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（编辑：梁进权）
收稿日期：2013-03-13
作者简介：马春涛，男，博士，研究方向：髋膝关节疾病诊疗。Email：mct1983@163.com。通讯作者：曾意荣，博士，教授，硕士生导师，主任
医师，研究方向：髋膝关节疾病的基础与临床研究。Email：zeng6612@163.com。
基金项目：国家自然科学基金项目（81273784）。
木豆叶对激素干预后的骨髓间充质干细胞的蛋白质组学研究
马春涛 1，2，曾意荣 3，曾建春 3，韩旭东 1，齐新宇 1，陈锦伦 1（1. 广州中医药大学，广东 广州 510405；2. 三
亚市中医院，海南 三亚 572000；3. 广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405）
摘要：目的 观察大剂量激素及木豆叶干预后骨髓间充质干细胞（MSCs）的蛋白质变化，探讨木豆叶治疗股骨
头坏死的作用机理。方法 培养人MSCs，设正常对照组、模型（激素）组及木豆叶含药血清组，通过双向电泳
比较正常对照组与模型组、模型组与木豆叶含药血清组的蛋白质表达差异，通过质谱分析对差异蛋白质进行初
步鉴定。结果 与正常对照组比较，模型组MSCs有38个蛋白点发生显著变化；与模型组比较，木豆叶含药
血清组MSCs有28个蛋白点发生显著变化，MCSc中热休克蛋白（HSP）、含缬络肽蛋白（VCP）及COP9表达水平
显著升高。结论 大剂量激素干预可造成MSCs内脂肪代谢失调、分化异常，木豆叶可抑制MSCs凋亡，并可能
通过MAPK途径，影响其成骨分化及修复骨坏死而发挥治疗股骨头坏死的作用。
关键词：股骨头坏死；骨髓间充质干细胞；激素；蛋白质组学
中图分类号：R285.5文献标志码：A 文章编号：1003-9783（201）04-0351-05
doi：10.3969/j.issn.1003-9783.2013.04.007
Proteomics Study on Effect of Folium Cajani on Hormone-treated Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells
MA Chuntao1，2，ZENG Yirong3，ZENG Jianchun3，HAN Xudong1，QI Xinyu1，CHEN Jinlun1（1. Guangzhou
University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China；2. Sanya Traditional Chinese Medical
Hospital，Sanya 572000 Hainan，China；3. The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese
Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China）
Abstract： Objective To investigate the changes of protein expression in bone marrow mesenchymal stem cells
（MSCs）treated by large doses of hormones and Folium Cajani，and to explore its possible therapeutic mechanism for
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Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology，2013 July，Vol． 24 No． 4
激素的使用是导致非创伤性股骨头坏死的常见
病因，在我国是仅次于饮酒的第二大发病因素，关
于其致病机理的认识目前尚不统一，有脂肪栓塞、
骨细胞脂肪变性等多种假说，有研究认为大剂量激
素可诱导MSCs分化为脂肪细胞，造成骨细胞分化不
足，导致骨细胞坏死[1]。木豆叶是豆科植物木豆的干
燥叶片，有活血化瘀、消肿止痛、补肾壮骨、去腐
生肌之功效，实验证实木豆叶能有效治疗股骨头坏
死，有增强骨坏死修复、促进血管生成及延缓细胞
凋亡的作用[2-4]。有报道[5]发现木豆叶成分的生脉成骨
片对激素诱导下 MSCs 成脂分化有拮抗作用，但其
具体机制尚不明确。本研究拟通过蛋白质组学的方
法，探寻激素诱导下的 MSCs 以及诱导过程中加入
木豆叶含药血清后 MSCs 蛋白质表达的变化，阐释
激素性股骨头坏死的致病机理及木豆叶防治股骨头
坏死的机理。
1 材料与方法
1.1 动物 SD 大鼠 20 只，SPF 级，雌性，体质量
160～180 g，南方医科大学动物实验中心，许可证
号：4402101564。
1.2 试剂 袁氏生脉成骨片，广州市康元药业有限公
司，批号：121003，成分为木豆叶；甲强龙，辉瑞
公司，批号：Z01579；L-DMEM 培养基、南美胎牛
血清、胰酶，GIBCO公司；碘乙酰胺（IAA）、IPG胶
条、pharmalyteTM3-10 for IEF，GE 公司；四甲基乙
二胺（TEMED）、硝酸银，Sigma 公司；二硫苏糖醇
（DTT），Biosharp 公司；30 %甲叉双丙烯酰铵溶液
（Bis）、过硫酸铵（APS）、蛋白定量试剂盒，Bio-rad
公司；五水合硫代硫酸钠、冰醋酸、甲醛、盐酸，
广州化学试剂厂；甲醇，广东光华科技股份有限公
司；矿物油，MP Biomedicals公司；甘油、尿素、甘
氨酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸钠
