全 文 ：第 8 卷 第 2 期
1 , 9 2年 6 月
生 物 物 理 学 报 V o l . 8 N o .
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竹红菌乙素对小鼠腹水型
肝癌细胞的光敏杀伤作用
孙继 山 张 莉 乐加 昌 王 芙媛 及惠芬
(户国科学院上物物理听 , 北京 1。。 1 0 1 )
摘 要
研究了竹红菌乙素 (以下简称乙素 , I B ) 对小鼠腹水型肝癌细胞 ( A H ) 的杀伤作用 , 并初
步解释了其杀伤机理 。 实验证明乙素对 A H细胞杀伤与乙素浓度的平方根成正比 。 乙素杀伤细胞
的能力与竹红菌甲素 (以下简称甲素 , H A )相等 , 比血叶啦强 , 但比原外啦弱 . 电镜观察可见 :
损伤细胞的膜失去连续结构 , 线粒体 , 内质网等细胞器变形 , 最终导致细胞空泡化 。 此外 , 细
胞变形 , 表面微绒毛精细结构丧失 , 也是光敏损伤的主要特征 。 造成细胞死亡的原因包括 , 0 ,
0石和 · O H在内的活性氧 , 而 · O H主要由O王转换而未 。
关键词 : 竹红菌乙素 , 光敏化作用 , 小鼠肝癌细胞
引 言
竹红菌素是我国首先发现并用 于临床的花配类光敏化剂 。 乙素是其主要组份之一 , 它
的化学结构已经搞清 `” , 在光物理 、 光化学等方面也做了大量研究 `, , “ ’ 。 近年来我们实验
室对其生物学性质进行系统研究 , 现 已初步查明在溶液中光敏产生活性氧的种类和条件 ,
以红细胞膜为材料证明乙素可光敏损伤膜流动性 、 酶活力和钠通透性 。 但到 目 前 为 止 ,
乙素对活细胞的光敏损伤尚未见报道 。 在 另一篇文章中已较详细地介绍了小鼠腹水型肝癌
细胞 ( A H ) 摄取和滞溜 乙素过程 (待发表 ) , 该篇则重点讨论 乙素对该细胞的杀伤及其机
理 。
材料和方法
( 1 ) 甲素 (H )A 粗品由云南微生物所提供 , 经薄层层析 , 丙酮重结晶纯化后备用 , 乙
素 (H )B 由纯化甲素在碱性条件下转化 , 再经分离纯化 “ ’ , ` H一N M R检验确认。 原叶琳 ,
血 p卜琳 , 2 , 2 , 6 , 6一四甲基呢咤氮氧自由基 ( T EM P O ) 均为 S i g m a公司产品 , 5 , 5一二
甲基一 1一毗咯琳一 N 一氧化物 ( D M p o ) 为 A l d r i e h 产品 , 超氧化物歧化酶 ( S O D ) , 过
氧化氢酶为上海东风生化试剂厂产品 , 其余均为国产分析纯试剂 。
( 2 ) A H细胞由接种 6一 10 天的小鼠腹水中抽取 , 经磷酸缓冲液 ( s m m ol / L磷酸盐 , 0 . 15
m ol / L氯化钠 , PH 7 . 5) 洗涤数次 , 除去少量血细胞后 , 配感沁 、 10 “细胞 / lm 悬液 , 立 即使
用 。
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(3 )A H细胞对 乙素的摄取 :在 3x l o日细胞 /m l悬液中加入终浓度为 1 0一 s m o l /L的 H B, 在
规定的时间取出一部分 , 30 o o r Pm 离心 10 秒钟 , 取上清 , 由胶束增溶法 (另文发表 ) 测荧
荧光强度 。
( 4 )使用台盼兰染料排除法测定细胞存活 : 5 ; 。
( 5 )光照使用 自制钨灯光源 , 用截止滤光片滤去 4 o o n m 以下的紫外光 , 辐射强度为
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Z。 除变温试验外 , 其余试验均在室温下进行 。 所有敏化剂均溶于二甲基亚枫 中 ,
细胞悬 液中二甲基亚讽浓度不超过 0 . 5% 。
( 6 )使用 v ar i a n 一 E 1 09 E s R谱仪测自由基信号 , 消自旋和自旋捕捉方法详见前文 〔。 ’ 。
透射电镜和扫描电镜 样品均按常规方法制备 , 在 J E x 一 1。。 x 透射电镜和 SJ M 一 3 4 5C F扫描 电
镜做透射和扫描 电镜观察 。
结果和讨论
( 1) A H细胞对乙亲的振取
图 ( 1) 为在巧℃和 3 7℃两个温度下 A H细胞对 乙素摄取 的时间进程 , 其中 iF 为 1。一 s m ol /
L 乙素 , 也即摄取前悬液中乙素的荧光强度 , sF 为离心后上清液中乙素的荧光强度 。 以 sF /
iF 的对 数对 时间作图可见 : 在摄取初期基本呈线性下降 , 符合一级动力学模式 。 计算两条
曲线线性部分的斜率 , 15 ℃时为 0 . 1 0 8 m i n 一 ` , 37 ℃时为 0 . 5 02 m i f ’ 。
