全 文 ：Western Journal of Traditional Chinese Medicine,2012 Vol.25 No.11
中国科技 核心期刊
方 药·道地药材
植物内生菌(endophyte)是指生活在健康植
物组织和器官内部的真菌或细菌，是与宿主植物
在长期共同进化过程中衍生的一类微生物［1］。内
生菌与宿主植物有着密切的共生关系，内生菌在
演化过程中发生了基因重组并获得宿主植物的基
因，能够产生与宿主植物相同或相似的药用活性
成分，并具有多种生理活性。本实验对甘肃乌拉尔
甘草野生与栽培品内生菌进行分离与鉴定，从内
生菌菌属和优势菌种的角度探讨其宿主植物活性
成分的差异。
1 材料与仪器
1. 1 材料
1. 1. 1 药物 野生乌拉尔甘草Glycyrrhiza uralensis
Fisch.栽培乌拉尔甘草于2011年5月采于甘肃
省酒泉市金塔县(经甘肃中医学院中药鉴定教研
室鉴定为正品)。将新鲜的野生与栽培甘草的根部
泥沙清理掉，用保鲜膜分开包装，4℃保存。
1. 1. 2 培养基 PDA固体培养基：马铃薯200g，
葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，水 1 000 mL，pH 值自然，
121℃灭菌30分钟；NA固体培养基：牛肉浸膏3g，
甘肃乌拉尔甘草野生与
栽培品内生菌的分离及鉴定 *
邓 毅 1，王 艳 1，丁仁伟 1，杨志军 1，张艳萍 2△
1甘肃中医学院，甘肃兰州 730000；2甘肃中医学院附属医院
［摘 要］目的：通过对甘肃乌拉尔甘草野生与栽培品内生菌的分离，对甘草同属不同品种内生菌的优势菌
种进行初步鉴定，比较二者的生理活性差异。方法：采用 NA、PDA培养基对甘草野生与栽培品内生菌进行分
离和纯化，并以分离频率比较判断各自优势菌种。结果：野生甘草分离到内生细菌 65株，内生真菌 7株，优势
菌种为青霉菌属和曲霉属；栽培甘草分离到内生细菌 54株，内生真菌 6株，优势菌种为青霉菌属；野生与栽培
甘草的内生真菌分属于 6个属，相同的有 5个属，不同的 2个属为丝核菌属和木霉属。结论：野生与栽培甘草
具有相趋同数量和种类的内生细菌与内生真菌，但二者内生真菌的菌属及优势菌种存在明显差异。
［关键词］甘肃；乌拉尔甘草；野生栽培；内生细菌；内生真菌；分离纯化；种类鉴定
［中图分类号］R282.7 ［文献标识码］A ［文章编号］1004-6852(2012)11-0008-04
Identification and Separation of Endophytes
in Wild and Cultivated Glycyrrhiza Uralensis from Gansu Province
DENG Yi1, WANG Yan1, DING Ren-wei1, YANG Zhi-jun1, ZHANG Yan-ping2△
1 Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China;
2 University Hospital of Gansu Traditional Chinese Medicine
AbstractObjective: To compare the differences of biological activity between wild and cultivated glycyrrhiza
uralensis through the isolation of endophytes and identification on dominant bacteria from endophytes of different
species in the same genera. Method: Endophytes from wild and cultivated GanCao were isolated and purified with
NA and PDA base. The dominant bacteria were compared and judged with frequency separation. Result: All 65
strains of endophytic bacteria and seven strains of endophytic fungi were isolated from wild GanCao, the dominant
bacteria were penicillium spp and monillales; 54 strains of endophytic bacteria and six strains of endophytic fungi
were isolated from cultivated GanCao, the dominant bacteria were penicillium spp; endophytic fungi isolated from
wild and cultivated GanCao were in the six genera, there were five same genera, two different genera were rhizocto-
nia and trichoderma. Conclusion: Wild and cultivated GanCao have almost the same amount and kinds of endophytic
bacteria and fungi, but there exists remarkable difference in genera and dominant bacteria of endophtic fungi in both.
