-末端，可弥补 RT-
PCR技术的不足
克隆、定点突变
克隆 mRNA 的 5和 3-
末端序列、构建 cDNA
文库
探索已知序列两侧的
未知序列、从总 RNA
中已知序列克隆全
长 cDNA［4］
用于 DNA或 RNA的定
量检测及基因表达研
究的检测
提高扩增目的 DNA 片
段的特异性
扩增已知 cDNA 片段
上下游序列，经拼接可
获得 cDNA 全长基因
序列［8］
随机扩增多肽 DNA 分
析［2］ (randon amplifiied
polymorphic DNA，RAPD)
基因组 DNA 多对随机引物
能在无分子遗传背景情况
下对物 种 基 因 组 进 行
DNA多态性分析［9］
测定两个生物体基因
组之间的 DNA 亲缘
关系
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
此外，在 PCR技术上发展起来的用于分子生物
学研究的还有长距离 PCR(long distance PCR，LD-
PCR)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length
polymorphism，AFLP)、多重 PCR 和等位基因特异性
PCR等。
2 PCR技术在海洋生物多肽毒素基因及新
毒素发现方面的应用
2. 1 芋螺毒素
芋螺毒素(conotoxin，CTX)是由热带海洋中肉
食性软体动物芋螺(Conus)分泌的毒液中的一大类
活性多肽，用于麻醉猎物和防御敌害。近几十年来
的研究表明，CTX通常是由 7 － 46 个氨基酸残基组
成的，富含半胱氨酸(Cys)的动物神经肽毒素。它
们化学结构新颖，生物活性强，作用靶位的选择性
高，已成为药理学和神经科学的有力工具和新药开
发的新来源。
全世界约有 500 多种芋螺，在世界各暖海域均
有分布。每种芋螺的毒液中含有近 2 000 种活性多
肽。不同种芋螺所含的活性肽不同，即使同种芋螺
因海域不同，其毒素成分也可存在差别。因此，自然
界中存在约 50 万种活性不同的 CTX，是一个丰富的
天然神经肽库［10］。目前国内外对 CTX 的研究已深
入到分子生物学领域，且由于 CTX是基因直接表达
的产物，现代基因工程技术促进了 CTX的研究与开
发。因此，研究 CTX 基因的结构和生物合成过程，
寻找新 CTX基因、以合成相应的蛋白质以研究其蛋
白质折叠机制及其药物活性等方面已取得较快发
展。每个 CTX均由单一的 mRNA编码，在体内先合
成由 50 － 120 个氨基酸残基组成的无活性多肽前体
(precursor) ，它们从 N 端至 C 端可分为信号肽区域
(sigal peptide)、中间前肽区域(pro-region)和成熟肽
区域(mature peptide)。其中，信号肽区域具高度的
保守性［11］;成熟肽区域则高度变化产生多种靶向特
异性的毒素小肽，这正是芋螺毒素分子多样性的基
础。无活性的芋螺多肽前体须经蛋白酶去除信号肽
序列和中间前肽序列等不同程度的翻译后加工过
程，方可生成有活性的成熟肽［12］。目前国际上主要
采用的分类原则就是根据高度保守的信号肽序列，
将 CTX分为 A、M、O、P、S、T和 I 等多个超家族［13］。
在此基础上，根据每个成员保守的半胱氨酸骨架，结
合其药理学活性，将之进一步分为若干个家族。又
可按照其作用靶位的不同，分为 α、μ、ω、κ、δ、ψ、σ、
ρ、γ及加压素、惊厥剂和睡眠肽等［14］。同一超家族
的 CTX成员具有高度保守的信号肽和高度保守的
二硫键连接方式［15］。
目前，根据 CTX基因超家族中的保守序列设计
引物，通过 PCR 克隆技术，从芋螺基因组 DNA 和
cDNA文库中筛选新型 CTX 基因，成为发现新型
CTX基因的重要方法。根据所获的新基因序列，推
测相应的芋螺毒素氨基酸序列，通过人工合成或重
组表达并进行生物活性检测，是筛选和研究新型
CTX的重要手段。
2. 1. 1 从芋螺基因组 DNA中克隆毒素基因 从芋
螺毒管、毒腺或其他组织中提取基因组 DNA，根据