（SDS）、琼脂糖，上海生工生物公司。
1.3 仪器 EttanTM IPGphor IITM等电聚焦仪、EttanTM
DALTsix 垂直电泳仪、扫描仪及 ImageMasterTM2D
Platinum 6.0 分析软件，GE 公司； UVmini-1240 紫
外可见分光光度计，Shimadzu 公司；Centrifuge
5804R 离心机，德国 Eppendorf 公 司；Autoflex
speedTMMALDI-TOF质谱仪，Bruker Dalton公司。
1.4 方法
1.4.1 木豆叶含药血清及正常对照组血清制备 SD大
鼠随机分为中药组和正常对照组，中药组灌胃给予生
脉成骨片混悬液（0.6 g·k-1），每日1次，连续灌胃1
周，最后1次给药后2 h经腹主动脉采血，室温静置
2 h 后置 2500 r·min-1离心 10 min，收集上清液，
56℃水浴灭活30 min，过滤后置-20℃冰箱保存备
用。正常对照组采用等量生理盐水灌胃，采血及保
存方法与中药组相同。
1.4.2 MSCs 的分离、纯化、扩增 选择髋骨性关节
炎行人工关节置换患者，术中使用含肝素的注射
器吸取股骨近端骨髓组织约 10 mL，将细胞悬液贴
壁缓慢注入到预置有等体积密度为 1.077 kg·L-1的
淋巴细胞分离液的试管内，以 2500 r·min-1离心 20
min，吸取中间的白色云雾状单核细胞层，PBS 漂
洗，1500 r·min-1离心 10 min，弃上清，加入含 10
%FBS 的 DMEM 培养液 10 mL 并接种于培养瓶内，
置入 37℃、5 %CO2饱和湿度培养箱中培养，3 d
换液1次。待细胞融合至80 %后用胰蛋白酶消化，
以1∶2传代培养。
1.4.3 MSCs干预 传至第3代的MSCs接种于75 cm2
femoral head necrosis.Methods The cultured human MSCs were divided into normal control group，hormone-treat
model group and group of serum containing Folium Cajani. Two-dimensional electrophoresis was used to compare the
protein expression difference in the three groups，and the protein spots with differential expression were analyzed by
mass spectrometry.Results A otal of 38 protein spots had differential expression in MSCs of the hormone-treat model
group as compared with the normal control group. In MSCs of Folium Cajani group，28 protein spots had differential
expression as compared with the hormone-treat model group，and heat-shock protein and COP9 expression levels were
obviously increased.Conclusion Large dose of hormones induce the disorder of lipid metabolism and differentiation of
MSCs，and Folium Cajani enhances the stress reaction and self protection，and promote its osteogenic differentiation
through MAPK pathway.
Keywords：Necrosis of the femoral head；Bone marrow mesenchymal stem cells；Hormone；Proteomics
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中药新药与临床药理 2013年 7月第 24卷第 4期
培养瓶，增殖至培养瓶80 %时分为3组：正常对照
组继续以含10 %FBS的L-DMEM培养基培养，模型
组及木豆叶含药血清组更换含10-5mol·L-1甲强龙的
L-DMEM培养基，干预3 d。正常对照组更换含10 %
正常对照组血清的L-DMEM培养基培养，模型组更
换含 10-5mol·L-1甲强龙和 10 %正常对照组血清的
L-DMEM培养基培养，木豆叶含药血清组更换含10-5
mol·L-1甲强龙和 10 %木豆叶含药血清的 L-DMEM
培养基培养，5 d后提取蛋白。
1.4.4 细胞蛋白提取纯化及定量 吸出细胞加入PBS
清洗3次，去除PBS后加入裂解液，将细胞团块吹
散后转移到EP管中超声处理，12000 r·min-1离心20
min，收集上清液分装至 EP管中，-20℃丙酮沉淀
过夜。过夜后12000 r·min-1离心 20 min，倒去上清
液后自然干燥，蛋白质团块-80℃保存备用。
1.4.5 双向电泳 取出蛋白质团块加再水化液200μL
溶解，Bradford法测浓度，蛋白质上样量为120μg，
尿素水化液加至 450μL 泡胀过夜后第一向等电聚
焦，等电聚焦完成后分别置于1 %DTT和2.5 %碘乙
酰胺的平衡缓冲液中平衡 15 min，再将 IPG 胶条
置于玻璃板间的凝胶面上，琼脂糖密封液封闭，
进行第二向电泳，待溴酚蓝指示剂到达胶底时关闭
电泳仪。