KeywordsGansu; Glycyrrhiza Uralensis; wild cultivation; endophytic bacteria; endophytic fungi; isolation
and purification; species identification
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2. 2 甘草内生真菌的分离与纯化 采用组织块
分离法，在无菌操作台上，将甘草根消毒后，用消
毒解剖刀切成约0.5cm×0.5cm的小块，按照十字
交叉原则，在每个PDA固体培养基各放置5块，然
后置于光照培养箱25℃下培养7天。待组织断面
边缘有菌丝生长后，采用挑取法挑取菌落边缘菌
丝转入新的PDA培养基中，待其长成菌落后，再挑
取边缘菌丝，如此反复直到获得纯化菌株后，分别
保存于PDA试管斜面培养基中，4℃备用。野生甘
草内生真菌编号分别为 JTYF-001、JTYF-002、
JTYF-003……栽培甘草内生真菌编号分别为
JTZF-001、JTZF-002、JTZF-003……。
2. 3 甘草内生细菌的分离与纯化 采用菌液涂
抹分离法，无菌操作台上，将“2.2”项剩余甘草组
织切碎，于灭菌研钵中加3 mL无菌水反复研磨，
用微量移液枪吸取1mL研磨液，移至试管中，加9 mL
无菌水，混匀，后用微量移液枪再从该试管中吸取
1 mL，移至另一试管中，加9 mL无菌水，如此反复
将菌液依次稀释成 1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、
1×10-55 个稀释度，做好标记，然后用三角玻璃棒
将其涂抹于NA培养基中，每个稀释度重复3次。
在光照培养箱28℃下培养4天，待培养基上长出
菌种后，挑取菌落，经划线法反复纯化菌株，后分
别保存于NA试管斜面培养基中，4℃备用。野生甘
草内生细菌编号分别为 JTYB-001、JTYB-002、
JTYB-003……栽培甘草内生细菌编号分别为
JTZB-001、JTZB-002、JTZB-003……。
2. 4 甘草内生细菌的革兰氏染色反应 采用革
兰氏染色法，将分离到的内生细菌于NA斜面培养
基活化培养48小时后，按照以下步骤进行染色反
应。制片，用接种针挑去少许菌落，涂布在干净玻
片上1滴无菌水中，风干固定；初染，滴加结晶紫
染色1分钟，水洗；媒染，用碘液冲去残水，并用碘
液覆盖约1分钟，水洗；脱色，用滤纸吸去玻片上
的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加
95%乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水
洗；复染，用番红染液复染约2分钟，水洗，干燥，
镜检，菌体被染成紫色是革兰氏阳性菌(G+)，被染
成红色的为革兰氏阴性菌(G-)。
2. 5 甘草内生真菌的鉴定 将分离到的内生真
菌纯化后，挑取真菌菌株的尖端菌丝接种于PDA
培养基中进行活化培养，培养数日后根据各真菌
菌落的表面形态、大小、颜色、质地、生长速度及边
缘形态等宏观特征，并结合光学显微镜观察其孢
子形态、产孢结构、菌丝颜色及有无横隔等微观特征，
参照魏景超《真菌鉴定手册》［2］，将内生真菌归属。
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蛋白胨 8 g，琼脂粉 20 g，水 1 000 mL，pH 自然，
121℃灭菌30分钟。
1. 1. 3 主要试剂 3%NaClO(天津市净化材料精
细化工厂，批号：20100109)；0.1%升汞(安徽安特
生物化学有限公司，批号：20081112)；75%乙醇(安
徽安特生物化学有限公司，批号：20070707)；牛肉
浸膏(北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：