高度保守的信号肽基因序列或内含子序列及 3端
非翻译区基因(3-UTR)序列，设计 CTX各个超家族
基因的特异 PCR 引物，通过 PCR 扩增和序列分析
方法，从基因组 DNA 中克隆新型毒素基因是分离
CTX基因的主要方法，为研究新型 CTX及其分子特
征的重要途径之一。
国内外科学工作者已从不同种芋螺的基因组
DNA中用 PCR方法克隆到多种 CTX。罗素兰课题
组已从菖蒲芋螺基因组中克隆到 2 个新 CTX 基因
(GenBank登录号:AY316159，AY316160)。部分 CTX
基因组基因编码产生的毒素肽及其特征如表 2
所示。
另外，本课题组根据 α-芋螺毒素高度保守的
内含子基因序列及 3-UTR 所设计的特异 PCR 引
物，已从织锦芋螺(C． textile)、桶形芋螺(Conus bet-
ulinus Linnaeus)、疣缟芋螺(Conus lividus Hwass)等
芋螺的基因组 DNA 中成功克隆多种 α-CTX(未发
表) ;另外，本研究还根据 α-CTX 高度保守的内含
子基因序列及 3-UTR设计反向 PCR产物，希望通
过反向 PCR 扩增编码 α-CTX 基因的启动子序列
(未发表) ，为研究 CTX 基因的表达调控、CTX 的
化学合成、体外重组表达及其活性研究和应用提
供基础。
2. 1. 2 从芋螺 cDNA 文库中筛选毒素基因和毒素
cDNA的克隆 真核生物的基因组 DNA 十分庞大，
约是 mRNA和蛋白质的 100 倍，因而从 DNA筛选目
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2011 年第 7 期 郑晓冬等:PCR技术在海洋生物多肽毒素研究中的应用
表 2 从基因组 DNA中筛选到的 CTX基因
基因名称 种类 超家族 S-S motif 氨基酸序列 GenBank序列号 参考文献
GIC C． geographus A CC-C-C GCCSHPACAGNNQHIC AF526267 ［16］
VI C． vexillum O C-C-CC-C-C DRCQRANFVCDAFHHAAVCCEGVCVLVCA AY316159
VII C． vexillum O C-C-CC-C-C DRCQRANFVCDAFHHAAVCCEGVCVLVCAW AY316160
PeIA C． pergrandis A CC-C-C GCCSHPACSVNHPELC DQ008450 ［17］
Lp1. 1 C． leopardus A CC-C-C GCCARAACAGIHQELC AY580321 ［18］
QcaL-1 C． quercinus A C-C-C FCSDPPCRISNPESCGWEP DQ311058 ［18］
Ac4. 3b C． achatinus A CC-C-C-C QKELVPSKITTCCGYSPGTACPSCMCTNTCKKKNKKP DQ311075 ［18］
E1 C． ebraeus O1 C-C-CC-C-C ECTDSGGACNSHDQCCNEFCSTATRTCI FJ834437 ［19］
的基因片段较费时费力，而通过构建 cDNA 文库筛
选则较简便快捷。构建芋螺毒素 cDNA 文库，根据
芋螺各超家族信号肽及 3-UTR，设计 CTX各个超家
族基因的特异 PCR引物，从中筛选新毒素基因已成
为当前研究新 CTX 和寻找新的潜在的 CTX 药物的
重要途径之一。迄今为止，国内外已构建了地纹芋
螺(C． geographus)、幻芋螺(C． magus)、勇士芋螺
(Conus miles Linnaeus)、疣缟芋螺(Conus lividus
Hwass)、金翎芋螺(C． penaceus)、桶形芋螺(Conus
betulinus Linnaeus)和织锦芋螺(C． textile)等多种芋
螺的 cDNA文库。
随着 PCR 技术的广泛应用，尤其是 cDNA 的
RACE扩增方法和 RT-PCR 法等 cDNA 基因克隆的