1.4.6 硝酸银染色 将凝胶置于固定液（40 %甲醇，
10 %醋酸）中摇床固定 30 min。水洗 5 min×6 次，
0.02 %硫代硫酸钠敏化1 min。水洗20 s×3次。置
于染色液（0.2 %硝酸银，0.02 %甲醛）中20 min，水
洗 20 s×3 次。置于显色液（3 %碳酸钠，0.05 %甲
醛，0.0005 %硫代硫酸钠）中显示到理想色度，5 %
醋酸终止后置于蒸馏水中。
1.4.7 图像扫描分析及蛋白质鉴定 扫描仪扫描保存
图像，见图 1。使用 ImageMaster 2D Platinum 6.0 图
像分析软件，搜索差异点，用针在凝胶相应点的边
缘划圈，将胶粒挑到EP管中进行酶切、肽段抽提、
点靶及质谱分析，利用flexAnalysis软件过滤基线峰、
识别信号峰。利用 BioTools软件搜索 NCBI 数据库，
寻找匹配的相关蛋白质。
2 结果
2.1 电泳凝胶图像分析 见图 2。与正常对照组比
较，模型组MSCs有38个蛋白点发生显著变化，其
中上调29个，下调9个。与模型组比较，木豆叶含
药血清组MSCs有28个蛋白点发生变化，其中上调
20个，下调8个。按模型组下调、模型组上调，木
豆叶含药血清组下调和上调的顺序，将蛋白分为 A
组、B组、C组和D组并按顺序用阿拉伯数字编号。
2.2 肽指纹图谱分析 见图3。将有显著性差异的蛋
白点经质谱分析，鉴定成功46个，Bio Tools软件搜
索NCBI数据库，得到5个重要差异的蛋白点，编号
分别为 A1，B66，D15，D31，D39。蛋白相关信息
见表1。
表 1 蛋白点相关信息
Table 1 Informations of protein spots
3 讨论
通过对差异蛋白的分析，我们发现其按功能分
别涉及细胞骨架，细胞迁移、黏附，能量代谢，信
号转导，分化增殖等方面，其中脂肪酸合成酶（fatty
acid synthase，FASN），非肌肉肌球蛋白重链（non-
muscle myosin heavy chain，NMHC），热休克蛋白
A1 B66 D15 D21 D31 D39
a. 正常对照组；b. 模型组；c. 木豆叶含药血清组
图 2 6个差异点在 3组中蛋白表达量
Figure 2 Expression of six distinct points in three groups（a：
control group，b：hormone model group，c：folium cajani group）
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
b c a a b c
0.04
0.03
0.02
0.01
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0
a b c a b c
0.03
0.02
0.01
0
b a c
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
a b c
0.06
0.04
0.02
0
序号
A1
B66
D15
D31
D39
名称
NMHC
FASN
HSP70
8isoform1variant
COP9 s5
variant
HSP27
检索号
gi|189036
gi|89257335
gi|62897129
gi|62087848
gi|662841
分子量
145623
30 68
71083
31467
22427
等电点
5.23
5.81
5.28
6.20
.83
覆盖率/%
13
46
36
27
37
得分
126
209
162
181
135
正常对照组 模型组 木豆叶含药血清组
图 1 各组 MSCs双向电泳图
Figure1 2-D electrophoresis images of there groups
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Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology，2013 July，Vol． 24 No． 4
图 3 差异点的肽指纹图谱
Figure 3 Peptide mass fingerprinting of the differential protein
In
te
ns
.
[a
.u
.]
1500
1000
500
0
1000 1500 2000 2500 3000 m/z
832.328
1790.885
1516.705
1155.658
917.467
976.4651275.700
1400.666
1430.718663.831
1869.961
1949.980 2088.958
2233.082
2493.132
In
te
ns
.
[a
.u
.]
6000
4000
2000
0
1000 1500 2000 2500 3000 m/z
842.517
873.471
1060.070
1177.542
1336.6031506.760
1571.767
1593.749
1805.901
1817.896
2097.046
2233.100
2345.181
2425.0882763.287 3338.642
In
te
ns
.
[a
.u
.]
4000
3000
2000
1000
0
994.556
832.309
1052.544
1199.672
1253.6061399.716
1487.689
1557.767
1653.823
1802.861
1816.877
1981.981
2109.987
2230.125
2340.096 2774.3002997.428
1000 1500 2000 2500 3000 m/z
In
te
ns
.