090504)；蛋白胨(天津市福辰化学试剂厂，批号：
20100911)；琼脂粉(国药集团化学试剂有限公司，
批号：101103)；葡萄糖(天津市福辰化学试剂厂，
批号：20101002)。
1. 2 主要仪器 LDZX-30FB 立体压力蒸汽灭菌
锅(上海申安医疗器械厂生产)；SW-1F-CJ无菌操
作台 (上海新苗医疗器械制造有限公司生产)；
SPX-250-GB光照培养箱(上海新苗医疗器械制造
有限公司生产)；BS224S电子分析天平(北京赛多
利斯仪器系统有限公司生产)；XS-213A 显微镜
(南京江南光电股份有限公司生产)；DCD-216YH
冰箱(青岛海尔股份有限公司生产)。
2 方法
2. 1 甘草表面消毒条件的筛选 将野生及栽培
甘草根截成5～6cm，清洗处理后，分别平均放置于
4个烧杯中，按表1中所示处理方法，分别取最后
1次无菌水冲洗液0.2mL涂布于NA固体培养基
上 28℃条件下培养3天，各平行做3次，无菌水
作为空白对照组，根据公式计算组织表面杀菌率，
观察各处理方式的杀菌效果。见表1。
组织表面杀菌率 =［(未消毒的组织表面细
菌数-消毒后的组织表面细菌数)/未消毒的组织
表面细菌数］×100%
表 1 甘草组织表面消毒条件的筛选
处理 1 处理 2 处理 3 处理 4
第 1步 无菌水冲洗 3%NaCl O浸泡 3分钟 3%NaCl O浸泡 3分钟 75%乙醇浸泡 3分钟
第 2步 75%乙醇浸泡 3分钟 0. 1%升汞浸泡 3分钟 0. 1%升汞浸泡 3分钟 0. 1%升汞浸泡 3分钟
第 3步 无菌水冲洗 75%乙醇 3分钟 无 无
第 4步 无 无 无 无
注：以上各步间均用无菌水清洗 5次。
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注：YG为野生甘草，ZG为栽培甘草。“＋”为革兰氏阳性菌，“－”为革兰氏阴性菌。采用 NA培养基，YG共 45皿，ZG共 45皿。
2. 6 优势菌种判断法 采用分离频率(isola-
tion frequency，IF)比较判断优势菌种。
分离频率IF=某一菌种的分离数
分离所用培养基数
×100%
3 结果
3. 1 甘草表面消毒条件的筛选 根据组织表面
杀菌率公式得出，处理1杀菌率约为66%，处理3、
4杀菌率接近94%，处理2的杀菌率达到100%。因
此本实验选用处理2的消毒方式(见表1)。
3. 2 野生和栽培甘草内生菌的分离及染色情况
3. 2. 1 甘草内生菌的分离 野生与栽培甘草的
内生菌经多次分离纯化，共得到内生菌132株，其
中内生细菌119株，内生真菌13株。内生菌种主
要以内生细菌为主，约占菌株分离总数的90.2%，
内生真菌约占菌株分离总数的9.8%，见表2。
表 2 野生与栽培甘草内生菌种分离情况
内生细菌 内生真菌
YG 65 7
ZG 54 6
Tot al 119 13
注：采用 PDA和 NA培养基，YG为野生甘草，ZG为栽培
甘草，YG共 90皿，ZG共 90皿。
3. 2. 2 甘草内生菌的染色及分离频率 野生甘
草分离得到内生细菌 65 株，G+34 株，占 52.3%，
G-31株，占47.7%。栽培甘草分离到内生细菌54株，
G+25株，占46.3%，G-29株，占53.7%。其中染色的
显微图片计数球状菌有32株，杆状菌87株，见表
3，图1—2。
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菌号 分离数 / YG G＋与 G－ 分离频率 / % 分离数 / ZG G＋与 G－ 分离频率 / %
B- 1 88 + 195. 6 61 + 135. 6
B- 2 33 + 73. 3 43 - 95. 6
B- 3 15 - 33. 3 1 - 2. 2
B- 4 10 - 22. 0 24 - 53. 3
B- 5 9 + 20. 0 25 + 55. 6
B- 6 8 - 17. 8 20 + 44. 4
B- 7 4 + 8. 9 4 - 8. 9