方法在 CTX基因分离中的应用，新的基因序列数量
在近年来激增。Duda 等［20］从 C． ebraeus 中分离到
104 个四环 CTX的 cDNA序列。Conticello［21］用 RT-
PCR法从 5 种芋螺(C． arenatus，C． pennaceus，C． tes-
sulatus，C． ventricosus 和 C． textile)中获得了 170 个
CTX的 cDNA序列。军事医学科学院生物工程研究
所的黄培堂教授研究小组对 CTX 开展了一系列的
系统研究，包括毒素 cDNA文库的构建、CTX基因的
结构特征研究和毒素的生物合成等。其课题组从中
国海南线纹芋螺(C． striatus)中发现了 6 种新 O-超
家族毒素的 cDNA序列［22］，以及从织锦芋螺(C． tex-
tile)中克隆到两种 α-CTX基因［23］。
本课题组已构建了织锦芋螺(C． textile)、独特
芋螺(Conus caracteristicus Fischer)、桶形芋螺(Conus
betulinus Linnaeus)、勇士芋螺(Conus miles Linnae-
us)、疣缟芋螺(Conus lividus Hwass)、大尉芋螺(Co-
nus capitaneus Linnaeus)等几种芋螺毒管 cDNA 文
库，并且已从其 cDNA 文库中筛选到上百种新 CTX
基因，目前正在进行毒素肽的合成及其具体功能的
鉴定。同时，还通过荧光定量 PCR 技术，用 cDNA
克隆方法大量克隆新型 CTX基因，除了能检测基因
表达情况外，也减少了普通 PCR筛选克隆基因的步
骤，大大加快了发现新基因的速度和效率。芋螺毒
素 cDNA文库的建立不仅有助于解决芋螺材料的来
源问题，而且是对具有潜在药用价值的基因资源的
一种保护。部分 CTX 基因 cDNA 对应产生的毒素
肽及其特征如表 3 所示。
2. 2 海蛇毒素
海蛇属于海蛇科(Hydrophiidae) ，大约有 50 种，
广泛分布于印度洋和太平洋的热带及亚热带海域。
海蛇毒液中含有 20 种以上的活性物质，包括酸性磷
酸酶、磷脂酶 A、长链和短链神经毒素等，且大多数
属于低分子量蛋白质［31］。它们均能高度专一性地
与运动终板烟碱乙酰胆碱受体结合，阻断神经传导
成为突触后神经毒素，成为研究烟碱乙酰胆碱受体
的重要工具［32］。由于海蛇毒素(sea snake toxins)具
有多种多样的毒理和药理活性，且在治疗肿瘤、心血
管及神经系统疾病方面有极高的药用价值［33］。因
此，利用现代分子生物学和药理学等方法来研究海
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
表 3 从 cDNA文库中筛选或 cDNA克隆到的 CTX基因
基因名称 种类 超家族 S-S motif 氨基酸序列 GenBank序列号 参考文献
It1a C． litteratus A CC-C-C GCCARAACAGIHQELCGGGR DQ345364 ［24］
TeA21P C． textile A CC-C-C PECCSDPRCNSSHPELCG DQ141135 ［25］
It14a C． litteratus L C-C-C MRPPLCKPSCTNC DQ345367 ［24］
BuIIIA C． bullatus M CC-C-C-CC CCKGKRECGRWCRDHSRCC FJ240165 ［26］
Leo-O1 C． leopardus O1 C-C-CC-C-C DCVKAGTACGFPKPEPACCSSWCIFVCT EF467316 ［27］
TeA61P C． textile O1 C-C-CC-C-C CLDAGEVCDIFFPTCCGYCILLFCA DQ141160 ［28］
MqJ42P C． magus O1 C-C-CC-C-C CNNRGGGCSQHPHCCSGTCNKTFGVCL DQ141151 ［29］