[a
.u
.]
4000
3000
2000
1000
0
776.447
1130.576
1271.056
1362.638
1022.411
1476.050
1562.803 2112.918
2233.037
2305.036
2411.075
A1 B66A1 B66
D15 D31
In
te
ns
.
[a
.u
.]
800
6000
4000
2000
0
774.389
831.508
961.449
1104.511
1256.638
1359.795
1516.690
1676.881
1810.875
1905.975
1964.8772132.031
2215.0462443.047
2691.276
2845.381
3008.3243183.6193337.744
1119.611
1163.623
1000 1500 2000 2500 3000 m/z
D39
（heat shock protein，HSP）和COP9对我们的研究有重
要意义。
FASN是体内合成内源性饱和脂肪酸的关键酶，
主要参与细胞的增殖、分化和机体能量及脂类代谢。
FASN通过影响细胞增殖与脂肪酸代谢，与癌症、肥
胖、2 型糖尿病和冠心病的危险因素密切相关。在动
脉粥样硬化的研究中，FASN的主要产物棕榈酸等饱
和脂肪酸为动脉粥样硬化斑块的主要成分[6-7]。FASN
还可利用NADPH还原酶通过缩合反应合成新生内源
性脂肪酸[8-9]，研究发现，巨噬细胞的FSAN被抑制后
胆固醇及甘油三酯含量均有所减少[10]。本实验中激素
干预后MSCs的FASN水平升高，表明激素可能引起
其脂肪代谢紊乱及内源性脂肪酸增多。
NMHC是非肌肉肌球蛋白II（NMII）的组成部分，
NMII可为细胞内分子运动提供动力，同时参与细胞
迁移、黏附、胞质分裂等各种生理活动，NMII被抑
制后会造成细胞黏附能力的下降，有研究发现小鼠
胚胎干细胞敲除，可发现细胞间黏附缺失，小鼠不
能发育成正常的内脏内胚层[11]。激素干预后的MSCs
的NMHC水平降低，表明其生长、黏附等多项生命
活动受到影响。
HSP是人体内的一种应激蛋白，在高温、感染、
创伤等应激状态下被诱导表达，HSP 可分为 5 类：
小分子HSP（sHSP），HSP60，HSP70，HSP90和HSP
110。HSP27属sHSP家族，可阻断应激状态下肌动
蛋白和肌动蛋白丝的分裂，从而维持细胞的结构[12]，
还可抑制 Cytc 释放和 Bax 介导的线粒体伤害[13]。
HSP70可通过阻止细胞色素C释放起到抗凋亡作用，
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并抑制凋亡诱导因子从而保护细胞[14]。本实验中木豆
叶含药血清组 MSCs中 HSP的升高说明其自我保护
能力增强。
COP9是一种核蛋白复合体，由S1-S8共8个亚
单位组成，介导细胞内广泛的信号传导。本实验发
现的S5参与了应激活化蛋白激酶（JNK）介导的丝裂
原活化蛋白激酶（MAPK）途经，MAPK 途径是调节
MSCs分化的细胞转导途径之一。JNK通路在转导胞
外信号至核转录因子时起重要作用。 有学者研究发
现发现JNK能改变骨钙素的mRNA水平，骨形态发生
蛋白2（BMP2）从转录水平活化JNK，从而诱导成骨
细胞分化[15-16]。本实验中木豆叶含药血清组COP9的
升高说明木豆叶可能对JNK通路产生影响。
综上所述，干细胞在受到大剂量激素的干预后，
NMII 被抑制影响了干细胞的正常生命活动，FASN
水平的提高，增加了MSCs内源性脂肪酸的产生，造
成脂肪代谢紊乱。骨坏死是骨组织破坏大于修复的
结果，激素的使用使血液黏稠度增高，血脂异常，
股骨头内由于栓塞等原因造成供血不足、骨细胞坏
死，上述两种蛋白的变化干扰了MSCs正常的分化、
修复作用，造成破坏大于修复，形成股骨头坏死。
木豆叶干预后MSCs的FASN没有显著变化，故不能
说明木豆叶有通过此途径减少细胞内源性脂肪酸生
成的作用，而 HSP 和 COP9 表达水平的显著升高，
提示其作用机理可能在于提高MSCs的应激性和自我
保护作用，同时通过MAPK途径促进了MSCs的成骨
分化从而加速修复骨坏死，这种促进成骨分化的机
制有待进一步的实验研究证实。
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（编辑：邓响潮）
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