B- 8 1 + 2. 2 3 - 6. 7
B- 9 6 + 13. 3 14 + 31. 1
B- 10 9 - 20. 0 9 - 20. 0
B- 11 22 + 48. 9 5 + 11. 1
B- 12 2 + 4. 4 2 - 4. 4
B- 13 27 + 60. 0 1 - 2. 2
B- 14 2 - 4. 4 3 - 6. 7
B- 15 1 - 2. 2 4 + 8. 9
B- 16 26 - 57. 8 10 + 22. 2
B- 17 18 + 40. 0 2 - 4. 4
B- 18 17 + 37. 8 11 + 24. 4
B- 19 3 - 6. 7 9 + 20. 0
B- 20 12 + 26. 7 3 + 6. 7
B- 21 6 + 13. 3 1 - 2. 2
B- 22 6 - 13. 3 4 + 8. 9
B- 23 5 + 11. 1 10 + 22. 2
B- 24 1 + 2. 2 9 - 20. 0
B- 25 1 - 2. 2 6 - 13. 3
B- 26 63 + 140. 0 6 - 13. 3
B- 27 1 + 2. 2 3 - 6. 7
B- 28 4 + 8. 9 9 + 20. 0
B- 29 3 - 6. 7 10 - 22. 2
B- 30 36 - 80. 0 5 + 11. 1
B- 31 2 + 4. 4 29 - 64. 4
B- 32 6 - 13. 3 2 + 4. 4
表 3 野生及栽培甘草内生细菌革兰氏染色及分离频率
菌号 分离数 / YG G＋与 G－ 分离频率 / % 分离数 / ZG G＋与 G－ 分离频率 / %
B- 33 3 - 6. 7 27 + 60. 0
B- 34 1 - 2. 2 22 + 48. 9
B- 35 23 - 51. 1 4 - 8. 9
B- 36 17 + 37. 8 18 - 40. 0
B- 37 8 - 17. 8 37 - 82. 2
B- 38 27 + 60. 0 2 - 4. 4
B- 39 12 + 26. 7 33 + 73. 3
B- 40 3 - 6. 7 11 - 24. 4
B- 41 5 - 11. 1 4 + 8. 9
B- 42 16 + 35. 6 45 - 100. 0
B- 43 12 + 26. 7 2 - 4. 4
B- 44 9 + 20. 0 17 + 37. 8
B- 45 16 + 35. 6 1 - 2. 2
B- 46 26 - 57. 8 5 - 11. 1
B- 47 4 - 8. 9 3 - 6. 7
B- 48 19 + 42. 2 3 + 6. 7
B- 49 35 - 77. 8 75 + 166. 7
B- 50 3 - 6. 7 31 - 68. 9
B- 51 4 - 8. 9 2 + 4. 4
B- 52 20 + 44. 4 8 + 17. 8
B- 53 41 - 91. 1 36 - 80. 0
B- 54 21 + 46. 7 12 + 26. 7
B- 55 32 + 71. 1
B- 56 6 - 13. 3
B- 57 5 - 11. 1
B- 58 21 - 46. 7
B- 59 4 - 8. 9
B- 60 68 - 151. 1
B- 61 22 + 48. 9
B- 62 13 + 28. 9
B- 63 5 - 11. 1
B- 64 1 + 2. 2
B- 65 3 + 6. 7
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图 1 显示野生甘草的内生菌号 JTYB-001、
JTYB-026、JTYB-060的分离数及分离频率明显高
于其他菌株，为优势菌种。图2显示栽培甘草的内
生菌号JTZB-001、JTZB-049的分离数及分离频率
明显高于其他菌株，为优势菌株。
3. 3 甘草内生真菌鉴定结果 野生甘草的7株
内生真菌与栽培甘草的6株内生真菌分属于6个