LiC42P C． lividus O1 C-C-CC-C-C SCGHSGAGCYTRPCCPGLHCSGGHAGGLCV DQ141147 ［30］
Lt15a C． litteratus O2 C-C-CC-C-C-C-C ECTTKHRRCEKDEECCPNLECKCLTSPDCQSGYKCKP DQ345376 ［24］
Lt9a C． litteratus P C-C-C-C-C-C VSIWFCASRTCSAPADCNPCTCESGVCVDWL ABC74995 ［24］
Leo-T1 C． leopardus T CC-CC CCPNLFYCCPD EF467314 ［27］
TxXIIIA C． textile T CC-CCC TSDCCFYHNCCC AF214956 ［24］
蛇毒素的有效成分及作用机理，并对其活性蛋白进
行基因工程重组表达，使海蛇毒素成为生物科学研
究的重要工具和新药开发的重要源泉。
中山大学徐安龙及其实验室 2000 年成功构建
了一个高质量的平颏海蛇(Hydrophiinae，Lapemis
hardwickii Gray)毒腺的 cDNA 文库，这是国内首个
海蛇 cDNA文库。该课题组通过构建平颏海蛇毒腺
cDNA文库及文库克隆的随机测序和 PCR 筛选，发
现了 38 个海蛇新基因，包括 3 个同源的短神经毒素
基因、2 个长链神经毒素基因，3 个磷酸酯酶 A2
(phospholipase A2，PLA2)全长 cDNA 基因和 2 个半
胱氨酸丰富毒蛋白基因共 10 个海蛇毒素基因(表
4)。随后通过构建体外表达体系，大量获得海蛇神
经毒素，初步进行了毒理和活性研究，结果表明来自
平颏海蛇的神经毒素具有良好的镇痛效果，并且不
具有成瘾性［34］。该课题组成员钟肖芬等［35］对从所
构建的平颏海蛇毒腺 cDNA文库所获得的 3 个同源
短神经毒素基因所编码的氨基酸序列进行重组表达
和生物活性研究发现，它们虽然只存在第 46 个氨基
酸残基的差异，但其生理活性却存在明显的差异。
由此推测，第 46 位氨基酸与短链神经毒素对烟碱型
乙酰胆碱受体结合功能相关。另外，该课题组成员
杨文利等［36］对从所构建的平颏海蛇毒腺 cDNA 文
库所获得了 3 个 PLA2全长 cDNA 基因，这不仅丰富
了蛇毒 PLA2基因家族，更为深入开展海蛇 PLA2的
重组表达及结构与功能关系研究、探索其活性机理
提供了新的线索。
半环扁尾海蛇(Laticauda semifasciata)毒液主要
的成分是神经毒素，短链神经毒素(erabutoxin，ETX)
是其中之一。ETX 能与神经肌肉接头的乙酰胆碱
受体竞争性结合，从而阻断神经信号传递，因此常被
用于神经科学研究。随着分子生物学的发展，用基
因工程合成 ETX 的技术已日渐成熟。北京防化学
院的吴方晖等［37］运用 PCR技术成功克隆 ETX基因
并构建硫氧还蛋白-ETX(Trx-ETX)融合蛋白表达载
体，使融合蛋白能够在大肠杆菌胞内表达，并且经活
性检测结果表明，融合蛋白能阻断神经信号的传递。
部分利用 PCR 技术克隆到的海蛇毒素基因及
其相应的毒素，见表 4。
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2011 年第 7 期 郑晓冬等:PCR技术在海洋生物多肽毒素研究中的应用
表 4 利用 PCR技术克隆到的部分海葵和海蛇毒素基因及其编码产生的毒素
基因 毒素 种类 PCR GenBank登录号 文献
海蛇 sn12 SN12 Lapemis hardwickii from cDNA ［35］
sn36 SN36 Lapemis hardwickii from cDNA ［35］
sn160 SN160 Lapemis hardwickii from cDNA ［35］
PLA2-8 PLA2-8 Lapemis hardwickii from cDNA AF144319 ［36］
PLA2-9 PLA2-9 Lapemis hardwickii from cDNA AF205378 ［36］