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( 2) 乙紊光敏杀伤 A H 细胞的时间进程
我们首先做了光照和 乙素单独对 A H细 胞存活影响的对照试验 。 结果表明光照对存活
没有影响 , 乙素 (包括溶剂二 甲亚枫 ) 有微弱影响 , 在下面计算存活率时通过对照将这一
影响扣除。 图 ( 2 ) 所示为依次递增一倍的四个浓度 乙素对 A H细胞的杀伤作用 , 采用半对
数座标绘图后可见存活曲线有一肩区和线性区 , 对四条曲线用叠代法模拟后求出 D 3 : 和 可
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第 2期 竹红菌乙素对小鼠腹水型肝癌细胞的光敏杀伤作用 23 7
的二甲亚巩也是 · OH的淬灭剂 , 在通常情况时应予以考虑 , 但本试验中所有被比较样品的
二甲亚矾含量相同 , 所以对结果不会有太大影响 。
为 了直接证实 乙素在细胞中光敏产生 。丁和 · o H , 我们采用消自旋和自旋捕捉 E s R方法
进行研究 。 还原剂 、 阴离子自由基和 O百均可使自旋化合物 T EM P o 还原 , 使其自旋消失 `’ “ · 川 。
图 ( 7) 所示为加光和不加光情况下 , 加在细胞悬液中 自旋探针 T EM P o 峰值 (M l 二 o ) 高度
的衰减情况 。 我们以前曾证明乙素阴 离子 自由基消自旋能力远低于其光敏产生的 o 百消 自
旋能力 。 所以由图 ( 7) 所示的加光后消自旋能力增强可能由 0 畜引起 。 另外 , 我们试图在细
胞悬液中加 DM P O直接捕捉 · o H , 但由于胞内还原物质作用 , 使测得的自旋信号很弱 。 考
虑到 乙素在细胞中主要聚集在膜内 , 所以我们将细胞超声破碎后 , 用提取膜作实验 , 结果
信号大大增强 , 自旋加合物四条峰的高度为 1 : 2 : 2 : 1 , 是典型的 D M P O / O H加合物 。 我们在
体系中加入 S O D和过氧化氢酶 , 信号下降 , 用同等量的热灭活酶替代有活性的酶 , 信号下
降幅度很小 , 说明 · O H可能来自0 百。 E S R图谱如图 ( 8) 所示 。
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参 考 文 献
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〔 2 〕 五振军 , 蒋丽金 , 张曼华 , 中国科学 ( B ) , 2 , z , 8。 , 2 1 3一 22 0
〔 3 〕 蒋丽金 , 科学通报 . 3 5 ( 2 2 ) , 29 3 , , 1 6 5 1一 1 6 9 0
〔 4 〕 赵开弘 , 蒋丽金 , 有机化学 , 第九期 , 19 89 , 2论一 2 5 4
( 5 〕 H . J . p h i l i P s , T i s s u e e u l t u : e , M e t h o d s a n d a P p l i e a t i o n s ,
o n s N e 贾 Y o r k . n d L o n d o n , A c a d e m i c P r e s s , 1 9 7 3 P P 4 0 6
〔 6 〕 z · Y . z h 一 n g , L . Y , z a n g a t e l . , s e i . c h i n a . 1 06 3一 10 7 1 ,
( 7 〕 孙继山 , 程龙生 ,生物物理学报 , 5 ( 1 ) , 1 0 5 5 , 5 5一。 i
〔 8 〕 A . 5 一m u n i , C . M . C r i s h n一 t a l . , F r e e R 。 d i e a l B i o l . M o d
〔9 〕 J . M o a n . A e t a . C h e m , S e a n d . , B , 3 4 , 1 0 5 0 , 5 1 8
〔10〕 T . A . D a h i一 W . K . M i a d e n , . n d D . E . H : r t m a n , P h o t o e h
〔1 1〕 B . H a , 11 , e l l , B i o e 五e 二 , J . , 1 6 7 , 1 9 7 0 3 1 7一 3 2 0
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本文于 1” 1年 6 月 2 6日收到