属，相同的属为青霉菌属、镰刀菌属、根霉属、曲霉
属、毛霉属，不同的属为丝核菌属、木霉属；野生甘
草优势菌株为 F-001 和 F-006，分属于青霉菌属
和曲霉属，栽培甘草优势菌株为F-001，属于青霉
菌属，见表4—5。
表 4 野生及栽培甘草内生真菌的分离数及分离频率
真菌编号 野生甘草 分离数 / 个 分离频率 / % 栽培甘草 分离数 / 个 分离频率 / %
F- 001 曲霉属 Aspergillus 17 37. 8 青霉菌属 PeniTillium 20 44. 4
F- 002 青霉菌属 PeniTillium 2 4. 4 根霉属 Rhizopus 10 22. 2
F- 003 镰刀菌属 Fusarium 2 4. 4 镰刀菌属 Fusarium 3 6. 7
F- 004 根霉属 Rhizopus 23 17. 8 曲霉属 Aspergillus 10 31. 1
F- 005 丝核菌属 RhizoTtonia 1 2. 2 毛霉属 MuTor 14 22. 2
F- 006 青霉菌属 PeniTillium 8 51. 1 木霉属 TriThoderma 1 2. 2
F- 007 毛霉属 MuTor 9 20. 0
注：采用 PDA培养基，YG45皿，ZG45皿。
表 5 野生及栽培甘草优势内生真菌鉴定情况
真菌编号 属 形态特征 显微特征
JTYF- 001 青霉菌属 PeniTillium 菌丝先是白色，后来变为黄色，基质的 分生孢子梗单个地发生，在顶部附
颜色则随菌丝颜色的变化而发生变化。 近有分枝，如青霉状，末端生小梗。
JTZF- 001 青霉菌属 PeniTillium 同上。 同上。
JTYF- 006 曲霉属 Aspergillus 菌落黄色，基质为黄色。 分生孢子梗直立，单胞，球形，
小梗自整个表面放射。
4 讨论
植物内生菌的分离与培养受多种因素的影
响，本实验在设计时考虑到土壤或空气中细菌的
混入、培养基成分、组织液浓度、培养温度、染色反
应等因素的影响，且植物的生长环境、土壤条件、
生长年限等因素在一定程度上对实验结果也会产
生影响。饶小莉等［3］从乌拉尔甘草的根茎叶中分
离到98株内生细菌，采用平板对峙法筛选的6株
菌株对植物病原菌有明显体外拮抗活性。本实验
初步从甘肃野生乌拉尔甘草根中分离出65株内
生细菌，7株内生真菌，内生细菌和内生真菌的优
势菌种分别是 JTYB-001、JTYB-026、JTYB-060 和
JTYF-001、JTYF-006，内生真菌分属于 6 个属，内
生真菌优势菌属是青霉菌属和曲霉属；栽培乌
拉尔甘草根中分离出54株内生细菌，6株内生真
菌，内生细菌和内生真菌的优势菌种分别是
JTZB-001、JTZB-049 和 JTZF-001，内生真菌分属
于6个属，内生真菌优势菌属是青霉菌属；野生与
栽培甘草内生真菌的菌属及优势菌种存在明显差
异；二者菌种菌属的分离数与分离频率也存在差
异。因此从内生菌的角度初步说明宿主植物间活
性成分存在差异，其生理活性或药理作用也存在
程度上的差异。
参考文献
［1］丁仁伟，邓毅.药用植物内生菌活性成分及药效学研究进展
［J］.西部中医药，2012，25(3)：109-112.
［2］魏景超 .真菌鉴定手册［M］.上海：上海科技出版社，1979：
405-645.
［3］饶小莉，沈德龙，李俊，等.甘草内生细菌的分离及拮抗菌株
鉴定［J］.微生物学通报，2007，34(4)：700-704.
收稿日期：2012-04-27
*基金项目：甘肃省中医药管理局项目(编号 GZK-2010-9)
作者简介：邓毅(1964—)，男，硕士研究生导师，教授，中药学科
学术带头人。研究方向：中药学教学、中药性能与配伍应用及中药
不良反应的研究。
△通讯作者：张艳萍(1964—)，女，副主任技师。研究方向：心血
管疾病的中医药防治。
菌株号
分
离
频
率
/%
分
离
数
/
个
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