PLA2-384 PLA2-384 Lapemis hardwickii from cDNA AF144320 ［36］
海葵 Ap-QD2 Anthopleura qingdaoensis Pei from cDNA ［41］
hk-2 Anthopleura sp． from cDNA ［42］
hk-6 Anthopleura sp． from cDNA ［42］
hk-16 Anthopleura sp． from cDNA ［42］
2. 3 海葵毒素
海葵(anthopleura)属于腔肠动物门(soelentera-
ta) ，在热带和温带海域广泛分布。它的口周围有许
多触手，触手上分布着腔肠动物所特有的刺丝囊，能
分泌大量的肽类毒素。根据作用方式的不同，可将
这些肽类毒素分为海葵神经毒素(sea anemone neu-
rotoxin，SAN)、海葵溶细胞素(sea anemone cytolysin，
SAC)和钾离子通道抑制剂(Sea anemone potassium
Channel inhibitor)［32］。这些海葵毒素(anthoplerin
toxin)能特异作用于神经和肌肉可兴奋细胞膜上的
关键靶位即神经受体或离子通道，从而影响一系列
细胞调控活动，具有广泛的神经系统活性、心血管系
统活性和细胞活性。因此，海葵毒素作为分子探针
用以研究钠通道有巨大潜力，并且发现更多有应用
前景的海葵毒素并进行基因重组、表达，极具重要
意义。
对于海葵神经毒素的研究始于 1976 年美国夏
威夷大学 Shibata 等［38］的工作，他们从黄海葵(An-
thopleura xanthogrammica)中分离纯化了海葵神经毒
素 A(anthopleurin A，Ap-A)和海葵神经毒素 B(an-
thopleurin B，Ap-B)两种毒素。1992 年，美国辛辛那
提大学医学院 Gallagher 等［39］根据天然的 Ap-B 的
氨基酸序列体外合成了编码 Ap-B 的基因，并将其
在大肠杆菌中进行了表达，所获得的重组蛋白与天
然的 Ap-B在氨基酸组成、序列、二级结构、高压液
相图谱及生物活性方面相同，这为定点突变氨基酸
的方法研究海葵神经毒素的结构与功能开辟了一条
道路。
1996 年，复旦大学生命科学学院生物化学系王
维荣等［40］从青岛侧花海葵(Anthopleura qingdaoensis
Pei)中提取出两种活性强心多肽，它们的氨基酸序
列与 Ap-B氨基酸序列高度一致，分别被命名为 Ap-
QD1 和 Ap-QD2。他们以分析得到的氨基酸序列，
按照毕赤酵母的偏爱密码子设计并合成 Ap-QD2 的
cDNA。随后将合成的 cDNA 序列通过 PCR 扩增及
一系列分子克隆操作导入毕赤酵母表达载体
pPICZαC中，以电穿孔的方法转化毕赤酵母 GS115 和
KM17，并进行转化子表达及高拷贝的筛选，最终获得
有天然生物活性的 Ap-QD2基因工程产物(表 4)［41］。
2001 年，中山大学刘文华等［42］根据 Ap-B 两端
的保守氨基酸序列设计简并引物，运用 RT-PCR 的
方法，构建了侧花海葵(Anthopleura sp．)触手 cDNA
文库，并从中克隆出了 15 个长度均为 141 bp 的毒
素基因，它们分别编码 3 个长度为 47 个氨基酸的神
经毒素蛋白，hk-2、hk-6 和 hk-16(表 4)。2002 年，
该实验室采用 cDNA 文库构建技术，从玫瑰红绿海
葵(Sagartia rose)触手中筛选到了海葵溶细胞素、海
葵荧光蛋白、泛醌 －细胞色素 c 还原酶、延伸因子、
铁蛋白和核黄素激酶，核糖体蛋白等多个全长 cD-
NA克隆，并结合生物信息学分析方法，对这些功能
基因进行了初步分析。对海葵文库新基因的进一步
研究，将会为海洋生物功能基因的研究开发提供新
的线索［43］。
虽然 Gallagher 等于 1992 年首次在大肠杆菌中
以融合蛋白的形式表达了有天然活性的 Ap-B，但表
达量非常低，且分离纯化繁琐。毕赤酵母作为真核
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
表达体系，有利于对表达蛋白的正确加工、折叠、翻
译后修饰及可分泌，且菌体易繁殖和遗传操作方便，
已成为一个较好的基因工程分泌表达体系，许多外
源基因在该系统中得到了成功的分泌表达。吉林大
学成岩等［44］采用 DNA 重组技术，按照毕赤酵母的
偏爱密码子，设计并合成了带有限制性内切酶黏性
末端的 Ap-B基因序列，进而构建重组 Ap-B 毕赤酵
母真核表达体系，为基因工程生产 Ap-B 药物奠定
理论和试验基础。
2. 4 水母毒素
水母(jellyfish)也属于腔肠动物门(Soelentera-
ta) ，亦称海蜇，它们种类多、数量大且广泛分布于温
带、亚热带及热带海域［45］。水母的触手中也分布有
能分泌大量毒液的刺丝囊，肽类毒素是其中主要的
毒液成分，它们结构新颖独特，具有溶血性、酶活性、
神经毒性、皮肤坏死、肌肉毒性、肝脏毒性、心脏毒性
以及细胞毒性等多种生物活性［46］。这些毒素通过
作用于离子通道，对心脏、血管产生影响，进而引起
血压和心电图改变及造成细胞毒性。因此，水母毒
素(jellyfish venom)有望开发为作用于心血管系统、
中枢神经系统和肌肉的药物［47］。
近几年来，科学工作者主要集中研究刺胞毒素
的分离提取、功能基因的克隆、毒素的单克隆抗体检
测等。宁波大学苏秀榕等［48］首次对水母毒素的分
子标记进行了研究。他们选用海蜇(Rhopilema escu-
lentu)和口冠海蜇(Stomolophus meleagr)等两种毒性
不同的水母的刺细胞 DNA为模板，利用 RAPD技术
对海蜇刺胞组织的 DNA 标记进行研究。研究结果
表明，两种不同水母刺胞组织的 RAPD 扩增结果差
异明显，可作为毒性强弱和种间分类的分子标记，为
进一步研究毒素的生理生化特性提供参考资料。
2. 5 海胆毒素
海胆属于棘皮动物门(Echinodermata) ，是海洋
中一类常见的无脊椎动物，在世界各大海域的海底
中均有分布。海胆中的毒素主要由叉棘(pedicel-
lariea)和棘(spine)产生。海胆毒素可引起动物呼
吸困难、肌肉麻痹、溶血、引起心脏激活以及使肌肉
对非直接刺激不起反应。因此，海胆毒素具有潜在
的药用价值［49］。
不同于以上几种已深入研究达到编码毒素的基
因水平的海洋肽类毒素，至今为止，尚未有编码海胆
毒素的基因的专门报道。但值得一提的是，2006 年
10 月 Science杂志上刊登了海胆基因组测序的结果，
该基因组计划阐述了海胆的基因组及基因产物，分
析了这个全长为 814 Mb、编码了 23 300 个基因的序
列［50］。海胆基因组计划的完成，为海胆基因组学的
研究提供了广阔的空间。相信随着研究的深入，海
胆中很多基因包括海胆毒素基因会逐渐揭开其神秘
的面纱。
3 PCR反应技术在海洋肽类毒素研究中的
应用前景
近 10 年来，随着海洋开发步伐的加快和综合运
用基因工程技术、蛋白质工程等的广泛应用，海洋活
性物质和药物的研究取得了显著进展，并且前景广
阔。由于海洋生物多肽毒素是由单个基因或基因簇
编码、调控和表达的，获得这些基因即预示着可获得
这些活性化合物的序列，进而通过人工合成、基因工
程和蛋白质工程等方法大量生产纯度高的毒素物
质，有利于进行后续的活性研究和新药研发。至今
为止，已有多个海洋肽类毒素药用基因如芋螺毒素、
海蛇毒素和海葵毒素等的基因已成功克隆，并对其
进行修饰和改造后，转入细菌和酵母中得以表达;一
旦构建能产生活性产物的基因工程菌，即可进行深
度药物开发。而 PCR 技术作为基因工程技术的核
心内容，在发现更多海洋多肽毒素新基因的应用也
越来越广，为研究其相应毒素的生理和药理活性，使
海洋生物多肽毒素成为药理学和神经科学的有力工
具和新药开发的新来源奠定坚实的基础。
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